一种生产香港牡蛎全三倍体的时间点定量处理方法

摘要

本发明公开了一种生产香港牡蛎全三倍体的时间点定量处理方法。本发明通过获取单体精卵、适时处理受精卵、检测幼虫倍性等技术环节，创造了一种以受精卵发育阶段作为生物学指标的时间点定量处理方法，可以获得100％香港牡蛎三倍体。本发明采用单体精卵优选、配对，有效的消除了以往牡蛎三倍体诱导过程中混合精卵同步性差的缺陷，获得的同步性较高的合子。本发明颠覆了传统上以30-50％出现第一极体作为处理时间点，处理20min为最佳时间段的固定思维模式；而是以受精卵发育阶段作为生物学指标，采用A+1/3B作为处理时间点，B+C作为处理时间段，回避了温度等外界环境条件对其处理的影响，可以成功的诱导出香港牡蛎全三倍体。

说明书

技术领域：

本发明属于海洋农业中贝类遗传育种技术领域，具体涉及一种生产香港牡蛎全三倍体的 时间点定量处理方法。

背景技术：

我国是牡蛎养殖大国，09-13年产量均在350-380万吨左右；而香港牡蛎(Crassostrea  hongkongensis)的产量在130万吨左右，它占牡蛎产量的30％，养殖贝类产量的12％，海水 养殖总产量的7％，世界产量的21％以上(中国渔业年鉴，2014)。香港牡蛎分布于我国的 广东、广西、福建，是暖温性近岸生长的一种经济价值很高的贝类，喜好高温低盐环境，其 肉味鲜美，富含蛋白质及其多种人体必需氨基酸，被誉为“海洋中的牛奶”，是一种重要的海 洋生物资源。它具有个体大、营养丰富等特点，深受广大消费者青睐；除鲜食、加工成蠔干、 蠔豉外，还是华南沿海牡蛎深加工高端产品(牡蛎高值提取物、牡蛎保健胶囊、牡蛎钙等) 的重要原料。

自Stanley等(1980)最早采用细胞松弛素B(CB)处理美洲牡蛎(C.virginica)受精卵， 得到8个月三倍体子代以来，贝类三倍体育种技术备受重视。三倍体贝类具生长快、个体大、 育性差、品质好、繁殖季节死亡率低等优势。之后在长牡蛎(C.gigas)(Allen等，1986； Guo等，1996；于瑞海等，2000；王昭萍等，2004；孔静等，2011)、食用牡蛎(Ostrea edulis) (Gendreau等，1990)、悉尼岩牡蛎(Saccostrea commercialis)(Nell，1995)和葡萄牙牡 蛎(C.angulata)(曾志楠等，1994)等牡蛎中也相继成功诱导出三倍体，但是几乎尚未见 到香港牡蛎多倍体育种的相关报道。

牡蛎多倍体诱导育种已经发展了30多年，学者们成功培育出长牡蛎四倍体，通过四倍体 与二倍体杂交获得全三倍体(Piferrer等，2009)。但是对于尚未获得四倍体的牡蛎物种而言， 直接诱导三倍体仍然是主要的多倍体生产方法，传统的诱导方法仍存在着倍化率不高，且可 操作稳定性较差等不足。

发明内容：

本发明的目的是为了解决传统三倍体制作方法中存在的诱导率较低，且倍化率不稳等缺 陷，从而提出了一种以受精卵发育阶段作为生物学指标的时间点定量处理方法，可以生产出 100％香港牡蛎三倍体。本发明具有操作简便、实用性强、高效易行等优点，这为香港牡蛎三 倍体培育及其四倍体生产奠定了坚实理论与实践基础。

本发明的生产香港牡蛎全三倍体的时间点定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、获取单体卵子：在香港牡蛎繁殖季节(4-8月)，以同一个地理群体的作为核心群体为 材料，选取成熟的3-5龄香港牡蛎雌性个体；以卵子数量和质量双重指标进行选择，挑选出 发育整齐，卵子数量≥5000万个，卵膜完整，卵黄积累呈现为深黄色的个体作为雌性亲本； 收集单体卵子，在盐度为15-20ppt海水中浸泡30-60min，待其生发泡破裂完全后，再用新鲜 盐度为15-20ppt海水清洗卵子，得到单体卵液。卵子反复利用新鲜海水清洗2-3次，其形态 为圆形或椭圆形；

b、获取单体精子：以a步骤中的核心群体为材料，筛选出2-3龄的雄性个体；之后对其 精子质量进行检测，筛选出显微镜下≥30％精子活动的个体，在盐度15-20ppt海水中激活 10-15min；之后再次镜检，以≥90％精子活动的个体作为雄性亲本，收集单体精子；

c、适时处理受精卵：将单体精子加入单体卵液中，控制每个卵子周边有3-8个精子，卵 子密度控制在≤5万个/mL，在此期间，温度控制在25-32℃，盐度控制在15-24ppt，其中， 从精子加入开始，至发现10％第一极体放出的时间段设置为A，从第一极体至发现10％第二 极体放出的时间段设置为B，从第二极体至发现10％卵裂个体的时间段设置为C，选择在 (A+1/3B)时间点采用常规方法处理受精卵，抑制受精卵第二极体排放，处理持续时间为 (B+C)，完后将其放置于正常海水中孵化，即可以获得香港牡蛎三倍体D形幼虫。

检测幼虫倍性：对于c步骤中获得初孵D形幼虫采用流式细胞仪进行倍性检测，发现所 有幼虫均处于三倍体状态，无二倍体及非整倍体产生。

其受精卵可以正常孵化、按照该物种的常规培育方法即可获得全三倍体子代。

所述的常规方法处理受精卵是指利用细胞松弛素B(CB)或6-二甲基氨基嘌呤处理受精 卵，不包括低渗、冷热温度休克及静水压等物理方法。

本发明不同传统牡蛎三倍体直接诱导方法，存在着以下主要创新点：①配对策略不同： 传统方法采用的混合精卵作为诱导对象，合子发育同步性较差；而本发明通过单体精卵配对， 合子同步性非常高，近乎一致。②处理时机不同：传统方法处理时间点在30-50％受精卵出 现第一极体，而本发明以受精卵发育阶段作为生物学指标，从受精开始至10％第一极体出现 记为时间段A，从第一极体至出现10％第二极体出现记为时间段B，从第二极体释放至出现 10％卵裂合子记为时间段C，在受精卵第一极体100％释放完毕，即处理时机控制在A+1/3B 效果最佳。③处理持续时间判断方法不同：传统方法处理持续时间固定为20min，使其在不 同环境的三倍体出现了较大幅度变化，且倍化率不稳定；而本发明以受精卵发育作为生物学 指标，以B+C时间段作为处理持续时间，一般为15-30min，有效的回避了温度、盐度等环境 因子对其发育的影响，保证了第二极体被有效的抑制在合子内，从而形成全三倍体。④获得 结果不同：传统方法诱导三倍体率在60-90％变化，经常出现非整倍体；而本发明三倍体率稳 定在100％，且无二倍体、四倍体及非整倍体出现。

本发明通过获取单体精卵、适时处理受精卵、检测幼虫倍性等技术环节，创造了一种以 受精卵发育阶段作为生物学指标的时间点定量处理方法，可以获得100％香港牡蛎三倍体。本 发明采用单体精卵优选、配对，有效的消除了以往牡蛎三倍体诱导过程中混合精卵同步性差 的缺陷，获得的同步性较高的合子。本发明颠覆了传统上以30-50％出现第一极体作为处理时 间点，处理20min为最佳时间段的固定思维模式；而是以受精卵发育阶段作为生物学指标， 采用A+1/3B作为处理时间点(100％第一极体释放完毕)，B+C作为处理时间段(15-30min)， 回避了温度等外界环境条件对其处理的影响，可以成功的诱导出香港牡蛎全三倍体。本发明 为香港牡蛎多倍体育种奠定了坚实的理论与实践基础。本发明具有操作简便，实用性强，高 效易行等优点。

附图说明：

图1为本发明的示意图。上半部分为传统方法，下半部分为本发明技术路线图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

a、获取单体卵子：于2013年6月下旬，在中国科学院南海海洋研究所湛江实验站本地 的香港牡蛎作为材料，选取成熟的3-5龄香港牡蛎雌性个体30个；以卵子数量和质量双重指 标进行选择，挑选出发育整齐，卵子数量平均为8000万个，卵膜完整，卵黄积累呈现为深黄 色的个体作为雌性亲本6个；收集单体卵子，在盐度为18ppt海水中浸泡45min，待其生发泡 100％完全破裂，获得卵子。卵子利用盐度为18ppt的新鲜海水反复清洗3次，获得单体卵液， 卵子均为圆形或椭圆形。

b、获取单体精子：以a步骤中的核心群体为材料，筛选出2-3龄的雄性个体若干个12 个；之后对其精子质量进行检测，筛选出显微镜下≥30％精子活动的个体，在盐度18ppt海水 中激活12min；之后再次镜检，以≥90％精子活动的6个个体作为雄性亲本，获取其单体精子。

c、适时处理受精卵：将6个单体精子加入6个单体卵液中，以每个卵子周边有3-8个精 子为宜，卵子密度为≤5万个/mL。在此期间，温度为29.6℃，盐度为18ppt。其中，从精子 加入开始，至发现10％第一极体放出的时间段设置为A(10min)，从第一极体至发现10％第 二极体放出的时间段设置为B(12min)，从第二极体至发现10％卵裂个体的时间段设置为C (9min)。选择在(A+1/3B)时间点，即受精后14min利用0.5mg/L细胞松弛素B(CB)处 理受精卵，抑制受精卵第二极体排放；处理持续时间为(B+C)，即处理21min后将其放置于 正常海水中孵化，即可以获得100％香港牡蛎三倍体D形幼虫。

d、检测幼虫倍性：对于c步骤中获得初孵D形幼虫采用流式细胞仪进行倍性检测，发 现所有幼虫均处于三倍体状态，无二倍体及非整倍体产生。在此之后，按照该物种的常规培 育方法饲养全三倍体子代。

实施例2

a、获取单体卵子：于2014年5月下旬，在中国科学院南海海洋研究所湛江实验站以珠 海群体的香港牡蛎作为材料，选取成熟的3-5龄香港牡蛎雌性个体25个；以卵子数量和质量 双重指标进行选择，挑选出发育整齐，卵子数量平均为12000万个，卵膜完整，卵黄积累呈 现为深黄色的个体作为雌性亲本5个；收集单体卵子，在盐度为20ppt海水中浸泡30min，待 其生发泡100％完全破裂，得到卵子。卵子利用盐度为20ppt的新鲜海水反复清洗3次，得到 单体卵液，卵子均为圆形或椭圆形。

b、获取单体精子：以a步骤中的核心群体为材料，筛选出2-3龄的雄性个体若干个10 个；之后对其精子质量进行检测，筛选出显微镜下≥30％精子活动的个体，在盐度20ppt海水 中激活15min；之后再次镜检，以≥90％精子活动的5个个体作为雄性亲本，获取其单体精子。

c、适时处理受精卵：将5个单体精子加入5个单体卵液中，以每个卵子周边有3-8个精 子为宜，卵子密度为≤5万个/mL。在此期间，温度为27.5℃，盐度为20ppt。其中，从精子 加入开始，至发现10％第一极体放出的时间段设置为A(12min)，从第一极体至发现10％第 二极体放出的时间段设置为B(15min)，从第二极体至发现10％卵裂个体的时间段设置为C (10min)。选择在(A+1/3B)时间点，即受精后17min利用0.5mg/L细胞松弛素B处理受精 卵，抑制受精卵第二极体排放；处理持续时间为(B+C)，即处理25min后将其放置于正常海 水中孵化，即可以获得100％香港牡蛎三倍体D形幼虫。

d、检测幼虫倍性：对于c步骤中获得初孵D形幼虫采用流式细胞仪进行倍性检测，发 现所有幼虫均处于三倍体状态，无二倍体及非整倍体产生。在此之后，按照该物种的常规培 育方法饲养全三倍体子代。

实施例3

a、获取单体卵子：于2014年5月上旬，在广西贝类综合试验站以茅尾海群体的香港牡 蛎作为材料，选取成熟的3-5龄香港牡蛎雌性个体27个；以卵子数量和质量双重指标进行选 择，挑选出发育整齐，卵子数量平均为6000万个，卵膜完整，卵黄积累呈现为深黄色的个体 作为雌性亲本9个；收集单体卵子，在盐度为16ppt海水中浸泡40min，待其生发泡100％完 全破裂，获得卵子。卵子利用盐度为16ppt的新鲜海水反复清洗3次，卵子均为圆形或椭圆 形。

b、获取单体精子：以a步骤中的核心群体为材料，筛选出2-3龄的雄性个体若干个15 个；之后对其精子质量进行检测，筛选出显微镜下≥30％精子活动的个体，在盐度16ppt海水 中激活10min；之后再次镜检，以≥90％精子活动的9个个体作为雄性亲本，获取单体精子。

c、适时处理受精卵：将9个单体精子分别加入9个单体卵液中，以每个卵子周边有3-8 个精子为宜，卵子密度为≤5万个/mL。在此期间，温度为25.4℃，盐度为16ppt。其中，从 精子加入开始，至发现10％第一极体放出的时间段设置为A(14min)，从第一极体至发现10％ 第二极体放出的时间段设置为B(18min)，从第二极体至发现10％卵裂个体的时间段设置为 C(12min)。选择在(A+1/3B)时间点，即受精后20min利用0.5mg/L细胞松弛素B处理受 精卵，抑制受精卵第二极体排放；处理持续时间为(B+C)，即处理30min后将其放置于正常 海水中孵化，即可以获得100％香港牡蛎三倍体D形幼虫。

d、检测幼虫倍性：对于c步骤中获得初孵D形幼虫采用流式细胞仪进行倍性检测，发 现所有幼虫均处于三倍体状态，无二倍体及非整倍体产生。在此之后，按照该物种的常规培 育方法饲养全三倍体子代。

实施例4

a、获取单体卵子：于2014年7月上旬，在广西贝类综合试验站以茅尾海群体的香港牡 蛎作为材料，选取成熟的3-5龄香港牡蛎雌性个体21个；以卵子数量和质量双重指标进行选 择，挑选出发育整齐，卵子数量平均为5000万个，卵膜完整，卵黄积累呈现为深黄色的个体 作为雌性亲本4个；收集单体卵子，在盐度为15ppt海水中浸泡60min，待其生发泡100％完 全破裂，获得卵子。卵子利用盐度为15ppt的新鲜海水反复清洗3次，卵子均为圆形或椭圆 形。

b、获取单体精子：以a步骤中的核心群体为材料，筛选出2-3龄的雄性个体若干个12 个；之后对其精子质量进行检测，筛选出显微镜下≥30％精子活动的个体，在盐度15ppt海水 中激活10min；之后再次镜检，以≥90％精子活动的4个个体作为雄性亲本，获得单体精子。

c、适时处理受精卵：将4个单体精子分别加入4个单体卵液中，以每个卵子周边有3-8 个精子为宜，卵子密度为≤5万个/mL。在此期间，温度为31.8℃，盐度为15ppt。其中，从 精子加入开始，至发现10％第一极体放出的时间段设置为A(8min)，从第一极体至发现10％ 第二极体放出的时间段设置为B(10min)，从第二极体至发现10％卵裂个体的时间段设置为 C(7min)。选择在(A+1/3B)时间点，即受精后11.3min利用450μmol/L的6-二甲基氨基嘌 呤(6DMAP)处理受精卵，抑制受精卵第二极体排放；处理持续时间为(B+C)，即处理17min 后将其放置于正常海水中孵化，即可以获得100％香港牡蛎三倍体D形幼虫。

d、检测幼虫倍性：对于c步骤中获得初孵D形幼虫采用流式细胞仪进行倍性检测，发 现所有幼虫均处于三倍体状态，无二倍体及非整倍体产生。在此之后，按照该物种的常规培 育方法饲养全三倍体子代。