杂合型重编程Oct4联合多能干细胞因子表观重编程人脑胶质瘤细胞的研究

摘要

研究背景：
　　 脑胶质瘤(Glioblastoma)是神经外科最常见的一类肿瘤，其发病率占颅脑肿瘤的35.26％～60.96％（平均为44.69％），特别是分化不良的星形细胞胶质瘤预后很差，患者多于确诊后9～18个月死亡，严重危害人们的生活健康。虽然最近10年中，神经外科的诊疗技术有了很大的发展，但恶性脑胶质瘤的预后并未出现明显改善，患者的中间生存期仍未超过一年。胶质瘤的发病、发展及复发过程与基因(Genetic)及其表观遗传学(Epigenetic)改变密切相关。因此，更好地理解胶质瘤发病及发展的基因学及表观遗传学原理将有助于进一步揭示该病的发生及发展机制，并有助于发展新的治疗方案。
　　 诱导多能干细胞（InducedPluripotentstemcell，iPS细胞）技术一种基因重编程的干细胞技术，通过表观遗传重编程可重排成体细胞的表观遗传调控。iPS重编程技术在疾病的诊断和治疗方面已表现出很大的潜力，并改变了人们对疾病治疗的理念，使制造病人特异性和疾病特异性的干细胞成为可能。
　　 目前，iPS重编程技术的重编程效率很低，在正常成纤维祖细胞中仅为0.02％左右，在病理细胞中，特别是肿瘤细胞，其诱导效率更低，严重影响了iPS技术在临床应用等领域的推广应用。现阶段，将iPS技术应用于恶性肿瘤研究治疗的报道较少，还未有诱导颅脑肿瘤细胞重编程为iPS细胞的报道。
　　 本研究依据杂合型重编程因子(SyntheticReprogrammingFactor,sRF)假说，构建具有强激活效率的sRF-Oct4因子，以提高iPS的生成效率，并用于诱导脑胶质瘤细胞向iPS细胞转化，从而调控脑胶质瘤细胞的表观遗传网络，探讨脑胶质瘤在诱导前后的肿瘤性改变。
　　 实验目的：
　　 诱导多能干细胞（InducedPluripotentstemcell，iPS细胞）技术一种基因重编程技术，通过表观遗传重编程重排成体细胞的表观遗传调控。恶性人脑胶质瘤的发病、发展及复发过程与基因及其表观遗传调控紊乱密切相关。现阶段，iPS技术的表观重编程效率较低，特别是在肿瘤细胞中的效率更低，常规的iPS技术很难完全重排肿瘤细胞的表观遗传调控，且国内外还未有用iPS技术表观重编程胶质瘤细胞的报道。因此，本研究拟将强转录激活子pAD65引入经典重编程转录因子Oct4的结构中，构建新杂合型重编程因子(sRF-Oct4)，并应用诱导脑胶质瘤细胞U87-MG向iPS细胞转化，重排其表观遗传网络，并探讨诱导后的U87-MG的多能性变化及其肿瘤性改变，以期为下一步胶质瘤的机制研究和寻求新的治疗手段提供实验基础。
　　 方法：
　　 1)采用分子克隆技术用强激活子pAD65构建重编程转录因子Oct4(sRF-Oct4)，并用LipofectamineTM2000脂质体方法将重组质粒转染入293T细胞，检测sRF-Oct4在293T细胞中的表达情况;并应用pOct4-EGFP与sRF-OctT4共转染，通过荧光发光观察靶细胞下游基因激活情况;并用荧光素酶(Luciferase)技术检测sRF-Oct4对靶细胞下游调控元件的作用，间接评价其转录活性。
　　 2)采用LipofectamineTM2000脂质体法，包被sRF-Oct4、Oct4、Sox2、Klf4、c-myc及EGFP逆转录病毒质粒，并将质粒导入病毒包装EP2-293细胞系中，增殖相应逆转录病毒。
　　 3)采用浓缩后的病毒上清感染胶质瘤细胞U87-MG，感染后的靶细胞接种入鼠滋养层细胞(MouseEmbryonicFibroblast，MEF)中，置于干细胞培养环境中向iPS细胞诱导。
　　 4)将诱导为克隆状生长的iPS细胞移植入新的MEF中，继续培养，并稳定传代。将稳定传代后的iPS细胞收集处理，用逆转录-聚合酶链反应(Reversetranscription-polymeraseChainReaction，RT-PCR)技术检测iPS细胞下游基因的表达，并用Western-Blot技术检测其相应功能蛋白的合成情况。
　　 5)将未处理的U87-MG、诱导后的iPS细胞及U87-iPS分化的细胞分别接种入裸鼠体内，观察其成瘤情况，并将成瘤组织做病理切片。
　　 6)检测未处理的U87-MG及U87-iPS分化的细胞分别检测TIMP2及MMP-2的蛋白表达情况。
　　 结果：
　　 1)构建重组杂合型重编程因子sRF-Oct4，并与逆转录病毒载体结合，形成杂合型重组质粒，基因测序与预期使用设计结果一致。
　　 2)荧光素酶检测证明，杂合型重编程质粒sRF-Oct4与野生型Oct4对照，其转录活性明显高于野生型Oct4。
　　 3)经MEF及干细胞环境诱导SRF-Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc感染后的U87-MG细胞，3周后出现类iPS细胞的克隆团，并可分化传代;而经典Yamanaka因子诱导3周未见细胞克隆形成。
　　 4)RT-PCR检测诱导后的U87-iPS细胞显示干细胞相关基因Oct4、Nanog等表达增强;Western-Blot显示，诱导后的细胞干细胞相关蛋白Oct4、Nanog表达增强。
　　 5)诱导U87-iPS细胞接种诱导后的细胞到免疫缺陷小鼠体内，可生成畸胎瘤组织。
　　 6)诱导U87-iPS细胞自然分化后，其增殖活性低于正常U87-MG细胞，其肿瘤性下降可能与TIMP2及MMP-2信号通路改变相关。
　　 结论：
　　 整合转录激活子pAD65至杂合型重编程Oct4质粒中，可以提高经典干细胞重编程因子Oct4的转录活性;pAD-Oct4联合Sox2、Klf4及c-Myc因子包装逆转录病毒可将U87-MG细胞重编程为类iPS细胞，且重编程后的细胞经自然分化后增殖活性下降，肿瘤性降低。

目录

声明

摘要

第一部分 构建杂合型重编程Oct4因子并评估

1 概述

2 构建杂合型重编程Oct4因子

讨论

结论

参考文献

第二部分 重编程人脑胶质瘤细胞

1 概述

2 材料和方法

3 实验结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 表观重编程后的U87细胞的肿瘤性改变

1 概述

2 材料和方法

3 实验结果

讨论

结论

参考文献

综述

个人简历

在校期间发表学术论文及成果

致谢