重编程效应蛋白相互作用以纠正癌症中的表观遗传缺陷

摘要

本发明提供了“重编程”表观遗传性标记阅读器或清除器从而识别表观遗传标记而不是它们的内源性(或天然的)标记的方法。重编程阅读器或清除器可以抵消异常的记录器活性(例如，功能缺失或过度活跃)的影响，所述异常的记录器活性可以促进某些疾病状态，诸如癌症。也提供了经这些方法鉴定的重编程的化合物在此类疾病状态的治疗中的用途。可以受这些方法靶向的示例性标记阅读器包括BPTF和CBX2。

说明书

发明领域

本发明涉及治疗领域，尤其是，关于小分子化合物的方法、系统以 及测定，从而间接地纠正致癌性功能障碍和组蛋白修饰基因中的突变， 用于治疗癌症或由表观遗传性失调导致的其他病症。

发明背景

表观遗传机制和基因调节途径的破坏在一系列包括癌症在内的重要 疾病状态中发挥了重要的作用(Mai&Altucci,2009,Int.J.Biochem.Cell  Biol.41:199-213)。

在非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)中对体细胞突变的全基因组筛选已显示 了参与基因表达的表观遗传调节的基因/蛋白中突变的高发。已发现在甲 基转移酶蛋白EZH2中反复发生的体细胞突变很可能通过增加组成型蛋 白PRC2的活性促进了NHL的发展。EZH2为催化组蛋白H3赖氨酸27 三甲基化(H3K27me3)的组蛋白标记“记录器”。带有EZH2突变的NHL肿 瘤已显示了PRC2在组蛋白H3K27三甲基化中增加的活性，这导致增加 的基因表达抑制和肿瘤形成(Morin等,2010,Nat.Genet.,42(2):181-185)。

EZH2的过度活跃和/或过表达也与许多其他癌症有关，包括乳腺癌、 肺癌、前列腺癌(尤其是晚期前列腺癌)、多发性骨髓瘤以及神经系统癌症。 在许多情况下，EZH2的过度活跃和/或过表达与这些癌症的侵润性或耐 药性形成有关。通过蛋白CBX2阅读H3K27me3标记。

甲基转移酶MLL2记录活化的组蛋白标记。通过阅读器蛋白BPTF 解读这种组蛋白修饰。MLL2中的突变通常也存在于非霍奇金氏淋巴瘤 中，在32％DLBCL病例和89％滤泡性淋巴瘤中可观察到该突变(Morin 等,2011,Nature 476:298-303)。这些肿瘤中MLL2的突变谱完全地与功能 缺失一致。MLL2参与构建活化标记H3K4me3(Yap等,2011,Blood 117:2451-2459；Sneeringer等,2010,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107:20980-20985)，并且这种能力缺失维持了细胞处于增殖状态，不是通 过转录程序的抑制，而是通过细胞不能激活促分化转录程序。还已在胃 腺癌、白血病、膀胱癌以及结肠直肠癌中发现MLL基因中的突变(Gui,等, 2011,Nat.Genet.43:875-878；Watanabe等,2011,PLoS One 6:e23320； Ziemin-van der Poe等,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88:10735-10739)。

已经通过在蛋白的PHD指状结构域中基因工程改造单一的酪氨酸为 谷氨酸取代基来调控BPTF阅读三甲基化H3K4的能力，导致了在H3K4 背景中结合倾向由三甲基转为二甲基-赖氨酸(Li等,2007,Molecular Cell, 28:677-691)。

已报道了组蛋白标记阅读器结合的抑制或破坏可作为治疗包括癌症 的疾病的方法。尤其是已经靶向于组蛋白脱甲基酶用于抑制(参见Rotili &Mai,2011,Genes&Cancer,2:663-679；国际专利申请公开 WO2012/071469)。

国际专利申请公开WO2011/143669描述了用于破坏溴结构域和带有 乙酰-赖氨酸修饰的末端外(BET)族蛋白与组蛋白N末端尾之间的相互作 用的化合物和方法。特别地，化合物抑制BET族蛋白与乙酰赖氨酸的结 合。也描述了该化合物用于治疗癌症和炎症性疾病的用途。

国际专利申请公开WO2012/123119描述了应用生物素和链霉亲和素 的体外方法，其允许鉴定与组蛋白尾相互作用的蛋白和与此类蛋白相互 作用的化合物。

国际专利申请公开WO2012/116170描述了抑制CREB结合蛋白(CBP) 的溴结构域的乙酰赖氨酸结合活性的化合物。

这些背景信息的提供，其目的在于使得申请人认为已知的信息与本 发明可能相关。但不应将前述信息的任何部分理解为或解释为针对本发 明的现有技术。

发明简述

本发明广泛地涉及重编程效应器蛋白相互作用以纠正癌症中表观遗 传缺陷的方法。

在一方面，本发明涉及用于鉴定调控组蛋白标记阅读器蛋白与组蛋 白尾之间的结合的候选化合物的方法，所述方法包括：(a)计算地产生与 靶组蛋白尾标记复合的阅读器蛋白的激活位点的结构模型，所述结构模 型基于与靶组蛋白尾标记同源的组蛋白尾标记复合的阅读器蛋白的激 活位点的计算模型；(b)鉴定阅读器蛋白的激活位点中用于结合靶组蛋 白尾标记所需的一种或多种功能特性；以及(c)筛选候选化合物以鉴定 与激活位点和靶组蛋白尾标记中的残基在一起的那些化合物，基本上 重现步骤(b)中所鉴定的功能特性。

在另一方面，本发明涉及用于鉴定调控组蛋白甲基化标记阅读器蛋 白与甲基化组蛋白尾之间的结合的候选化合物的方法，所述方法包括： (a)计算地产生与靶甲基化组蛋白尾标记复合的阅读器蛋白的激活位点的 结构模型，所述结构模型基于与靶组蛋白尾标记同源的甲基化组蛋白尾 标记复合的阅读器蛋白的激活位点的计算模型；(b)鉴定阅读器蛋白的激 活位点中用于结合靶甲基化组蛋白尾标记所需的一种或多种功能特性； 以及(c)筛选候选化合物以鉴定与激活位点和靶甲基化组蛋白尾标记中的 残基在一起的那些化合物，基本上重现步骤(b)中所鉴定的功能特性。

在另一方面，本发明涉及通式I的化合物在增加BPTF与组蛋白3 的单-或双-甲基化的赖氨酸4的结合中的用途：

其中：

X为C＝O或S(O)₂，

R₁为H、C₁-C₄烷基或C₁-C₄烷氧基，

R₂为H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基或卤素，并且R₃为H，或R₂和 R₃与它们所连接的C原子一起形成或

R₄为H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基或卤素，

R₅为H、CH₂NMe₂或以及

R₆为H，并且R₇为H，或R₆与R₇一起形成＝CH₂，

其中当R₅为H并且R₆与R₇一起形成＝CH₂时，X为S(O)₂，并且其 中当R₄为C₁烷基，R₅为CH₂NMe₂，并且R₆与R₇一起形成＝CH₂时，则 R₁、R₂和R₃中的至少一个不是H；

或

(b)X为NH₂，

R₁和R₂为H，

R₃和R₄与它们所连接的C原子一起形成：或

R₅为取代的C₁-C₄烷基或未取代的C₂-C₄烷基，其中每一取代基为卤 素，以及

R₆与R₇一起形成＝O。

在另一方面，本发明涉及以上所定义的通式I的化合物在制备用于增 加BPTF与组蛋白3的单-或二甲基化赖氨酸4之间的结合中的用途。

在另一方面，本发明涉及以上所定义的通式I的化合物，其用于增加 BPTF与组蛋白3的单-或二甲基化赖氨酸4之间的结合。

在另一方面，本发明涉及增加BPTF与组蛋白3的单-或二甲基化赖 氨酸4之间的结合的方法，其包括将BPTF与以上所定义的通式I的化合 物接触。

在另一方面，本发明涉及以上所定义的通式I的化合物在治疗癌症中 的用途。

在另一方面，本发明涉及以上所定义的通式I的化合物在制备用于治 疗癌症的药物中的用途。

在另一方面，本发明涉及以上所定义的通式I的化合物，其用于癌症 治疗。

在另一方面，本发明涉及在个体中治疗癌症的方法，其包括给予个 体以上所定义的通式I的化合物。

在另一方面，本发明涉及选自以下的化合物的用途：

和

在另一方面，本发明涉及选自以上所定义的组的化合物在制备用于 增加BPTF与组蛋白3的单-或双-甲基化的赖氨酸4之间的结合的药物 中的用途。

在另一方面，本发明涉及选自以上所定义的组的化合物，其用于增 加BPTF与组蛋白3的单-或双-甲基化的赖氨酸4之间的结合。

在另一方面，本发明涉及增加BPTF与组蛋白3的单-或二甲基化赖 氨酸4之间的结合的方法，其包括将BPTF与选自以上所定义的组的化 合物接触。

在另一方面，本发明涉及选自以上所定义的组的化合物在治疗癌症 中的用途。

在另一方面，本发明涉及选自以上所定义的组的化合物在制备用于 治疗癌症的药物中的用途。

在另一方面，本发明涉及选自以上所定义的组的化合物，其用于治 疗癌症。

附图简述

本发明的这些和其他特性在下面涉及附图的详细的描述中将变得更 加明显。

图1显示了BPTF、化合物2和H3K4me1肽的“三体重编程复合体” 的模型。

图2显示了研究(A)针对MLL2纯合子插入缺失突变细胞系 SU-DHL-9和Pfeiffer的化合物1-3的活性，以及(B)SU-DHL-9和Pfeiffer 细胞系中化合物3抑制活性的依赖浓度的实验结果。

图3显示了证明靶向BPTF的化合物2和3的细胞毒性效应的特异 性的实验结果，(A)不同淋巴瘤细胞系中化合物3的细胞毒性，(B)两种 MLL2突变细胞系中化合物3的剂量应答以及(C)MLL2突变细胞系中化 合物2的剂量应答。

图4显示了用于评估与实施例5中应用的H3K4甲基化尾相互作用 的BPTF洗脱测定(pull down assay)的通常模式。这一模式描述了将稳定 H3K4mel的结合并且在空间上阻碍H3K4me3结合的化合物。

图5显示了免疫印迹，其为在(A)化合物3和(B)化合物2存在或不存 在的情况下H3K4与BPTF结合的洗脱测定的结果。

图6显示了在小鼠移植瘤模型中化合物2和3的体内测试结果，使 用小鼠移植瘤模型中的SU-DHL-9(MLL2突变的)细胞系，经过9天时期 的肿瘤增加后，(A)化合物3和(B)化合物2显示了减少。

图7显示了在化合物50(NSC112372)存在的情况下测定各种淋巴瘤 细胞系的细胞活力的体外测定的结果；DoHH-2：对EZH2、MEF2B和 MLL2而言野生型；WSU-DLCL2:EZH2突变Y641F(对MEF2B和MLL2 而言野生型)；DB:EZH2突变Y641F，MEF2B突变D83V和MLL2中三 种突变。

图8显示了来自移植瘤实验的结果，使用WSU-DLCL2人弥漫大细 胞淋巴瘤细胞系，其中用载体，1mg/kg或4mg/kg化合物50处理小鼠(在 对照与4mg/kg组之间p＝0.0047)。

图9显示了在化合物51(NSC2450)存在的情况下测定各种淋巴瘤细 胞系(如图1中的细胞系；SU-DHL-9:EZH2野生型，MEF2B野生型， MLL2插入缺失)的细胞活力的体外测定的结果。

图10显示了来自移植瘤实验的结果，使用WSU-DLCL2人弥漫大细 胞淋巴瘤细胞系，其中用载体，或4mg/kg化合物51处理小鼠5天随后 再用2mg/kg处理5天(p＝0.0125)。

图11显示了在化合物50或化合物51存在的情况下测定各种乳腺癌 细胞系的细胞活力的体外测定的结果。

图12显示了CBX2、CBX2重编程化合物和H3K4mel肽的“三体重 编程复合体”的模型。

发明详述

本发明广泛地涉及“重编程”表观遗传标记阅读器或消除器从而识别 表观遗传性标记而不是它们内源性(或天然的)标记的方法。重编程阅 读器或清除器可以抵消异常的记录器活性(例如，功能缺失或过度活跃) 的影响，所述异常的记录器活性可以促进某些疾病状态，诸如癌症。 因此经这些方法鉴定的重编程的化合物在此类疾病状态的治疗中具有 潜在的治疗应用。

因此，在广泛的方面，本发明涉及鉴定小分子化合物的方法，所述 小分子化合物修饰组蛋白标记“阅读器”对于由相应的“记录器”构建的它 们的相应组蛋白标记的亲和力和/或选择性。通过改变阅读器蛋白与组蛋 白上修饰的赖氨酸残基之间的相互作用，例如通过在组蛋白赖氨酸尾、 介于中间的小分子化合物和标记阅读器上赖氨酸尾结合袋之间的“三体 重编程复合体”的形成，可以有利地修改/改变通过标记阅读器下游转导的 组蛋白标记信号(例如，从而影响基因表达)。因此，以这种方式鉴定的小 分子化合物通过在阅读器和修饰的赖氨酸残基之间引入新的结合相互作 用，从而调控由标记记录器构建的组蛋白(标记)上修饰的赖氨酸残基与标 记信号效应器蛋白(阅读器)之间结合的相互作用。该方法使用小分子化合 物以在组蛋白表观遗传标记和相应的标记阅读器之间引入新的结合相互 作用(重编程)，从而修饰某些组蛋白标记所转导的下游信号，该方法可应 用于各种表观遗传信号转导蛋白的记录器/阅读器对。对阅读器的底 物——组蛋白上赖氨酸残基的各种修饰状态而言，通过修改组蛋白标记 阅读器转导信号的方式，可以纠正或逆转致病的或异常的表观遗传标记 的有毒效应，从而有利地治疗其中已显示了某些记录器为突变的(引起标 记水平或类型的变化)并且这些突变的记录器为癌症驱动器(即促进或引 起癌症)的疾病状态，诸如癌症。

本发明的小分子组蛋白标记阅读器“重编程”化合物形成涉及组蛋白/ 赖氨酸尾、介于中间的化合物以及标记阅读器的赖氨酸尾结合袋的三体 “重编程复合体”，并且可被针对锚定结构的小分子“虚拟的”化合物文库的 计算筛选所鉴定，所述文库包括阅读器的修饰的赖氨酸尾结合袋和来自 组蛋白标记的赖氨酸尾中关键的结合残基。例如，小分子“重编程”化合 物在阅读器蛋白和包括表观遗传“标记”的组蛋白/赖氨酸尾之间引入新的 相互作用并且使得阅读器蛋白能够与赖氨酸尾结合，不管赖氨酸尾(标记) 修饰状态如何。取决于赖氨酸尾/标记的修饰(例如甲基化)状态，小分子 “重编程”化合物可增加或降低阅读器蛋白对特定的赖氨酸尾的亲和力/结 合。借助于以这种方法建立的新的相互作用，小分子“重编程”化合物可 改变标记阅读器对特定标记(例如，甲基化组蛋白赖氨酸残基)的底物特异 性。

在本发明的一方面，组蛋白标记阅读器为CBX2，其阅读被组蛋白标 记记录器EZH2甲基转移酶所构建的标记(PRC2蛋白复合体的组分)。 EZH2向组蛋白H3的赖氨酸残基27(H3K27)上添加甲基。通常，EZH2 随着基因活性抑制最终结果记录抑制标记。已知野生型EZH2的表达增 加(并且因此标记记录器活性)及EZH2中某些体内错义突变(包括但不限 于，酪氨酸残基641)修改H3K27处甲基标记的量或化合价(即，单、二- 或三甲基化)。EZH2中这些变化引起相对于正常状况增加的基因抑制， 并且已显示了致病的和与疾病有关。尤其是，对某些癌症类型而言，它 们很可能为致瘤的或驱动改变/突变。CBX2(PRC1蛋白复合体的组分)充 当针对EZH2甲基标记的效应器，并且对于正常功能中及其中EZH2表 达或活性改变的疾病状态中的EZH2，转导抑制的(或基因沉默)信号是必 不可少的。使用本文所述的方法，目前已鉴定了将与CBX2的甲基化赖 氨酸结合袋结合并且通过涉及CBX2、小分子化合物以及甲基化赖氨酸尾 的三体重编程复合体的形成改变CBX2对甲基化赖氨酸27(H3K27)的底 物特异性的小分子化合物(重编程的化合物)。这些小分子CBX2重编程化 合物显示在体外和体内具有针对淋巴瘤(带有Tyr-641突变)细胞和肿瘤的 抗癌活性。重编程针对EZH2的阅读器(CBX2)的这些小分子化合物的优 势为一般而言它们应为能够纠正引起疾病(在癌症情况下致瘤)的EZH2标 记变化的有效药物，不依赖于记录器(EZH2)中的干扰。因此这些化合物 应比直接靶向于EZH2蛋白或EZH2基因表达的其他化合物有优势。

在本发明的另一方面，组蛋白标记阅读器为BPTF，其阅读组蛋白标 记记录器MLL2甲基转移酶构建的标记。MLL2将甲基基团添加至组蛋 白H3的赖氨酸残基4(H3K4)。通常，MLL2活性和所得的甲基组蛋白标 记为激活的并且导致基因活性的增加。已知MLL2基因表达的降低或 MLL2的某些突变与疾病状态有关。尤其是，MLL2中功能缺失(LoF)突 变是非常频繁的并且很可能为非霍奇金氏淋巴瘤或其他癌症中致瘤的 “驱动”突变。对与在正常的和其中MLL2活性受到干扰的疾病状态中下 游的信号转导途径中的MLL2记录器蛋白有关的转导信号而言，BPTF为 至关重要的效应蛋白。使用本文所述的方法，目前已鉴定了能够改变 BPTF对对应于MLL2记录器的H3K4甲基标记的底物特异性的小分子重 编程化合物。已鉴定化合物，其形成化合物、H3K4标记以及BPTF中甲 基H3K4结合袋之间的“三体重编程复合体”并由此改变BPTF蛋白对 H3K4标记的底物特异性。这些方法所鉴定的BPTF重编程化合物能够克 服并且纠正MLL2蛋白中的干扰的致瘤效应，所述致瘤效应包括减少的 表达或在后面的功能缺失突变。这些化合物应为对淋巴瘤或突变的MLL2 或减少的MLL2表达所引起的其他癌症治疗有效的药物。BPTF重编程方 法和这种方法所发现的化合物的特定优势为这些是对于纠正有缺陷的表 观遗传调节和诸如涉及MLL2中功能缺失突变的淋巴瘤的疾病治疗而言 有效的药物，MLL2不可被小分子直接地可靶向的。

在本发明的某些方面，如本文所述的表观遗传标记阅读器的小分子 重编程对于涉及HMTs EZH2和MLL2的干扰或突变的疾病或病症是有 效的，所述疾病或病症包括但不限于癌症，例如淋巴瘤、肺癌、乳腺癌 以及神经系统癌症。

在本发明的另一实施方案中，可通过三体重编程的复合体的形成从 而改变底物特异性或甲基化标记阅读器对组蛋白中的甲基化氨基酸残基 的结合亲和力来鉴定对癌症或其他表观遗传调节(特别是组蛋白修饰)的 病症有用的小分子。

本发明的某些方面涉及本发明的方法应用于其他表观遗传标记的类 型/类别以及它们相应的记录器和阅读器，包括但不限于乙酰化。

本发明的另一方面涉及用于核实和确认本文所述的发明的方法所鉴 定的重编程化合物的生化结合测定，从而修改阅读器的底物特异性或对 各种组蛋白标记的结合亲和力。这一测定基于甲基化组蛋白赖氨酸残基 (标记)、标记阅读器甲基化赖氨酸结合袋以及介于中间的小分子重编程的 化合物之间形成的三体重编程复合体。结合测定测量在特定的重编程的 候选化合物存在或不存在的情况下相应的阅读器蛋白所“洗脱(pull  down)”的特定的组蛋白赖氨酸残基的甲基化状态。

本发明的某些方面涉及本发明的方法应用于表观遗传标记的其他类 型/种类和它们相应的记录器以及组蛋白标记“消除器”(即，脱甲基酶或脱 乙酰基酶)，所述“消除器”的生化功能为移除组蛋白标记(甲基或乙酰基)。 与消除器结合和/或相互作用从而抑制消除器活性的小分子化合物为用于 癌症治疗的候选药物，因为已知许多消除器蛋白在几种不同源型的癌症 中过表达。候选组蛋白标记消除器靶标蛋白的实例包括生化功能为从 H3K4(me2/1)甲基标记移除甲基残基的LSD1，生化功能为从H3K4(me3/2) 甲基标记移除甲基残基的PLU1，生化功能为从H3K9(me3/2)甲基标记移 除甲基残基的GASC1，以及其他其中可纠正或抵消MLL2中功能缺失突 变的致瘤效应的抑制的H3K4标记清除器。

本发明的另一方面涉及H3K4清除器(包括但不限于LSD1和PLU1) 抑制剂与小分子BPTF重编程化合物(如本文所述的)的组合，用于治疗癌 症或其他由于MLL2组蛋白甲基转移酶中功能缺失突变而导致的病症。

本发明的另一广泛的方面涉及MLL2蛋白功能的人工模拟，作为用 于非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)和其他癌症的治疗的疗法研发的方法。

本发明的某些方面涉及转录因子BPTF作为用于以下治疗的疗法研 发的靶标：非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，其中组蛋白甲基转移酶蛋白MLL2 具有LoF突变的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的生发中心B(GCB)亚 型，其中组蛋白甲基转移酶蛋白MLL2具有LoF突变的弥漫性大B细胞 淋巴瘤(DLBCL)的激活的B细胞样的(ABC)亚型，和/或伴有失活的MLL2 蛋白的癌症，其包括但不限于肺癌、乳腺癌和神经系统癌症。

本发明的某些方面涉及化合物NSC382001(化合物1)、NSC304107(化 合物2)、NSC127763(化合物3)等，包括但不限于本文表2、3和4中所 列举的那些，作为预计与BPTF蛋白相互作用或结合并因此改变BPTF对 组蛋白H3蛋白的赖氨酸4的甲基化形式的特异性的化合物。

本发明的某些方面涉及化合物NSC382001(化合物1)、NSC304107(化 合物2)、NSC127763(化合物3)等，包括但不限于本文表2、3和4中所 列举的那些，作为治疗NHL、ABC-DLBCL、GCB-DLBCL和/或其他伴 有低活化蛋白表达的癌症，包括但不限于肺癌、乳腺癌以及神经系统癌 症，的潜在制剂。

本发明的某些方面涉及化合物NSC382001(化合物1)、 NSC304107(化合物2)、NSC127763(化合物3)等，包括但不限于本文表2、 3和4中所列举的那些，作为治疗其中a)组蛋白甲基转移酶MLL2为突 变的，b)组蛋白甲基转移酶蛋白MLL2具有LoF突变而导致组蛋白H3 中赖氨酸4残基的减少的三甲基化，或c)MLL2蛋白具有相对于正常状 态或野生型活性低的NHL、ABC-DLBCL或GCB-DLBCL的潜在的新制 剂。

本发明的另一方面涉及BPTF相互作用/结合化合物(包括但不限于 NSC382001(化合物1)、NSC304107(化合物2)、NSC127763(化合物3) 等，包括但不限于本文表2、3和4中所列举的那些)，与与蛋白CBX2(例 如，本文表5中所示的那些)相互作用/结合的化合物组合，用于治疗其中 MLL2具有LoF突变和EZH2活性增加(通过突变或增加EZH2蛋白表达) 的癌症。实例包括但不限于NHL、ABC-DLBCL、GCB-DLBCL、滤泡性 淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌和神经系统癌症。

本发明的另一方面涉及化合物NSC382001(化合物1)、 NSC304107(化合物2)、NSC127763(化合物3)等，包括但不限于本文表2、 3和4中所列举的那些，与护理疗法(靶向的或非靶向的)或急救疗法组合 用于治疗伴有减少的MLL2蛋白活性(例如由LoF突变所引起的)的癌症， 其包括但不限于NHL、ABC-DLBCL、GCB-DLBCL、滤泡性淋巴瘤、肺 癌、乳腺癌、前列腺癌和神经系统癌症。在某些实施方案中，此类组合 还可包括与蛋白CBX2(例如本文表5中所示的那些)相互作用/结合的化 合物。

定义

除非另有定义，本文所用的所有科技的和科学的术语都具有如本发 明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。

如本文所用的，术语“大约”指给定值大约+/-10％变动。应理解的是 此类变动总是包括在本文所提供的任何给定的值中，无论它是否明确地 提及。

如本文所用的，术语“多个”意指多于一个，例如，两个或多个，三 个或多个，四个或多个等。

当本文所使用的“a(一)”或“an(一)”与术语“包括”连用时可指“一个”， 但是也可指“一个或多个”，“至少一个”，和“一个或多于一个”。

如本文所用的，术语“包括”、“具有”、“包括”和“包含”及其语法上的 变异，都是包含的或开放式的，并且不排除额外的、未列举的元素和/或 方法步骤。当本文使用术语“基本由……组成”与组合物、用途或方法连 接时，表示额外的元素和/或方法步骤可存在，但是那些附加物基本上不 影响所列举的组合物、方法或用途功能的方式。当本文使用术语“由…… 组成”与组合物、用途或方法连接时，排除额外的元素和/或方法步骤的存 在。在某些实施方案中，包含某些元素和/或步骤的本文所述的组合物、 用途或方法也可基本上由那些元素和/或步骤组成，并且在其他实施方案 中，由那些元素和/或步骤组成，无论这些实施方案是否明确地提及。

术语“疗法”和“治疗”，如本文中可交换地使用，指为了缓解有关的症 状、预防疾病的发展、或改变疾病的病理学而进行的干预。因此，在某 些实施方案中，术语疗法和治疗有最广义的使用，在各种实施方案中， 可包括一种或多种疾病的预防(预防治疗)、缓和、减少、和/或各种阶段 的治愈。因此需要疗法/治疗的那些可包括已经患病的那些及有患病倾向 的，或处于发展风险、疾病、病症或状况的那些和他们疾病待被预防的 那些。

如本文所用的术语“个体”和“患者”指需要治疗的动物。

如本文所用的术语“动物”指人类和非人类动物。

本发明的化合物，本发明的化合物“与一种或多种其它治疗制剂组 合”给药意图包括同时的(并行的)给药和依次给药。依次给药意图治疗制 剂和本发明的化合物的各种给药顺序，在由定义的时间段间隔向个体给 予本发明治疗制剂和化合物，可以是短的(例如大约几分钟)或延长的(例 如大约几天或几周)。

术语“C₁-C₄烷基”指1-4个碳原子的直链或支链的烷基。实例包括甲 基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基(叔丁基)。

术语“卤素”和“卤素”指氟、溴、氯和碘原子。

术语“C₁-C₄烷氧基”指-或基，其中R为C₁-C₄烷基。

靶蛋白

用于本发明的方法的合适的靶蛋白包括组蛋白标记阅读器和清除 器。实例包括，但不限于阅读器蛋白CBX2、BPTF、HP1、53BP1和 L3MBTL1以及属于氨基酸氧化酶的组蛋白Lys脱甲基酶(KDM)消除器蛋 白或包含诸如LSD1、PLU1和GASC1的蛋白家族的JmjC结构域。

在本发明的某些实施方案中，靶蛋白为组蛋白标记阅读器，诸如 CBX2、BPTF、HP1、53BP1或L3MBTL1。在一些实施方案中，靶蛋白 为组蛋白甲基化标记阅读器。

在某些实施方案中，靶蛋白为优选地识别组蛋白尾中的三甲基化赖 氨酸残基的组蛋白甲基化标记阅读器。此类阅读器蛋白的实例包括但不 限于BPTF、CBX2和HP1。

在某些实施方案中，靶蛋白为CBX2。还已知CBX2为染色体框同系 物2、MGC10561、细胞分裂周期有关的6、M33、染色体框同系物2(果 蝇属Pc类)、CDCA6、染色体框同系物2(Pc类同系物、果蝇属)、染色 体框蛋白同系物2、改性剂3和Pc类同系物。CBX2数据库标识符包括： UniProtKB/Swiss-Prot:CBX2_HUMAN、Q14781；HGNC:15521和Entrez  Gene:847332。

在某些实施方案中，靶蛋白为BPTF。还已知BPTF为溴结构域PHD 指状转录因子、FAC1、胚胎阿尔茨海默抗原、FALZ、NURF301、包含 溴结构域和PHD指状的转录因子,胚胎Alz-50克隆1蛋白和 OTTHUMP00000163084。BPTF数据库标识符包括：HGNC:3581；Entrez  Gene:2186；Ensembl:ENSG00000171634；OMIM:601819和UniProtKB: Q12830。

重编程方法

在某些方面，本发明涉及用于鉴定能够修改靶蛋白对它的同源组蛋 白标记的选择性的候选化合物(“重编程的化合物”)的计算方法。基于化合 物能够弥补某些当靶蛋白结合组成它的同源的组蛋白尾标记的修饰的氨 基酸残基时存在但是当残基的修饰状态不同时缺失的结合相互作用，鉴 定化合物。通常，方法包括在修饰的组蛋白赖氨酸尾、候选化合物和结 合赖氨酸尾的靶蛋白的激活位点中的关键残基之间产生“三体重编程的 复合体”。

虽然本文所述的重编程的方法作为与阅读器蛋白有关的实施方案， 本领域中技术人员应领会重编程也可应用于清除器蛋白并且因此本发明 的某些实施方案涉及重编程的清除器蛋白的方法。

在某些实施方案中，方法涉及计算地产生阅读器蛋白的激活位点与 阅读器为待被编程结合的非同源的组蛋白尾标记(“靶组蛋白尾标记”)复 合的结构模型。结构模型通常基于已知的与它的同源的组蛋白尾标记复 合的阅读器蛋白的激活位点的计算模型，其中已鉴定了一种或多种表征 在激活位点中与同源的组蛋白尾标记的功能特性。所谓“功能特性”意指 促进激活位点中同源的组蛋白标记结合或稳定的特性。此类特性可包括， 例如，某些诸如氢键，范德瓦尔斯相互作用，静电相互作用和/或疏水相 互作用的非共价相互作用的存在或缺失；某些诸如氢键供体，氢键受体， 疏水残基或基团，芳族残基或基团的基团的存在或缺失；诸如激活位点 中功能基团和/或同源的组蛋白标记之间的间距，脂肪链长度等的构象特 性。各种阅读器蛋白激活位点的计算模型可从公众可用的数据库获取， 诸如Rutgers，新泽西州立大学和加利福尼亚大学(圣迭戈)维护的Protein  DataBank。

然后与靶组蛋白尾标记复合的阅读器蛋白的激活位点的结构模型可 以用于鉴定一种或更多额外的阅读器蛋白的激活位点中的靶组蛋白尾标 记结合所必需的功能特性。例如，模型的检查r计算分析可提示为了稳定 阅读器蛋白的激活位点中的靶组蛋白标记，需要添加或移除额外的功能 特性，诸如氢键或疏水相互作用。候选重编程的化合物此类额外的功能 特性应允许阅读器激活位点中靶组蛋白标记的结合。

因为当与两分子的复合体相比较时三分子的复合体为内在地熵不利 的，最终包含修饰的组蛋白赖氨酸尾、候选化合物和激活位点中的关键 残基的三体重编程复合体导致与三分子复合体有关的熵缺失和由此得到 的自由能。例如，这可以通过使用一系列模板(“探针”)结构，所述模板选 择地非竞争性结合靶组蛋白标记并且可以反复地改善，同时总体上监控 系统行为，从而鉴定提供了最有能量稳定的三体重编程的复合体的探针 结构。

因此，在某些实施方案中，为鉴定适当的候选化合物，可产生为稳 定的三体重编程的复合体提供必备的功能特性的探针结构。例如，可通 过反复地改善使用的一系列探针结构产生探针结构，例如，分子动力学 模拟和/或光学检测从而鉴定合适地稳定的结构。激活位点中复合的最终 探针的结构随后可以用作鉴定候选化合物的基础。

例如，通过筛选化合物的虚拟库可鉴定候选化合物，诸如由以下提 供的那些虚拟库：Zinc Database,the National Cancer Institute’s Diversity  Set,the National Cancer Institute’s Open Chemical Repository,the  Chembridge Library DIVERSet,the Maybridge Library,来自Asinex的 Platinum Collection，和Natural Product Libraries。

对于筛选化合物的方法提供鉴定的功能特性的能力而言，本领域中 技术人员可获得用于筛选化学化合物的各种方法。例如，全过程可开始 于计算机屏幕上激活位点和探针结构的光学检测。然后将选择的化学化 合物定位于各种方向，或锚定在激活位点内以确定它们充分地复制探针 结构的功能特性。使用商购可获得的软件实现锚定，诸如Quanta(Accelrys, Inc.,Mad为on,WI),FlexX(TRIPOS,St.Lou为,Minn.)和DOCK。锚定后 可跟随能量最小化和带有标准的分子力场的分子动力学，诸如CHARMM 和AMBER(Accelrys,Inc.,Madison,WI)。其他本领域中已知的和/或商购 可获得的专业的计算机程序也可辅助选择候选化合物的过程。

可选地，可使用标准的计算方法从头合成产生提供适当的功能特性 的候选化合物。各种从头合成设计方法为本领域已知。

一旦设计或选择了化合物，如有必要就通过计算评估测试和优化化 合物与靶组蛋白标记和阅读器的激活位点相互作用的效率。本领域中可 获得专业的计算机软件用以评估化合物变形能和静电相互作用。为此类 用途设计的程序的实例包括：AMBER,QUANTA/CHARMM(Accelrys, Inc.,Mad为on,WI)等。

体外评估

随后可体外评估使用本文所述的重编程的方法所鉴定的候选化合 物，例如评估它们调控阅读器蛋白与靶组蛋白标记之间的结合的能力和/ 或在与它们相关的记录器蛋白的异常的活性有关的疾病状态(诸如癌症) 中的活性。

通过各种标准的体外技术，诸如表面等离子共振或荧光偏振，评估 候选化合物调控阅读器蛋白与靶组蛋白标记之间的结合的能力。

本发明的某些实施方案涉及使用“洗脱”测定来表征候选化合物与靶 标记的结合。此类测定的通常模式如它应用于BPTF显示于图4中并且 描述于实施例5中。简单地说，将BPTF的GST-标记的PHD指状-溴结 构域与候选化合物和通过肽上的生物素分子与链霉亲和素标记的免疫磁 珠连接的H3K4me0,me1,me2或me3肽一起孵育。用适当的缓冲液洗涤 后，从珠上洗脱结合的蛋白并且通过SDS-PAGE和任选地免疫印迹评估。 本领域中技术人员应领会的是这种测定可易于适合其他阅读器/清除器和 组蛋白标记。

可选地，诸如PerkinElmer研发的α技术的技术可用于评估候选化合 物调控阅读器与靶组蛋白标记之间的结合的能力。此类技术可以提供在 高通量基础上进行的此类评估。例如，α技术测定需要链霉亲和素结合的 α供体珠和与谷胱甘肽结合的α受体珠。可将阅读器的相互作用结构域克 隆到引入允许经由谷胱甘肽连接α受体珠的谷胱甘肽S-转移酶标签的构 建体中。可以商购携带生物素化的组蛋白肽的特异表观遗传修饰并且经 由链霉亲和素与α供体珠连接。如果相互作用结构域与组蛋白肽结合，α 供体和受体珠将进入到彼此极为贴近的状态从而使得当用某一波长的光 激发供体珠时，它将发射氧分子，氧分子然后与受体珠反应导致其产生 化学发光作为结合相互作用的输出信号。

涉及与记录器异常的活性有关的疾病状态(诸如癌症)的各种体外测 定可用于评估候选化合物的活性。例如，利用合适的细胞系，通常是癌 细胞系可以体外测定化合物的细胞毒性。通常，选择的细胞系的细胞生 长到适当的密度然后添加候选化合物。适当的孵育时间(例如大约48-72 小时)后，评估细胞存活。测定细胞存活的方法为本领域所熟知并且包括 但不限于刃天青还原实验(参见Fields&Lancaster(1993)Am.Biotechnol. Lab.11:48–50；O’Brien等,(2000)Eur.J.Biochem.267:5421-5426和美 国专利5,501,959号)，磺酰罗丹明测定(Rubinstein等,(1990)J.Natl. Cancer Inst.82:113-118)或中性红染料实验(Kitano等,(1991)Euro.J. Clin.Investg.21:53-58；West等,(1992)J.Investigative Derm.99:95-100)。 通过比较在处理的培养中的细胞存活和在一个或多个对照培养中的细胞 存活，例如未处理的培养和/或用对照的化合物(通常已知的治疗剂)预处 理的培养测定细胞毒性。

可以评估化合物体外抑制癌细胞增殖的能力，例如，通过在合适的 介质中培养感兴趣的癌细胞系的细胞。适当的孵育时间后，可以用候选 化合物处理细胞并且再孵育一段时间。然后计数细胞并且与适当的对照 比较。例如合适的对照包括用标准的化学治疗剂处理的细胞和/或未处理 的细胞。

可选地，通过测定化合物抑制肿瘤细胞的锚定非依赖生长的能力来 体外测试化合物。本领域中已知锚定非依赖生长为良好的致肿瘤性的指 示剂。通常，通过将来源于选择的癌细胞系的细胞平板接种于软琼脂上 并且测定适当的孵育时间段后所形成的集落量评估锚定非依赖生长。然 后可以比较用候选化合物处理的细胞的生长与对照细胞的生长(如以上所 述)。

也可应用本领域中已知的各种其他测定。

各种适用于测试候选物化合物的癌细胞系为本领域中已知的并且许 多可以商购获得的(例如来自于American Type Culture Collection, Manassas,VA)。

如有必要，也可以利用标准的技术首先体外测定化合物的毒性。例 如，可以体外用候选化合物处理人原代成纤维细胞然后接下来利用诸如 以上所述的测定或台盼蓝排除测定的标准的活力测定在不同的时间点测 试它们的活力。例如，利用胸苷掺入试验也可以测定细胞合成DNA的能 力，例如，利用连接流式细胞分选仪(FACS)的标准的细胞分选试验评估 细胞周期动力学中的变化。

药物组合物

本发明的某些实施方案涉及包含本文所述的方法鉴定的重编程的化 合物和药学上可接受的载体、稀释剂或辅料的药物组合物。利用熟知的 并且易于得到的成分通过已知的程序制备药物组合物。

可配制重编程的化合物或包含化合物的药物组合物，经口腔(例如包 括颊或舌下地)、局部地、肠道外、吸入或喷雾、直肠以包含常规的无毒 的药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的剂量单位制剂给药。通常，化 合物可掺入到可接受的媒介物并且配制成适用于给药的形式，诸如糖浆、 酏剂、片剂、锭剂、糖锭、硬的或软的胶囊、丸剂、栓剂、油状或水状 悬液、分散性粉剂或颗粒、乳剂、注射剂或溶液。如本文所用的术语肠 道外的包括皮下注射、皮内注射、关节内注射、静脉内注射、肌肉注射、 血管内注射、胸骨内注射、鞘内注射或输注技术。

可制备口服用药的的组合物为固体或流体单位剂量形式。根据本领 域中已知的程序可以制备用于药物组合物的大规模生产的流体单位剂量 形式并且为提供药学上优雅可口的制剂此类组合物可包含一个或多个选 自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的制剂。通过使用水醇的(例如乙醇) 媒介物与合适的甜味剂，诸如糖和糖精，连同增香剂一起制备酏剂。在 诸如阿拉伯胶、甲基纤维素等悬浮剂的辅助下用水性媒介物制备悬液。

诸如片剂的固体制剂包含活性成分，掺合无毒的药学上可接受的适 用于片剂大规模生产的辅料。例如这些辅料可为惰性稀释剂、诸如碳酸 钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠：例如粒化剂和崩解剂，玉米淀粉 或海藻酸：结合剂，例如淀粉，明胶或阿拉伯胶，和润滑剂，例如，硬 脂酸镁，硬脂酸或滑石粉以及其他常规的成分诸如磷酸二钙、硅酸镁铝、 硫酸钙、淀粉、乳糖、甲基纤维素和功能上相似的材料。片剂可为未包 被的或可通过已知的技术包被它们以延缓分解和在胃肠道内吸收从而在 较长的时间段内提供持续的作用。例如，可应用缓释材料，诸如单硬脂 酸甘油脂或甘油二硬脂酸酯。

口服制剂还可以硬的明胶胶囊的形式呈现，其中活性成分与惰性固 体稀释剂混合，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土，或以软的明胶胶囊的形 式呈现，其中活性成分与水或油状媒介物混合，诸如花生油、液状石蜡 或橄榄油。通过化合物与可接受的植物油、轻质液状石蜡或其他惰性油 的浆液机械封装制备软的明胶胶囊。

水性悬液包含活性材料，掺合适用于水性悬液大规模生产的辅料。 此类辅料为悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟基丙基甲基 纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶：分散剂或增 湿剂可为天然形成的磷脂，例如，卵磷脂，或烯化氧与脂肪酸的缩合产 物，例如聚乙二醇硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例 如，庚-亚乙基氧基鲸腊，或环氧乙烷与衍生于脂肪酸的部分的酯类的缩 合产物和己糖醇，诸如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或氧乙烷与衍生于 脂肪酸的部分的酯类的缩合产物和己糖醇酐，例如聚乙烯山梨糖醇单油 酸酯。水性悬液也可包含一种或多种防腐剂，例如乙基、或正丙基对甲 酚苯甲酸盐，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂或一种或多种甜味 剂，诸如蔗糖或糖精。

通过将活性成分悬浮在例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油的植 物油或诸如液态石蜡的矿物油中可配制油状悬液。油状悬液可包含增稠 剂，例如蜂蜡，固体石蜡或鲸蜡醇。可添加诸如以上提到的那些的甜味 剂和调味剂用以提供可口的口服制剂。通过抗氧化剂诸如抗坏血酸的添 加可保存这些组合物。

通过添加水，适用于水性悬液制备的分散性粉剂和颗粒提供活性成 分，掺合分散剂或增湿剂，悬浮剂和一种或多种防腐剂。通过以上所提 及的那些示例合适的分散剂或增湿剂和悬浮剂。额外的辅料，例如甜味 剂、调味剂和着色剂也可存在。

本发明的药物组合物也可为水包油乳剂的形式。油相可为植物油， 例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液态石蜡或这些的混合物。合适 的乳化剂可为天然形成的树胶，例如阿拉伯胶或黄蓍胶，天然形成的磷 脂，例如大豆，卵磷脂，和酯或衍生于脂肪酸的部分酯和己糖醇，酸酐， 例如山梨醇单油酸酯和所述部分的酯类与环氧乙烷的缩合产物，例如， 聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。乳化剂也可包含甜味剂和调味剂。

药物组合物可为无菌的可注射的水性或油质悬液的形式。可根据已 知的技术，利用那些合适的分散剂或增湿剂和以上已经提及的悬浮剂， 配制这种悬液。无菌的可注射的制剂也可为无菌的可注射的溶液或无毒 的亲代上可接受的稀释剂或溶剂中的悬液，例如1,3-丁二醇的溶液。在可 接受的媒介物和溶剂中可应用的是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。 另外，常规地应用无菌的不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于这一目 的，可应用任何品牌的不挥发性油，包括合成的单-或双甘酯。另外，诸 如油酸的脂肪酸发现可用在注射剂的制备中。诸如局部麻醉剂的佐剂、 防腐剂和缓冲剂也可包括在可注射的溶液或悬液中。

为直肠给药，可以通过将药物与合适的无刺激性的普通温度下为固 体但是在直肠温度下为液态辅料混合因此将在直肠中融化而释放药物制 备组合物。此类物质包括可可油脂和聚乙二醇。

其他药物组合物和制备药物组合物的方法为本领域中已知的并且例 如以下所述：“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”(以前 “Remingtons Pharmaceutical Sciences”)；Gennaro,A.,Lippincott,Williams &Wilkins,Philidelphia,PA(2000)。

用途

本发明的某些实施方案涉及本文所公开的方法鉴定的重编程的化合 物间接地纠正功能缺失和组蛋白修饰蛋白中的突变，用于治疗癌症或其 他由于表观遗传失调所致的病症的用途。在一些实施方案中，化合物调 控组蛋白标记阅读器或清除器蛋白的结合活性从而使得蛋白能够结合标 记而不是它的同源标记。用这种方法，化合物的用途可以抵消或逆转表 征诸如癌症的某些疾病状态的异常的记录器活性的有害效应。

在某些实施方案中，重编程的化合物调控组蛋白甲基化阅读器的结 合活性并且因此在例如EZH2或MLL2的组蛋白甲基转移酶(记录器)异常 的活性所表征的疾病治疗中发现效用。

本发明的某些实施方案提供了重编程的化合物在降低的MLL2甲基 化活性所表征的疾病治疗中的用途，例如，通过增加BPTF对单-或双- 甲基化H3K4结合的能力调控BPTF的结合活性。例如，BPTF重编程的 化合物可用于治疗癌症，尤其是治疗降低的BPTF甲基化活性所表征的 癌症。与BPTF功能缺失突变有关的癌症包括但不限于非霍奇金氏淋巴 瘤(NHL)，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的生发中心B(GCB)亚型，弥 漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的激活的B细胞样的(ABC)亚型，和伴有 失活的MLL2蛋白的癌症，其包括但不限于肺癌、乳腺癌和神经系统癌 症

因此本发明的某些实施方案涉及BPTF重编程的化合物在患有NHL、 GCB-DLBCL、ABC-DLBCL、肺癌、乳腺癌或神经系统癌症的患者中增 加BPTF对单-或二甲基化的H3K4结合的能力的用途。

本发明的某些实施方案提供重编程的化合物在治疗增加的EZH2甲 基化活性所表征的疾病中的用途，例如其通过增加CBX2对结合单-或二 甲基化的H3K27的能力，调控CBX2的结合活性。例如，CBX2重编程 的化合物可用于癌症治疗，尤其是增加的EZH2甲基化活性所表征的疾 病的治疗。EZH2的过表达已与许多癌症有关，包括乳腺癌、前列腺癌、 卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌、多发性骨髓瘤、神经系统癌症和淋巴瘤。 一些实施方案提供了CBX2重编程的化合物在侵润性、耐药的或已显示 与EZH2过表达有关的难治性癌症治疗中的用途。

本发明的某些实施方案涉及CBX2重编程的化合物在治疗具有EZH2 的突变形式的癌症中的用途，例如其中位于641位置处的酪氨酸被可选 的氨基酸取代(Y641突变体)的EZH2的突变形式。此类癌症的实例，包 括但不限于淋巴瘤(诸如非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、滤泡性淋巴瘤(FL)和 弥漫性大B细胞淋巴瘤的生发中心B(GCB-DLBCL)亚型))、前列腺癌、 乳腺癌、肺癌、和神经系统癌症。

联合治疗

本发明的某些实施方案中涉及重编程的化合物在治疗癌症中的用 途，化合物可与一种或多种化疗剂联合使用。

各种化疗剂为领域中已知的并且包括特异地用于特定癌症类型的那 些及可应用于一系列癌症的那些，诸如阿霉素、卡培他滨、米托蒽醌、 伊立替康(CPT-11)、顺铂和吉西他滨。

通常用于实体瘤治疗的化疗剂包括，例如吉西他滨(例如健)、环 磷酰胺、卡培他滨(例如希罗)、异环磷酰胺、紫杉醇(例如泰)、顺 铂、多西他赛(例如泰素)、卡铂、阿霉素(表柔比星)、多柔比星(例如 亚德里亚霉)和5-氟尿嘧啶(5-FU)。

通常用于乳腺癌治疗的化疗剂包括，例如卡培他滨(例如希罗)、 环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡铂、紫杉醇(例如泰)、顺铂、多西他 赛(例如泰素)、异环磷酰胺、阿霉素(表柔比星)、多柔比星(例如亚德 里亚霉)、曲妥单抗(赫赛)和三苯氧胺。

通常用于非霍奇金氏淋巴瘤治疗的化疗剂包括，例如甲基苄肼(例如 甲基苄)、阿糖胞苷、利妥普单抗(例如瑞图)和依托泊苷。

通常用于前列腺癌治疗的化疗剂包括，例如醋酸戈舍瑞林(例如诺雷 )、米托蒽醌(例如盐酸米托蒽醌)、强的松(例如强的)、苯三唑、尼 鲁米特(例如)、氟他米特(例如氟他)、非那雄胺(例如保列 )、特拉唑嗪(例如高特)、多沙唑嗪(例如可多)、环磷酰胺、多 西他赛(例如泰素)、雌氮芥和黄体生成素释放激素激动剂。

本发明的的一些实施方案涉及重编程的化合物，诸如CNX2或BPTF 重编程的化合物，与靶向EZH2的治疗剂联用在治疗癌症中的用途。此 类化合物的实例包括，例如美国专利公开2009/0137508、2011/0251216、 2012/0071418和2011/0237606中所述的那些。

本发明的某些实施方案涉及重编程的化合物，诸如CBX2或BPTF 重编程的化合物，与化疗剂联用在治疗耐药性肿瘤中的用途，其中耐药 性为EZH2的上调/活性过大的结果。

本发明的某些实施方案涉及BPTF重编程的化合物与诸如LSD1或 PLU1的H3K4消除器的抑制剂联用，用于癌症或其他MLL2功能缺失突 变所致的病症的治疗。

本发明的某些实施方案涉及BPTF重编程的化合物与CBX2重编程 的化合物联用，在治疗伴有减少的MLL2蛋白活性(例如由LoF突变)和/ 或增加的EZH2活性的癌症中的用途，其包括但不限于NHL、 ABC-DLBCL、GCB-DLBCL、滤泡性淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌 和神经系统癌症。

试剂盒

本发明的某些实施方案提供了包含一个或多个重编程的化合物的试 剂盒，例如治疗剂包或试剂盒。在那些其中重编程的化合物意图用作联 合治疗的一部分实施方案中，试剂盒可任选地包含组成联和的其他治疗 剂。

在某些实施方案中，一种或多种试剂盒的组分可以为冻干的并且试 剂盒可以额外地包含合适的溶剂用于冻干组分的重建。单个试剂盒的组 分通常包装在分开的容器中，并且与此类容器有关，可以为政府机关调 节药物或生物产品的生产、使用或销售所规定的公告的形式，其公告反 应批准，利用生产，用于人体或动物给药的使用或销售。

在某些实施方案中，试剂盒中提供了适用于个体给药的药物组合物 形式的重编程的化合物。在这种情况下，若需要，容器它自身可为吸入 器、注射器、移液管、滴眼管、或其他此类相似的装置，通过其组合物 可以给药到个体。

BPTF重编程的化合物

在一方面，本发明涉及本文所述的方法鉴定的BPTF重编程的化合 物，及药物组合物和包含这些化合物的试剂盒，以及如以上所述的这些 化合物的用途。

本发明的某些实施方案涉及具有通式I的重编程的BPTF的化合物：

其中：

(a)X为C＝O或S(O)₂，

R₁为H、C₁-C₄烷基或C₁-C₄烷氧基，

R₂为H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基或卤素，并且R₃为H，或R₂和 R₃与它们所连接的C原子一起形成或

R₄为H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基或卤素，

R₅为H、CH₂NMe₂或以及

R₆为H，并且R₇为H，或R₆与R₇一起形成＝CH₂，

其中当R₅为H并且R₆与R₇一起形成＝CH₂时，X为S(O)₂，并且其 中当R₄为C₁烷基，R₅为CH₂NMe₂，并且R₆与R₇一起形成＝CH₂时，则 R₁、R₂和R₃中的至少一个不是H；

或

(b)X为NH₂，

R₁和R₂为H，

R₃和R₄与它们所连接的C原子一起形成：或

R₅为取代的C₁-C₄烷基或未取代的C₂-C₄烷基，其中每一取代基为卤 素，以及

R₆与R₇一起形成＝O。

本发明的一些实施方案涉及通式I的BPTF重编程的化合物，其中：

X为C＝O或S(O)₂，

R₁为H、C₁-C₄烷基或C₁-C₄烷氧基，

R₂为H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基或卤素，并且R₃为H，或者R₂和R₃与它们所连接的C原子一起形成:或

R₄为H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基或卤素，

R₅为H、CH₂NMe₂或以及

R₆为H并且R₇为H，或者R₆与R₇一起形成＝CH₂。

本发明的一些实施方案涉及通式I的BPTF重编程的化合物，其中：

X为C＝O或S(O)₂，

R₁为H或C₁-C₄烷基，

R₂为H、C₁-C₄烷基或卤素，并且R₃为H，或者R₂和R₃与它们所连 接的C原子一起形成:或

R₄为H、C₁-C₄烷基或卤素，

R₅为H、CH₂NMe₂或以及

R₆为H并且R₇为H，或者R₆与R₇一起形成＝CH₂，

其中当R₁、R₂、R₃和R₄每一个都为H时，则R₅为

本发明的某些实施方案涉及具有通式II的重编程的BPTF的化合物：

R₁为H或C₁-C₄烷基，

R₂为H或卤素，并且R₃为H，或者R₂和R₃与他们所连接的C原子 一起形成：

R₄为H、C₁-C₄烷基或卤素，

R₅为CH₂NMe₂或以及

R₆为H并且R₇为H，或者R₆与R₇一起形成＝CH₂。

本发明的一些实施方案涉及通式I或II的BPTF重编程的化合物， 其中每一个C₁-C₄烷基为Me。

本发明的一些实施方案涉及通式I或II的BPTF重编程的化合物， 其中：

R₁和R₄为H或Me，并且

R₂和R₃为H。

本发明的一些实施方案涉及通式I或II的BPTF重编程的化合物， 其中：

R₁和R₃为H，

R₂和R₄为H或卤素。

本发明的一些实施方案涉及通式I的BPTF重编程的化合物，其中：

X为S(O)₂，

R₁为H或C₁-C₄烷基，

R₂为H、C₁-C₄烷基或卤素，并且R₃为H，或者R₂和R₃与它们所连 接的C原子一起形成:或

R₄为H、C₁-C₄烷基或卤素，

R₅为H、CH₂NMe₂或以及

R₆为H，并且R₇为H，或者R₆与R₇一起形成＝CH₂。

本发明的一些实施方案涉及通式I的BPTF重编程的化合物，其中：

X为NH₂，

R₁和R₂为H，

R₃和R₄与它们所连接的C原子一起形成：或

R₅为取代的C₁-C₄烷基或未取代的C₂-C₄烷基，其中每一取代基为卤 素，以及

R₆与R₇一起形成＝O。

本发明的一些实施方案涉及通式I的BPTF重编程的化合物，其中：

X为NH₂，

R₁与R₂为H，

R₃和R₄与它们所连接的C原子一起形成：

R₅为取代的C₁-C₄烷基或未取代的C₂-C₄烷基，其中每一取代基为卤 素，以及

R₆与R₇一起形成＝O。

本发明的一些实施方案涉及如前文的实施方案中任一个所述的通 式I或II的BPTF重编程的化合物，其中每个卤素为Cl。

本发明的一些实施方案涉及通式I的BPTF重编程的化合物，其选自 以下：

和

本发明的一些实施方案涉及选自以下组成的BPTF重编程的化合物：

和

本发明的一些实施方案涉及通式I的BPTF重编程的化合物，其选自 以下：

和

本发明的一些实施方案涉及选自以下组成的BPTF重编程的化合物：

和

本发明的一些实施方案涉及具有以下结构的BPTF重编程的化合物：

或

CBX2重编程的化合物

在一方面，本发明涉及本文所述的方法鉴定的CBX2重编程的化合 物，及药物组合物和包含这些化合物的试剂盒，以及如以上所述的这些 化合物的用途。

本发明的某些实施方案涉及用于重编程CBX2的具有通式III的化合 物：

其中：

R₁、R₂、R₄和R₈各自独立地为H或卤素；

R₃为H、卤素、C₁-C₄烷基或苯基，并且R₉为H或卤素；或R₃与 R₉与它们所连接C原子一起形成苯基；

R₅为或OR₇或＝O；

R₆为X、CH₂X、C₁-C₄烷基、NH-NH₂、CH₂NR₁₀、或哌啶基；

R₇为H或C₁-C₄烷基；

R₁₀为H、C₁-C₄烷基或CH₂-苯基，以及

X为卤素。

在一些实施方案中，通式III中：

R₁、R₂和R₄各自独立地为H或卤素；

R₃为H、卤素、C₁-C₄烷基或苯基，以及R₉为H或卤素；或R₃与 R₉与它们所连接C原子一起形成苯基；

R₅为OH或＝O；

R₆为X、CH₂X、C₁-C₄烷基、NH-NH₂、CH₂NR₁₀或哌啶基；

R₈为H；

R₁₀为C₂-C₃烷基或CH₂-苯基，以及

X为卤素。

在一些实施方案中，通式III中：

R₁、R₂和R₄各自独立地为H或卤素；

R₃为H、卤素、C₁-C₄烷基或苯基，并且R₉为H或卤素；或R₃与 R₉与它们所连接C原子一起形成苯基；

R₅为OH或＝O；

R₆为CH₂X或哌啶基；

R₈为H；

R₁₀为C₂-C₃烷基或CH₂-苯基，以及

X为卤素。

在一些实施方案中，通式III的化合物具有通式IV：

其中：

R₁、R₂和R₄各自独立地为H或卤素；

R₃为H、卤素或苯基；

R₅为OH或＝O；

R₆为X、CH₂X或C₁-C₄烷基，以及

X为卤素。

在一些实施方案中，通式IV中：

R₁、R₂和R₄各自独立地为H或卤素；

R₃为H、卤素或苯基；

R₅为＝O；

R₆为CH₂X,以及

X为卤素。

在一些实施方案中，通式III的化合物具有通式V:

其中：

R₁和R₄各自独立地为H或卤素；

R₃为H、卤素或C₁-C₄烷基，并且R₉为H或卤素；或R₃与R₉与它 们所连接C原子一起形成苯基；

R₅为OH或＝O；

R₆为NH-NH₂、CH₂NR₁₀或哌啶基；

R₁₀为C₂-C₃烷基或CH₂-苯基。

在一些实施方案中，通式V中：

R₁和R₄各自独立地为H或卤素；

R₃为H、卤素或C₁-C₄烷基，并且R₉为H或卤素；或R₃与R₉与它 们所连接C原子一起形成苯基；

R₅为OH；

R₆为哌啶基；

R₁₀为C₂-C₃烷基或CH₂-苯基。

在本发明的某些实施方案中，通式III、IV或V的化合物中，各个卤 素为Cl或Br。

在通式III或V的化合物一些实施方案中，X为Br。

在本发明的一些实施方案中，通式III的化合物具有下列的结构：

可以从各种资源库获得或源于以上所述的BPTF和CBX2重编程的 化合物，例如，国立癌症研究所(NCI)/国立健康研究所(NIH)的NCI研发 治疗程序(DTP)开放的化学库。

在某些实施方案中，通式I、II、III、IV和V的化合物可拥有足够的 酸基，足够的碱基，或这两种功能基团，并因此与许多有机碱和无机碱， 或有机酸和无机酸反应而形成药学上可接受的盐。如本文所用的“药学上 可接受的盐”指基本上对活的生物体无毒的化合物的盐。典型的药学上可 接受的盐包括通过通式I、II、III、IV和V的化合物与药学上可接受的矿 物质或有机酸或有机的或无机的碱反应制备的那些盐。此类盐被称为酸 加成盐和碱加成盐。

通常应用于酸加成盐的酸为无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、 硫酸、磷酸等，和有机酸，诸如对甲基苯磺酸、甲基磺酸、草酸、对溴 苯基磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、醋酸等。此类药学上可接 受的盐的实例为磺酸盐、焦硫酸盐、重硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、单 氢化磷酸盐、二氢化磷酸盐、片磷酸盐、焦磷酸盐、溴化物、碘化物、 醋酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、盐酸盐、二盐 酸化物、异丁酸盐、己酸盐、硬脂酸庾酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二酸 盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索酸盐、丁炔-1,4-碘酸盐、 己炔-1，6-碘酸盐、苯酸盐、氯苯酸盐、苯甲酸盐、羟基安息香酸盐、甲 氧基安息香酸盐、邻苯二甲酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、 苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲 基磺酸盐、丙基磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。特别 感兴趣的药学上可接受的酸加成盐为与诸如盐酸和氢溴酸矿物酸所形成 的那些，和与诸如马来酸和甲基磺酸盐的有机酸形成的那些。

胺基盐也可包括季胺盐，其中氨基氮携带合适的有机基团诸如烷基、 低级烯基、取代的低级烯基、低级炔基、取代的低级炔基或芳烷基部分。

碱加成盐包括衍生于无机碱的那些，诸如铵或碱或碱土金属、碳酸 盐、二碳酸盐等。因此可用于制备药学上可接受的盐的碱包括氢氧化钠、 氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙、碳酸 钙等。

本领域中的技术人员应理解形成药学上可接受的盐的一部分的特定 的平衡离子通常不具有关键性能，只要盐总体上为药学上可接受的并且 只要平衡离子没有导致盐总体上不期望的性质就好。

在一些实施方案中,本发明还包含药学上可接受的通式I、II、III、IV 和V的化合物的溶剂合物。许多通式I、II、III、IV和V的化合物可以 与诸如水、甲醇、乙醇和乙腈组合而形成药学上可接受的溶剂合物，诸 如相应的水合物、甲醇合物、乙醇合物和乙腈合物。

某些通式I、II、III、IV和V的化合物具有一个或多个不对称的(手 性的)中心和/或不饱和键。因此，这些化合物可以外消旋体、个体的对映 异构体、对映异构体的混合、个体的非对映体、非对映体的混合、个体 的同分异构体、同分异构体的混合。本发明的某些实施方案提供了对映 体、非对映体或同分异构体，或如对映体、非对映体或同分异构体的混 合形式的通式I、II、III、IV和V的化合物。

在某些实施方案中，本发明提供了通式I、II、III、IV和V的化合物 的前体药物。本文所用的术语“前体药物”指经过化学衍生诸如另一化学 基团的取代或添加从而改变(用于药物使用)它的一种或多种理化性质，并 且通过给药于个体后一种或一系列的代谢转变其自身产生活性化合物的 化合物。通过化合物转化为前体药物形式改变的理化性质，包括，例如 溶解度、生物利用度、吸收、分布、位点特异性、稳定性、释放特征、 毒性等。为将化合物转化为前体药物可制备通式I、II、III、IV和V的化 合物的的化学衍生物的实例，包括但不限于酯类衍生物、醚类衍生物、 氯基甲酸酯衍生物、酰胺衍生物、亚胺衍生物和带有适当的载体部分直 接地或经由连接基团的衍生物。前体药物和产生给定起作用的化合物的 前体药物的方法的实例为本领域中技术人员熟知的并且可以在例如 Krogsgaard-Larsen等(Textbook of Drug Design and Discovery,Taylor& Francis,New York,NY(April 2002))中找到。

可以通过本领域中已知的方法进行盐、溶剂合物和前体药物的制备。 应领会的是非药学上可接受的盐、溶剂合物或前体药物也可在本发明的 范围内，因为那些在药学上可接受的盐、溶剂合物或前体药物的制备中 是有用的。

为获得对本文所述的发明的更好的理解，提出下列的实施例。应理 解的是这些实施例意图是描述本发明示例的实施方案而不是意图以任何 方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：BPTF的小分子重编程

分子模拟。用GROMACS-4.0.5程序包连同在www.pubchem.org上 实施的化学结构研究的软件进行的分子动力学模拟(MD)，为本研究中主 要的建模工具。使用ICM程序包(Molsoft LLC,San Diego,CA)的分子锚 定方法显示了不佳的准确度和通常不令人满意的结果。

使用来源于Li,H等(2006,Nature,442:91-95)与H3K4N末端尾肽复 合的BPTF蛋白的3D模型(蛋白数据库登录码2FUU)。模拟前，将模型 置于简单点电荷(SPC)水的三斜晶系盒中((Berendsen,H.等.Intermolecular  Forces 1981,331-342)，向其中添加包含中和平衡离子的100mM NaCl等 价物。在各个方向上应用周期性边界。所有蛋白分子的N和C末端都离 子化。分配所有其他氨基酸它们的典型状态在生理性pH处。将来自于 GROMOS96 43a1的能量项参数设定(Scott,W等.J Phys Chem A 1999, 103,3596-3607)应用于系统中所有的分子种类。为处理两种Zn²⁺离子，用 八个新的同等的化学键(和同位角)升级参数设定：对第一个锌原子而言， C11的SG原子，C13的SG原子，H34的ND1原子和C37的SG原子； 对第二个锌原子而言，C26的SG原子，C29的SG原子，C53的SG原 子，和C56的SG原子。相应残基上的电荷分布也升级：对第一个Zn²⁺配位复合体而言，沿着H34咪唑环缓和电子并且在锌原子和Cys残基的 三个硫原子之间平分第二个；对第二个锌原子而言，电荷设定为-0.4e并 且将剩余的两个电子在Cys残基的四个硫原子间平分。

编辑组蛋白肽的K4me3残基从而用氢原子取代三个甲基中的两个。 由于GROMOS96力场中阳离子-π相互作用精确的参数的缺失，所有芳香 环的原子，但不是Y17残基的那些，BPTF芳笼中，及单甲基化Lys4的 NZ原子在处于它们的坐标处1000kJ·mol^-1·nm^-22FUU结构中冷冻为硬的 谐波位置限制株。

用双面角周围的旋转人工地编辑Y17侧链的构象从而羟苯基环不再 占据最初模型中所占据的腔，但是位于Y17CA原子相对位置的相对面。 然后空腔用作三体复合体模型初始配置中的小的有机化合物的锚定位 点。通过化合物的旋转、翻译和双面角选择，优选位于PRODRG服务器 (Schuttelkopf,A.W等,Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.2004, 60:1355-1363)真空中人工地构建所有复合体。由于PRODRG(Lemkul,J. A等.J.Chem.Inf.Model.2010,50:2221-2235)所产生的参数设定中一些精 确度的缺失，未键合的化合物参数就人工地集中编辑，尤其是对每一个 化合物重写电荷分布。

用稍微拉直的未键合的相互作用进行所有MD计算：Leonard-Jones 与Coulomb的短距离相互作用在1.3nm处转变，在1.4nm处消失，邻近 搜索半径设定为1.5nm，分别重复MD积分器的10步骤。用particle mesh  Ewald(PME)算法(Essmann,U等.J.Chem.Phys.1995,103:8577-8593)建模 长距离的静电相互作用。为建模溶解的复合体，通过l-bfgs最小化(Liu,D. C和Nocedal,J.Math.Program.1989,45:503-528)和用在定容的(NVT)系 统中模拟的蛋白和化合物的重原子的限制位置50ps分子动力学的模拟 松弛结构。使用模拟退火(Kirkpatrick,S等.Science 1983,220:671-680, Cerny V.J.Optimiz.Theory Appl.1985,45:41-51)用于将系统从根据玻尔 兹曼分布，T＝10K-T＝310K处分配的最初的初速度变暖。随着NVT变暖， 进行100ps恒压(NPT)平衡。复合体与其他原子耦合以分隔耦合浴温度并 且温度维持在T＝310K。为平衡，使用弱耦合(Berendsen,H.J.C等.J.Chem. Phys.1984,81:3684-3690)来维持各向同性的压力在1.0bar并且使用 Berendsen弱耦合方法(Berendsen,1984,ibid.)来维持恒定的温度。用更精 确的Nose-Hoover恒温器(Nose,S.Mol.Phys.2002,100:191-198,Hoover, W.Physical Review A 1985,31:1695-1697)和温度耦合时间常数0.1ps，以 及Parrinello-Rahman恒压器(Parrinello,M等.J.Appl.Phys.1981, 52:7182-7190,Nose,S.and Klein,M.L.Mol.Phys.1983,50:1055-1076)和 NPT系统下压力耦合时间常数1.0ps进行所有随后的再现性运行。恒温 器和恒压器的这一组合确保了真正的NPT系统取样并且只有少量人为因 素(即便还有的话)，由此而导致小(22个原子)且紧凑的芳族笼。对MD轨 迹的光学检测而言，使用VMD指示器(Humphrey,W.；et al.J.Mol.Graph. 1996,14:33-8,27-8)。

结果和讨论：MLL2功能缺失(LoF)突变预计导致H3K4me2和 H3K4me3表观遗传标记的缺失，因为对这些标记而言MLL是唯一的效 应蛋白。因为H3K4的甲基化为熟知的激活标记，MLL2的致瘤性功能失 活可导致保护癌细胞免于被H3K4甲基标记正常地激活的基因表达。

H3K4me2和me3标记的阅读器为BPTF蛋白。BPTF结合me2和 me3标记，但不与H3K4me0,1标记(Li H.,et al.,2007,Mol.Cell., 28:677-691)结合。H3K4me0,1标记被L3MBTL蛋白结合(Li H.,et al., ibid.)。本文已显示的是设计重编程BPTF的化学化合物从而以高于正常 的亲和力结合H3K4me0,1是可能的，这样就可以模拟MLL2活性。通过 形成BPTF、H3K4me0或me1尾和小分子化合物的三体复合体实现重编 程从而使得后者创造利于BPTF与H4K4me0和/或me1结合的环境。

使用集中计算方案来鉴定重编程BPTF显示对H3K4me0,1有亲和力 的有希望的候选物。BPTF经由4个芳香族残基W32、Y10、Y23和Y17 所形成的芳族笼识别三甲基化赖氨酸。笼形成了3D空间的盒子，其中4 面都由这些芳香族残基所创造，一面是其中发现K4主链，并且最后一面 对水开放。笼中没有任何氢键基序存在，这个笼选择地结合三甲基化的 赖氨酸，其在NZ原子处没有氢原子。为重编程BPTF的特异性，需要的 是在激活位点内或近端锚定化合物从而提供氢键结合基序以允许 H3K4me0,1三体复合体的形成。

采取的方法为解构芳族笼的其中一面从而提供用于化合物锚定和进 入激活位点从而供应氢受体基序的位点。

BPTF-H3K4me1尾肽复合体的模型取自Li,H等(2006,Nature, 442:91-95)。利用应用于BPTF的芳族笼(W32,Y10和Y23残基的侧链) 和组蛋白尾肽的K4的NZ原子，与分子动力学(MD)一起模拟2ns的模型。 选择芳族笼最少保守的残基Y17用于解构。

虚拟化合物的探针(表1)用于取代BPTF激活位点中的Y17。最初使 用化合物V1和V2与被模拟的三体复合体两个独立的运行6nsMD。随着 探针被分离，失去与Y17的竞争性，通过回顾MD轨迹鉴定引起失败的 化合物的区域，并且这一区域为突变的。以此类方式，探针化合物的演 变为：

V1→V11→V12→V13→V14→V3←V23←V22←V21←V2

最终的虚拟探针V3提供了在6ns MD期间稳定的复合体。V3能够 战胜Y17对芳族笼的面，并且在酮氧和K4的两个氢原子(H2+,me1)之间 形成两个良好的氢键。

表1：探针化合物的结构

然后通过锚定来自于国立癌症研究所(NCI)文库的化合物，将来自于 最终的V3探针复合体的典型蛋白结构用于选择可作为潜在的BPTF重编 程的化合物的真正的化合物。人工审阅大约5000个高得分的NCI文库来 源的化合物复合体后，选择22个提供三体复合体稳定的6ns MD的候选 结构。选择期间，考虑到GROMOS96力场没有特异的阳离子-π参数的事 实从而使得如果在模拟期间发现具有脂族环的探针很稳定，选择其中这 一锚定环为芳族的结构作为优选的结构。

利用实施例3中概述的方案，体外测试选择的化合物集SU-DHL-9 细胞系(纯合子的LoF MLL2突变体)中的活性。基于导致化合物集 (NSC382001(化合物1),NSC304107(化合物2)和NSC127763(化合物3)) 的鉴定的活性化合物的相似性的进一步的优化激活对抗MLL2双LoF突 变细胞系，但是对野生型细胞(参见表2)失活。显示化合物2、BPTF和 H3K4me1肽的“三体重编程的复合体”的模型显示于图1中。

鉴定和显示体外选择性杀死细胞系SU-DHL-9的其他化合物和拥有 MLL2LoF纯合子突变的Pfeiffer，也显示在表2中。这些大约1M的浓 度化合物在这些测试中显示了活性。

表2：候选的BPTF重编程化合物

实施例2：额外的BPTF重编程的化合物的鉴定、测试和分析

初始筛选候选的BPTF重编程的化合物(参见实施例1)导致鉴定了两 种有希望的母核(以下的A和B)，利用结构-活性关系(SAR)方法人工地可 将其进一步地优化，得到如表3和4中所示的额外的候选的BPTF重编 程的化合物的鉴定。利用实施例中所概述的方案体外测试这些化合物在 SU-DHL-9和Pfeiffer细胞系中的活性。对SU-DHL-9细胞系而言，最活 跃的化合物的活性为大约2μM，对Pfeiffer细胞系而言，最活跃的化合 物的活性为大约6μM，同时在10μM处没有观察到对阴性对照的细胞毒 性。

表3：基于母核A的候选BPTF重编程的化合物

表4：基于母核B的候选BPTF重编程的化合物

结构-活性关系(SAR):对活性母核而言，SAR分析(抗SU-DHL-9的选 择性毒性，表2和3)通常与三体复合体的分子模型相符。根据母核A的 MD模型(图1)，R1、R2、R3和R4应为疏水的，并且除了R4之外(R4 在不同的位置处稳定Y17)所有都应该相当小并带有最少量可旋转的键从 而匹配羟苯基结合位点。活性化合物1和2与失活的或最小活性的化合 物16、17和19的比较确认小的疏水的R1和R3对活性具有负影响，这 种影响只有通过R2取代稍微地抵消-如从化合物15和20的活性可见。 在位置R1、R2和R3处有小的但可旋转的甲氧基的化合物18只具有中 等的活性，但是如果甲氧基旋转在二氧环中被显著地限制，如从化合物7 可见，活性恢复。R4表现出更复杂的效应并且可被R1、R2和R3的缺 失完全地抵消(如化合物11中)或如在化合物8中没有效应。潜在的解释 为这一复杂性与Y17侧链具有竞争性，其甲基-哌啶尾在腔外部能够稳定 而叔丁基-甲基-酰胺不能。

R1、R2、R3和R4处取代均缺失对活性具有强烈的负影响，如所期 望的(参见化合物13)。有对称取代基的化合物14也缺少活性，很可能积 极的支持小尺寸的R2是期望的。

通过化合物21确认重编程的基序A1的关键效应，化合物21在此位 置处缺少羰基。A0基序低得多的重要性通过化合物6显示，尽管R4在 这一化合物中的缺少导致了只有中等的活性。如预期的，A2显得并不是 关键的(与化合物1/化合物2和化合物17/化合物19化合物对比较)。

对于母核B可以得到相似的结论。尽管NCI文库包含相对少的与活 性化合物3(NCI127763)结构同源的化合物，通过化合物3和部分活化的 化合物22与失活的化合物23(R4疏水性)和24(R4长度)的比较，确认了 长的疏水R4类似物的重要性。通过化合物3/化合物9对确认了分子间的 重编程的氢键的关键效应。

根据立体模型，结果可以解释为占据了Y17结合袋的分子的芳族部 分，连同酰胺氧重编程的BPTF和脂肪族尾，稳定了Y17侧链的新位置。

实施例3：化合物1-3的体外活性

体外测试化合物1-3(参见表2)它们抑制DoHH-2(MLL2野生型), SU-DHL-9和Pfeiffer(MLL2纯合子的插入缺失突变体)细胞系生长的能 力。结果显示于图2A中。还研究了化合物3的活性的浓度依赖性。结果 显示于图2B中。

方法：在37℃下、5％CO₂、潮湿大气的孵育器中，在添加了10％(v/v) 胎牛血清(Life Technologies)和1％盘尼西林/链霉素(Life Technologies)的 RPMI培养基1640(Life Technologies)中维持弥漫性大的B细胞淋巴瘤细 胞系。细胞系DOHH2获取自DSMZ。Pfeiffer获取自ATCC。SU-DHL-9 获取自Martin Dyer(莱斯特大学，英国)。

化合物最初以10mM的浓度溶解于DMSO中。在RPMI培养基1640 中将这一化合物溶液以1:100进一步地稀释到100mM的最终浓度。以 4×10⁵个细胞/mL的浓度将90微升的细胞分配到MICROTEST^TM96孔测 定平板，Optilux^TM(BD)。然后将10微升的100μM化合物溶液添加到细 胞中由此得到10μM的最终的化合物浓度。一式三份地测试每一化合物。 还将10微升的1:100的DMSO与RPMI培养基1640添加至90μL的细 胞，作为载体对照。而且，每一平板包括只包含RPMI培养基1640的孔 的，用作背景噪音对照以及完全未处理的细胞。在经受细胞 增殖测定(Life Technologies)之前，在37℃下、5％CO₂、潮湿大气的孵育 器中化合物与细胞一起孵育48小时。原始荧光单位用于纠正背景噪音并 且标准化至载体处理的对照。

实施例4：化合物2和3的体外活性

利用细胞系DoHH-2,OCI-LY3,WSU-DLCL2(对MLL2而言全部都 是野生型)和SU-DHL9，进一步地研究化合物3的体外活性。另外，在细 胞系突变体中研究化合物2对MLL2或对MLL2和EZH2的剂量应答。 在MLL2突变细胞系中研究化合物3的剂量应答。方法如实施例3所述。 细胞系WSU-DLCL2获取自DSMZ，并且OCI-Ly系3获取自Louis Staudt (美国国立健康研究所)。

结果显示于图3A-C中。应注意的是化合物3对其中MLL2为野生型 的细胞没有明显的影响，这提示化合物没有通常的有害特性。

实施例5：化合物2和3与BPTF的相互作用

为显示代表性的化合物2和3与BPTF靶标相互作用以及影响它与 H3的组蛋白尾结合的能力，应用BPTF构建测定。测定图示地描述于图 4中并且以下进行了详述。

使用这一测定，确定的是，化合物3能够稳定H3K4me1与BPTF的 结合(图5A)，而意外收获的是化合物2能够稳定H3K4me2的结合(图5B)。 图5A中，GST抗体染色显示了在化合物3与H3K4me1存在的情况下增 加的BPTF蛋白，和在化合物和H3K4me3存在的情况下减弱的结合。密 度测定法值H3K4me1+化合物3＝13335,H3K4me-化合物3＝9350, H3K4me3+化合物3＝4227,H3K4me3-化合物3＝2545。图5B中，GST 抗体染色显示在化合物2与H3K4me2存在的情况下增加的BPTF蛋白， 和在化合物与H3K4me3存在的情况下减弱的结合。

方法：全长的人BPTF构建体获自Laboratory of Chromatin Biology, Rockefeller University的C.David Allis(Li等,2006,ibid)。利用克隆技术，允许N末端GST标签(Life Technologies)，将来自于人BPTF (gi:31322942)双数的PHD指状溴结构域(残基2583-2751)克隆到pDEST15 载体中。利用添加了1mM IPTG和0.2％L-阿拉伯糖的LB培养基，在 37℃振荡的孵育器中，诱导GST-BPTF双数的PHD指状-溴结构域在 BL21-AI^TM化学性竞争的大肠杆菌细胞中过表达。利用谷胱甘肽琼脂糖 4B培养基(GE医疗保健生命科技)纯化GST-BPTF双数的PHD指状-溴结 构域并且相对于PBS(Life Technologies)透析过夜。

基本上如以前所述的(Ruthenburg等,2011,Cell,145(5):692-706.)进行 肽构建试验。将50微升的M-280链霉亲和素标记磁(Life Technologies) 分配到1.5mL微管中并且在PBS中洗涤3×50μL。然后在4℃，饱和条 件下，将磁珠与C末端生物素化的H3K4me0,me1,me2或me3肽21氨 基酸长(Anaspec)旋转1小时。在PBS-TD(10mM Na-HEPES,150mM NaCl, 0.005％吐温-20,2mM DTT)中洗涤磁珠3×100μL，并且与6.8μM GST-BPTF，以及含68μM药物的1:100的DMSO PBS溶液或单独的载 体孵育磁珠，在4℃下旋转3小时。然后在HBS-TD中洗涤磁珠10×200 μL。在85℃下利用2×LDS样品缓冲液(Life Technologies)和1×还原剂(Life  Technologies)洗脱蛋白10分钟。样品经过SDS-PAGE并且利用 SimplyBlue染色(Life Technologies)或GST抗体(圣克鲁兹)使条带显形。 利用ImageJ软件进行条带的定量。

实施例6：化合物3的体内活性

测试化合物2和3它们减少肿瘤在小鼠移植瘤模型中生长的能力。

移植瘤模型。NOD/SCID/γ^null(NSG)小鼠饲养于当地BCCRC动物设 施中。为建立原发性肿瘤，用含1×10⁷个人弥漫性组织细胞的淋巴瘤细 胞系SU-DHL-9的50_μl PBS在侧腹部接种雄性NSG小鼠。s.c.肿瘤发展 后，处死小鼠并且利用13G套针将小的肿瘤碎片(～20mg)s.c.移植到麻醉 的6-10周龄的雄性NSG易感小鼠中。一旦肿瘤变得可感知的就开始处理。 通过卡尺测定肿瘤长度和宽度并且通过修改的椭圆体的公式如(长×宽 ²)/2计算肿瘤体积。

功效研究。将化合物稀释在50％DMSO与50％聚乙二醇200的混合 物中。以剂量1mg/kg或4mg/kg的化合物(化合物3；NSC 127763)、剂量 4mg或12mg/kg(化合物2；NSC 304107)或对照媒介物每天腹腔内注射给 药8个荷瘤小鼠/组8天的时间。每两天记录体重，每四天记录肿瘤大小 并且监测小鼠任何其他额外的副作用。在第9天处死实验动物，测定肿 瘤体积，标化至初始肿瘤体积后通过学生t检验测定差异的显著性。

如图6中所示，化合物在这种小鼠移植瘤模型中都显示了抗肿瘤活 性。对化合物3(图6A)而言，在化合物以相对低水平的4mg/kg存在的情 况下的这一快速生长的模型中，与具有中位的563％的肿瘤生长的未处理 的对照比较，能够减少中位的肿瘤生长至362％。与具有中位的1755％的 肿瘤生长的未处理的对照比较，剂量12mg/kg的化合物2(图6B)能够减 少中位的肿瘤生长至1305％。这些结果特别预示了这些化合物的剂量或 制剂并不是最佳化的。

实施例7：CBX2的小分子重编程

基于苍蝇Policomb蛋白(CBX2的类似物)的结构，将计算方法应用于 组蛋白甲基化标记阅读器CBX2，导致产生许多候选CBX2重编程化合物 (表5)的鉴定。

药效团描述：CBX2结合带有由三个残基——F11、W22和W25所 形成的芳族笼的带正电荷的甲基化的表观遗传标记。与4个残基所形成 的芳族笼的BPTF不同，CBX2具有开放的面结构。因此足够大的化合物 的芳族基团可以用于完成更常见的、通常用于甲基化Lys粘合剂的4面 芳族笼的形成。与BPTF相似，在部分甲基化的Lys27和化合物之间的 氢键可以实现CBX2,H3K27H[3,2,1]me[0,1,2]肽和重编程的化合物的三 体重编程复合体的稳定。芳族笼中此类氢键的缺失很可能引起CBX2对 K27me3标记的选择性亲和力。对表5中所示重编程的化合物而言，较大 的芳族部分的近端中氢受体的存在为关键组分，预示是干扰CBX2对三 甲基化组蛋白尾的自然亲和力的原因。化合物所提供的额外的氢受体基 序解释了包括靠近萘样部分的酮基序那些化合物比羟基基序的优越性。 相似的论点应用于包含R₂NH部分的化合物比包括R₄N部分的那些化合 物明显的优越性。如氢受体基序的第二侧翼组分的疏水部分也是重要的 并且可以通过Lys27me2侧链的长的碳氢化合物部分来解释。虽然激活位 点中芳族笼与赖氨酸甲基化氮相互作用，碳氢化合物Cβ、Cγ和Cδ对极 性的水介质是开放的。因此，预示的是相当大的部分，诸如CH₂Br或 CH₂Ph(在NSC14755的情况下)，覆盖了H3肽的这一区域并且额外地有 助于复合体的稳定性。

表5：候选的CBX2重编程的化合物

实施例8：化合物50的体外活性

各种EZH2基因突变的淋巴样恶性肿瘤已显示增加了三甲基化组蛋 白H3残基赖氨酸27(H3K27)中PRC2的活性。利用标准的方法，体外测 试化合物50它对三种淋巴瘤细胞系活力的影响。受试的细胞系为： DoHH-2(对EZH2,MEF2B和MLL2而言野生型)；WSU-DLCL2(EZH2突 变Y641F(对MEF2B和MLL2而言野生型))和DB(EZH2突变Y641N, MEF2B突变D83V和MLL2中的三个突变(其中两个导致了残基Q2736 之后截短体蛋白和第三个等位基因在残基P480处具有1个碱基对缺失))。

结果显示于图7中并且提示化合物50以剂量依赖的方式减少了所有 三种细胞系的活力，但是显示针对拥有EZH2Y641突变的细胞系 WSU-DLCL2有最高的活性。

实施例8：化合物50对小鼠移植瘤模型中肿瘤生长的影响

将WSU-DLCL2肿瘤片段皮下移植到雄性NSG小鼠的侧腹。移植时 小鼠为9.0-9.3周，当小鼠为12.9-13.1周时开始处理。每组使用8只小鼠 并且每天处理持续10天，在第12天评价。每4天通过卡尺测定肿瘤大 小，通过长×宽²/2计算肿瘤体积。

用媒介物(对照)、1mg/kg化合物50或4mg/kg化合物50通过腹腔 内注射处理小鼠组。媒介物为50％DMSO/50％PEG-400。

结果显示于图8中并且显示两种剂量的化合物50都能够减小肿瘤体 积。

实施例10：化合物51对淋巴瘤细胞系的增殖的影响

利用标准的方法体外测试化合物51(NSC2540)对四种淋巴瘤细胞系 活力的影响。受试的细胞系为DoHH-2,WSU-DLCL2,DB和SU-DHL-9 (EZH2野生型,MEF2B野生型,MLL2插入缺失)。

结果显示于图9中并且显示化合物51能够减少DoHH-2, WSU-DLCL2和SU-DHL-9细胞系的活力。

实施例11：小鼠移植瘤模型中化合物51对肿瘤生长的影响

将WSU-DLCL2肿瘤片段皮下移植到雄性NSG小鼠的侧腹。移植时 小鼠为5.3-9.4周，当小鼠为8.6-12.7周时开始处理。对照组中使用8只 小鼠，化合物51处理的组中使用6只小鼠。每天处理，持续10天，在 第12天评价。每4天通过卡尺测定肿瘤大小，通过长×宽²/2计算肿瘤 体积。

第一个5天内用4mg/kg媒介物(对照)或化合物51腹腔内注射处理小 鼠组并且在接下来的5天内用2mg/kg媒介物(对照)或化合物51腹腔内注 射处理小鼠组。媒介物为50％DMSO/50％PEG-400。

结果显示于图10中并且显示化合物51能够显著地减小肿瘤体积。

实施例12：化合物50和51对乳腺癌细胞系增殖的影响

利用标准的方法体外测试化合物50和51它们对四种乳腺癌细胞系 活力的影响。受试的细胞系为MCF-7,MDA-MB-231,HCC202(CRL-2316) 和HCC1500(CRL-2329)。

结果显示于图11中并且显示化合物51能够减少MDA-MB-231, HCC202(CRL-2316)和HCC1500(CRL-2329)细胞系的活力。

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