适用于多基因型的西瓜体细胞胚高效诱导及植株再生方法

摘要

本发明公开了适用于多基因型的西瓜体细胞胚高效诱导及植株再生方法，所述方法包括前处理、愈伤组织的诱导、体细胞胚的诱导、完整植株的形成、炼苗和移栽步骤。在前处理过程中，所用植物生长调节剂为浓度为0.01-0.1mg/L的TDZ；在愈伤组织的诱导和体细胞胚的诱导过程中，所用生长调节剂为6-BA和IAA，6-BA的浓度为2-4mg/L，IAA的浓度为0.01-0.5mg/L。本发明不仅适用于多基因型的西瓜体细胞诱导，还具有愈伤组织诱导率高、体细胞胚诱导率高、每外植体的体细胞胚数目多、实施步骤简单，实施条件不苛刻的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及适用于多基因型的西瓜体细胞胚高效诱导及植株再生方法。

背景技术

西瓜是一种重要的蔬菜作物，在世界10大果品中居第5 位，作为一种高产值的经济作物在世界各地被广泛种植。随着人民生活水平的提高，人们对西瓜种类和品质的要求越来越高，西瓜的育种目标也趋向于多元化的发展。但是传统的遗传育种存在种质资源匮乏，育种周期太长，后代表现出的遗传性状不稳定等不足；而通过离体培养、遗传转化等生物技术获得高产优质的品种已成为重要的植物育种手段之一。

离体培养下没有经过受精过程，但经过胚胎发生和胚胎发育过程所形成的类胚结构称为体细胞胚。体细胞胚不仅可为研究细胞分化、细胞全能性机理和人工种子提高理想实验体系和技术基础，还具有可长期保存、遗传稳定性高、再生频率高的优点，同时还利于突变体的选择，还可作为制备原生质体的材料。具体的，经体细胞胚途径再生植株对于西瓜的快速繁殖、种质资源的保存、优良性状的培育以及基因工程受体系统的优化等都具有十分重要的理论意义和应用价值。

然而，现有技术中关于西瓜体细胞胚诱导及植株再生的成功报道却很少，且不同西瓜品种的组培条件差异极为显著，成功的报道可重复性很低，且只能针对一到两个基因型。1993年Compton和Gray用西瓜幼胚子叶为外植体成功诱导了体细胞胚再生，诱导率最高只有7%左右，且不同基因型之间的差异很大，之后牛姗姗(2006)和宋尚伟等(2007)以西瓜幼苗子叶为外植体，报道了最高25%和27.5%的体细胞胚诱导率，而诱导所得体细胞胚的质量和每外植体体细胞胚发生数量也均较低或者无据可查。在组织培养过程中，尤其重要的是培养基的选择及其激素的添加，这对于无菌苗的质量、愈伤组织的诱导及体细胞胚的发生具有重要的影响，是决定外植体体细胞胚发生和植株再生的关键环节。然而，不同培养基及激素在不同基因型上的表现具有很大差异性，现有技术仍未找到一种适用于多基因型的西瓜体细胞胚高效诱导及植株再生方法。

因此，建立一个适用于多基因型的西瓜高频体细胞胚发生及植株再生方法，具有重大意义，可为西瓜的优良育种及转基因研究等其它相关方面研究提供良好的受体再生系统。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种适用于多基因型的西瓜高频体细胞胚发生及植株再生方法。该方法包括以下步骤：

    1）前处理：将西瓜种子剥去种皮后进行灭菌，再将种胚接种在含TDZ的MS培养基进行培养，每瓶接种8粒，接种后先置于黑暗条件下培养3 d，培养温度为23-27℃，再转移到光照时间为16 h/d的条件培养3 d，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，TDZ的浓度为0-0.1 mg/L，培养基中添加30 g/L的蔗糖和6.0 g/L的琼脂，pH值调至6；

    2）愈伤组织的诱导：切取子叶外植体，放入含6-BA和 IAA的1/2 MS培养基中，先置于黑暗条件下培养7 d，再转移到光照时间为16 h/d的条件培养14 d，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，6-BA的浓度为2-4mg/L，IAA的浓度为0.01-0.5mg/L，培养基中添加30 g/L的蔗糖和6.0 g/L的琼脂，pH值调至6；

    3）体细胞胚的诱导：将步骤2）所得愈伤组织放入含6-BA和 IAA的1/2 MS培养基中，在光照时间为16 h/d的条件培养28 d获得体细胞胚，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，6-BA的浓度为2-4mg/L，IAA的浓度为0.01-0.5mg/L，培养基中添加30 g/L的蔗糖和6.0 g/L的琼脂，pH值调至6；

    4）完整植株的形成：将步骤3）所得的体细胞胚放入无激素的装有1/2 MS培养基的培养瓶中进行培养，培养时间为28 d，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/d，培养基中添加30 g/L的蔗糖和6.0 g/L的琼脂，pH值调至6；

    5）炼苗：选取经步骤4）培养后的具有3个以上叶片和5-6 cm强直根的健壮小苗，将培养瓶的盖子先拧松放置2 d，再半开2 d，然后再全开2 d，半开和全开盖子期间需要不断补充水分；

6）移栽：将炼苗完成后的植株拔起，用水洗净根部培养基，移栽到装有泥炭土、珍珠岩、草木灰和腐叶土基质的营养钵中，在23-27℃下，套上保鲜袋置于人工气候箱中保湿培养，1-2周后再移到室外进行培养。

所述的灭菌过程为：剥去西瓜种子的种皮，先用75%的酒精浸泡消毒1min，再用0.1%升汞浸泡消毒5min，最后用无菌水冲洗5次。

所述营养钵中泥炭土、珍珠岩、草木灰和腐叶土基质的质量比为1:1:1:1。

优选的，步骤1）中的TDZ浓度为0.01mg/L。当TDZ的浓度为0.01mg/L时，可以获得最理想的体细胞胚诱导率和每外植体所产生的体细胞胚数。

优选的，步骤2）和步骤3）中的6-BA的浓度为3mg/L，IAA的浓度为0.05mg/L。当IAA的浓度为0.05mg/L时，体细胞胚诱导率和每外植体上体细胞胚数量达到最优。

本发明具有如下有益效果：

1、适用于多基因型的西瓜体细胞胚诱导；

2、愈伤组织诱导率高、体细胞胚诱导率高、每外植体的体细胞胚数目多；

3、实施步骤简单，实施条件不苛刻。

附图说明

图1：西瓜子叶上诱导出的愈伤组织；

图2：愈伤组织上产生的体细胞胚；

图3：体细胞胚出芽；

图4：体细胞胚生根；

图5：再生苗；

图6：移栽苗。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

选取大小均匀、饱满的西瓜种子，在超净工作台上剥去种皮，先用75%的酒精浸泡消毒1min，再用0.1%升汞浸泡消毒6min，然后用无菌水冲洗5次，然后置于培养皿内的无菌滤纸上，用消毒后的镊子将种胚接种在含TDZ的MS培养基进行培养，每瓶接种8粒。接种后先置于黑暗条件下培养3 d，再转移到16 h/d光周期条件培养3 d，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，TDZ的浓度为0-0.1 mg/L，培养基中添加蔗糖30 g/L，琼脂6.0 g/L，pH值调至6。诱导时，设三组实验组，第一组中6-BA的浓度为2.0mg/，IAA的浓度为0.01mg/L；第二组中6-BA的浓度为4.0mg/L，IAA的浓度为0.5mg/L；第三组中6-BA的浓度为3.0mg/L，IAA的浓度为0.1mg/L；实验结果取三组实验结果平均值。

TDZ前处理对愈伤组织及体细胞胚诱导的影响见表1。

由表1可以看出，用0-0.1 mg/L TDZ进行前处理时，愈伤组织诱导率没有显著差异。但是，TDZ对体细胞胚诱导率和每个外植体所产生的体细胞胚数有显著的影响。体细胞胚诱导率以TDZ浓度为0.01 mg/L时达最大值，为52.7%，当TDZ浓度上升到0.1 mg/L时，体细胞胚诱导率又下降。每个外植体所产生的体细胞胚数也以TDZ浓度为0.01 mg/L时达最大值，为7.3个。综上，添加0.01 mg/L 的TDZ，可以获得最理想的体细胞胚诱导率和每外植体所产生的体细胞胚数。

实施例2

前处理时TDZ的浓度为0.01mg/L，经前处理后，切取子叶外植体，放入含6-BA和 IAA的1/2 MS培养基进行培养，先置于黑暗条件下培养7 d，再转移到16 h/d光周期条件培养14 d。然后将诱导所得的愈伤组织转入同样配方的新鲜培养基中，在16 h/d光周期条件继续培养28 d。培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，6-BA的浓度为2-4mg/L，IAA的浓度为0.01-0.5mg/L，培养基中添加蔗糖30 g/L，琼脂6.0 g/L，pH值调至6。

6-BA 和 IAA组合对愈伤组织及体细胞胚诱导的影响见表2。

    由表2可知不同浓度的6-BA和IAA诱导愈伤发生率有差异，但是差异不明显，整体都较高，在81.7 %以上。而体细胞胚发生率和质量因6-BA和IAA浓度不同而差异显著，诱导率从25.9-60.7%不等，每外植体上体细胞胚数量从3.2-8.3个不等。当IAA浓度一定时，随着6-BA浓度的增加，愈伤诱导率逐渐缓慢下降，但体细胞胚诱导率和每外植体上体细胞胚数量呈上升趋势，6-BA浓度为3.0 mg/L时体细胞胚诱导率达到最大值，每外植体上体细胞胚数量也达到最多。而当6-BA浓度一定时，随着IAA浓度的升高，体细胞胚诱导率呈下降趋势，最高体细胞胚诱导率出现在IAA 0.05 mg/L时。当6-BA 浓度为3.0 mg/L，IAA浓度为0.05 mg/L时，体细胞胚诱导率和每外植体上体细胞胚数量达到最优。

实施例3

完整植株的形成：将体细胞胚放入无激素的1/2 MS培养基进行培养，培养时间为28天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，培养基中添加蔗糖15 g/L，琼脂6.0 g/L，pH值调至6。如说明书附图3和附图4所示，本发明提供的方法能使得体细胞胚形成完整的植株。

实施例4

炼苗和移栽：经过前处理、愈伤组织诱导、体细胞胚诱导和完整植株的形成步骤后，在无激素的装有1/2 MS培养基的培养瓶中，选取所形成的完整植株中具有3个以上叶片和5-6 cm强直根的健壮小苗，将培养瓶的盖子先拧松放置2 d，再半开2 d，然后再全开2 d，半开和全开盖子期间需要不断补充水分。然后，将炼苗完成后的植株拔起，用水洗净根部培养基，移栽到装有泥炭土、珍珠岩、草木灰和腐叶土基质的营养钵中，在23-27℃下，套上保鲜袋置于人工气候箱中保湿培养，1-2周后再移到室外进行培养。泥炭土、珍珠岩、草木灰和腐叶土基质的质量比为1:1:1:1。炼苗和移栽的效果分别见说明书附图5和附图6。

实施例5

分别取早佳、特小凤、京欣和早春红玉四个基因型西瓜种子进行体细胞胚的诱导。前处理中过程为：将西瓜种子剥去种皮后进行灭菌，再将种胚接种在含TDZ的MS培养基进行培养，每瓶接种8粒，接种后先置于黑暗条件下培养3 d，培养温度为23-27℃，再转移到光照时间为16 h/d的条件培养3 d，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，TDZ的浓度为0.01 mg/L，培养基中添加30 g/L的蔗糖和6.0 g/L的琼脂，pH值调至6TDZ的浓度为3mg/L；愈伤组织和体细胞胚诱导时，切取子叶外植体，放入含6-BA和 IAA的1/2 MS培养基进行培养，先置于黑暗条件下培养7 d，再转移到16 h/d光周期条件培养14 d；然后将诱导所得的愈伤组织转入同样配方的新鲜培养基中，在16 h/d光周期条件继续培养28 d。培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，6-BA的浓度为3mg/L，IAA的浓度为0.05mg/L，培养基中添加蔗糖30 g/L，琼脂6.0 g/L，pH值调至6。

 基因型对愈伤组织及体细胞胚诱导的影响见表3。

    由表3可以看出，本发明提供的方法对不同基因型都可以成功诱导出体细胞胚，且体胚诱导率在45%以上，每外植体上诱导形成的体胚数在7.6-8.5个之间。表3中各种基因型利用该技术体系都可以作为转基因的受体再生系统。