一种生物传感器敏感膜及其在检测盐酸克伦特罗方面的应用

摘要

本发明公开了一种生物传感器敏感膜及其在检测盐酸克伦特罗方面的应用，该敏感膜是由以下方法制备的：1）将负载在玻璃基片上的金膜置于十八硫醇的乙醇溶液中，浸泡后冲洗并干燥，得第一自组装金膜；2）将第一自组装金膜置于氨基功能化石墨烯或羧基功能化氧化石墨烯与羊抗小鼠IgG的耦合物溶液中，浸泡后用磷酸盐缓冲液冲洗并干燥，得第二自组装金膜；3）将抗体溶液滴加到第二自组装金膜的表面进行抗体组装，使抗体覆盖第二自组装金膜表面，静置后，用磷酸盐缓冲液冲洗并干燥，即得。本发明的生物传感器敏感膜，通过盐酸克伦特罗抗原及其耦合物与抗体进行识别性结合，可对盐酸克伦特罗进行快速检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种生物传感器敏感膜，同时还涉及该生 物传感器敏感膜在检测盐酸克伦特罗方面的应用。

背景技术

近年来，随着食品安全问题引起的突发事件的频繁发生，食品安全问题已经引起了社 会各方面的广泛关注。快速、灵敏的检测食品中食物病原（沙门氏菌、弯曲杆菌、大肠杆 菌等）及食品污染物已经成为科研工作者面临的主要问题。

生物传感器是用固定化的生物体成分或生物体本身作为敏感元件的传感器，是一种将 生物化学反应能转换成电信号的分析测试装置。SPR生物传感器是基于表面等离子体共振 （SPR）技术的生物传感器。SPR对金属表面电解质的折射率非常敏感：不同电介质，其 表面等离子体共振角不同；同种电介质附在金属表面的量不同，则SPR的相应强度不同。 基于这种原理的生物传感器，通常将一种具有特异识别属性的分子，即配体，固定于金属 膜表面，监控溶液中的被分析物与该配体的结合过程。在复合物形成或解离过程中，金属 膜表面溶液的折射率发生变化，可以实时被SPR生物传感器检测出来。

SPR生物传感器所具有的优点使其成为食品安全研究中一种有效的分析工具。Ko利 用灵敏度增强SPR生物传感器将抗沙门氏菌抗体固定在芯片表面，利用修饰后的传感器芯 片对沙门氏菌进行了实时在线检测，结果表明，修饰后的SPR传感器可以用来检测沙门氏 菌等食源性致病菌。Leonard等利用SPR生物传感器，采用将抗体固定在芯片表面的方法 检测了李斯特杆菌，Leonard等认为在有合适抗体存在的情况下，该研究方法可以用来检 测复杂食物样品中的致病菌。Piliarik等利用高通量SPR生物传感器，在传感器芯片表面固 定DNA探针检测了布鲁氏菌、大肠杆菌和金黄葡萄球菌的特征核苷酸序列，该检测可以 在15分钟以内完成，为食源性致病菌的检测提供了一种快速简便的检测方法。除致病菌 外，食品中残留药物（如：三聚氰胺、氨苄青霉素、卡那霉素、毒素等小分子有害物质） 的检测也是食品安全的一个重要方面。Nedelkov利用SPR生物传感器-质谱联用技术检测 了牛奶和蘑菇中葡萄球菌肠毒素B的含量，该研究表明，SPR生物传感器-质谱联用技术 可以用做食品分析的有力工具。此外，SPR生物传感器还被用来检测肉毒毒素、黄曲霉毒 素、呕吐毒素、软骨藻酸、食品过敏原等小分子食品污染物。SPR生物传感器已经成为食 品快速、实时、在线分析的重要工具，广泛应用于食品安全领域。

20世纪80年代，美国科学家意外发现盐酸克伦特罗（俗称瘦肉精，是一种兴奋剂） 在提高猪肉瘦肉率上有较大效果，后来就有在饲料中添加一定量的盐酸克伦特罗的方法， 并作为科研成果在生猪饲养中推广运用。但是1994年以后，出现了一系列因食用猪肺、 肝而出现的盐酸克伦特罗中毒的事件，特别在广东、上海发生中毒人数较大的事件，使得 生猪盐酸克伦特罗的检测尤其重要，但是含有盐酸克伦特罗的猪肉，其肉的色香味与不含 盐酸特伦克罗的猪肉并无特别差异，人们靠肉眼无法进行辩识，只能依靠相关检测设备进 行检测。

现有技术中采用生物传感器对盐酸特伦克罗进行检测时，由于盐酸特伦克罗生物分子 量较小（313.7），直接将抗体固定在芯片表面检测盐酸克伦特罗的方法很难实现。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物传感器敏感膜，解决现有技术中将抗体固定在生物传感 器的芯片表面检测盐酸克伦特罗的方法很难实现的问题。

本发明的第二个目的是提供一种上述的生物传感器敏感膜在检测盐酸克伦特罗方面 的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种生物传感器敏感膜，是由以下 方法制备的：

1）将负载在玻璃基片上的金膜置于十八硫醇的乙醇溶液中，浸泡2～4h进行自组装， 取出后依次用乙醇、去离子水冲洗并干燥，得第一自组装金膜；

2）将步骤1）所得第一自组装金膜置于氨基功能化石墨烯或羧基功能化氧化石墨烯与 羊抗小鼠IgG的耦合物溶液中，在37℃条件下浸泡2～4h进行自组装，取出后用磷酸盐缓 冲液（PBS）冲洗并干燥，得第二自组装金膜；

3）将抗体溶液滴加到步骤2）所得第二自组装金膜的表面进行抗体组装，使抗体覆盖 第二自组装金膜表面，在25℃、相对湿度为40～60%RH的环境中静置1～2h后，用磷酸 盐缓冲液冲洗并干燥，即得。

步骤1）中所述负载在玻璃基片上的金膜是由以下方法制备的：将玻璃基片装在真空 蒸镀机中，用真空泵抽真空，使镀膜腔中的真空度达到1.3×10^-2～1.3×10^-3Pa，加热坩锅 使高纯度的金丝在1200℃～1400℃的温度下溶化并蒸发成气态金；气态金微粒在移动的玻 璃基片表面沉积，经冷却还原即在玻璃基片上形成一层连续而光亮的金膜。所述金膜的厚 度为47～50nm。

所述负载在玻璃基片上的金膜使用前经过预处理，所述预处理的方法是：将负载在玻 璃基片上的金膜放入H₂O₂与浓硫酸（质量浓度为98%）的体积比为3:7的混合溶液中浸泡 2～4min，取出后依次用乙醇、去离子水冲洗，干燥备用。

步骤1）中所述十八硫醇的乙醇溶液中，十八硫醇的浓度为0.28～0.8g/L。

步骤2）中所述氨基功能化石墨烯或羧基功能化氧化石墨烯与羊抗小鼠IgG的耦合物 溶液是由以下方法制备的：

a.将40体积份的浓度为1～5mg/ml的氨基功能化石墨烯或羧基功能化氧化石墨烯混 悬液加入400体积份的浓度为2～10mg/ml的羊抗小鼠IgG混悬液中，在18℃、280rpm条 件下震荡培养12～24h，得混合物A；

b.将步骤a所得混合物A离心水洗两次，得混合物B；

c.向步骤b所得混合物B中加入600体积份质量浓度为15%的聚乙二醇溶液，在15℃、 280rpm条件下振荡培养1.5～3h，得混合物C；

d.将步骤c所得混合物C离心水洗三次，再加入800体积份的磷酸盐缓冲液，即得耦 合物浓溶液；

使用时，将所得耦合物浓溶液按照6:100的比例进行稀释，即得氨基功能化石墨烯或 羧基功能化氧化石墨烯与羊抗小鼠IgG的耦合物溶液。

步骤b与步骤d中，所述离心水洗每次加水量为600体积份，每次离心水洗的时间为 10～20min，离心的转速为12500rpm。

所述氨基功能化石墨烯是由以下方法制备的：将氧化石墨烯分散到乙二醇中，使氧化 石墨烯的浓度为2.5mg/ml，超声2～4h后，得混合物D；按照氨水与乙二醇的体积比为1:40 的比例，将氨水加入混合物D中，在180℃条件下反应10～20h后，将反应产物真空抽滤 并水洗，得混合物E；将混合物E用蒸馏水透析48～96h以去除杂质粒子后，在60℃条件 下干燥24～48h，研磨并过滤，即得。所述过滤是采用500目筛网进行过滤。

所述羧基功能化氧化石墨烯是由以下方法制备的：将氧化石墨烯置于盐酸中浸泡24～ 48h后，离心并水洗至中性，真空干燥；将干燥后的氧化石墨烯配制成浓度为1mg/ml的悬 浮液；将NaOH和ClCH₂COONa按照NaOH、ClCH₂COONa与氧化石墨烯的质量比为 50:50:1的比例加入悬浮液中，超声2～4h，得混合物I；将混合物I调至中性，离心并水洗， 得混合物J；将混合物J用蒸馏水透析48～96h以去除杂质离子后，在60℃条件下干燥24～ 48h，研磨并过滤，即得。所述过滤是采用500目筛网进行过滤。

所述磷酸盐缓冲液（PBS）的pH为7.4，是由以下方法制备的：将8.0g的NaCl、0.2g 的KCl、1.15g的Na₂HPO₄（或2.89g的Na₂HPO₄·12H₂O)、0.2g的KH₂PO₄溶于1000ml 去离子水中，完全溶解后，在115℃高温灭菌10～15min，在4℃条件下储存备用。

步骤3）中所述抗体溶液为盐酸克伦特罗抗体溶液、莱克多巴胺抗体溶液、三聚氰胺 抗体溶液或沙丁胺醇抗体溶液。采用上述抗体溶液所得敏感膜可分别用于检测盐酸克伦特 罗抗原、莱克多巴胺抗原、三聚氰胺抗原、沙丁胺醇抗原。

一种上述的生物传感器敏感膜在检测盐酸克伦特罗方面的应用，所述抗体溶液为盐酸 克伦特罗抗体溶液，浓度为4～10μg/ml。

其检测方法包括下列步骤：

A.将盐酸克伦特罗（CLB）与辣根过氧化物酶（HRP）的耦合物按照1:1000的比例 稀释后，与标准浓度的盐酸克伦特罗按照体积比为1:1的比例混合，得样品A；

B.将所述生物传感器敏感膜安装到SPR生物传感器上，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液 以20μl/min的速度在线冲洗敏感膜，直至检测曲线基本稳定；

C.将样品A以10μl/min的速度进行在线吸附检测，待吸附稳定后，用磷酸盐缓冲液 以20μl/min的速度冲洗至稳定，即得盐酸克伦特罗检测曲线。

其中，加入盐酸克伦特罗与辣根过氧化酶的耦合物的目的为放大待测样品盐酸克伦特 罗的被检测信号，提高生物传感器敏感膜的检测灵敏度。

所述盐酸克伦特罗与辣根过氧化物酶的耦合物是由以下方法制备的：

i）将盐酸克伦特罗溶于0.5体积份的去离子水中，使盐酸克伦特罗的浓度为0.5～ 4mg/ml，再加入0.015体积份的盐酸（1M）和20体积份的NaNO₂溶液（1M），振荡混合， 得混合物F；

ii）将辣根过氧化物酶溶于1体积份的去离子水中，使辣根过氧化物酶的浓度为8～ 11.9mg/ml，再加入0.02体积份的NaOH溶液（1M），混合后冷却至4℃，得混合物G；

iii）将混合物F加入混合物G中，在280rpm条件下振荡培养2～4h，得混合物H；

iv）将混合物H在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中透析1～2天后，加入1体积份的乙二 醇，置于-20℃条件下储存备用。

本发明的生物传感器敏感膜，以金膜为基底，在金膜表面自组装小分子十八硫醇，通 过Au-S键将十八硫醇固定在金膜表面；然后将氨基功能化石墨烯或羧基功能化氧化石墨 烯与羊抗小鼠IgG的耦合物组装在其表面上，利用范德华力将氨基功能化石墨烯或羧基功 能化氧化石墨烯固定在金膜表面；最后将盐酸克伦特罗抗体吸附在氨基功能化石墨烯或或 羧基功能化氧化石墨烯表面上，氨基功能化石墨烯或或羧基功能化氧化石墨烯上的氨基能 与蛋白质含有的氨基、羟基、羧基缩合，从而实现抗体与石墨烯的结合。将该敏感膜用于 生物传感器，通过盐酸克伦特罗抗原及其偶合物与抗体进行识别性结合，可对盐酸克伦特 罗进行快速检测。检测时，将盐酸克伦特罗与克伦特罗耦合物的样品混合物流经敏感膜表 面，通过SPR传感器产生的相对响应值，来确定样品中盐酸克伦特罗的量；或是将敏感膜 放在盐酸克伦特罗与盐酸克伦特罗耦合物的样品混合物中培养，通过SPR扫描角度变化， 可快速测试样品中抗原的存在与否。

使用本发明的生物传感器敏感膜，可利用SPR技术对盐酸克伦特罗进行在位检测。其 中，羊抗小鼠IgG与氨基功能化石墨烯和盐酸克伦特洛的结合力均比较好，可以起到扩大 检测信号的作用；当检测物CLB溶液的浓度仅为10ng/mL，吸附量从40RU扩大为140RU。 比较氨基功能化石墨烯与羧基化功能化氧化石墨烯制备的敏感膜，浓度为10ng/mL的CLB 溶液在它们表面上的吸附量分别为155RU和140RU均具有良好的检测效果；采用的羧基 功能化氧化石墨烯制备的敏感膜对CLB的检测底线可达0.5ng/mL。本发明的检测方法， 检测底限更低，同时具有操作简单、节省时间、便于分析等优点。

本发明的生物传感器敏感膜还可用于石英晶体微天平（QCM）生物传感器和电化学生 物传感器上。

本发明采用电化学交流阻抗法对整个自组装过程和盐酸克伦特罗检测前后的电化学 性能变化进行了测试，同时采用高通量-表面等离子体谐振分析仪(HT-SPR)对自组装过程、 抗原与抗体结合进行在位动力学检测。结果表明，本发明的生物传感器敏感膜设计合理， 结构稳定，能对CLB进行快速敏感检测。

附图说明

图1为实施例1的生物传感器敏感膜的制备流程示意图；

图2为氨基功能化石墨烯的C1s的XPS图；

图3为氨基功能化石墨烯的N1s的XPS图；

图4为羧基功能化氧化石墨烯的C1s的XPS图；

图5为实施例3的自组装及检测过程的吸附动力学曲线图；

图6为不同敏感膜的SPR共振角变化图，

其中：a指敏感膜为Au；

b指敏感膜为Au-C₁₈SH；

c指敏感膜为Au-C₁₈SH-G-NH₂-IgG；

d指敏感膜为Au-C₁₈SH-G-NH₂-IgG-antibody；

e指敏感膜为Au-C₁₈SH-G-NH₂-IgG-antibody，同时在线检测盐酸克伦特罗；

图7为实施例1所得生物传感器敏感膜对不同浓度的盐酸克伦特罗溶液的连续检测过 程动力学曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

实施例1

本实施例的生物传感器敏感膜，如图1所示，是由以下方法制备的：

1）制备金膜：将2×2cm玻璃基片装在真空蒸镀机中，用真空泵抽真空，使镀膜腔中 的真空度达到1.3×10^-2Pa，加热坩锅使高纯度的金丝在1400℃的温度下溶化并蒸发成气态 金，气态金微粒在移动的玻璃基片表面沉积，经冷却还原即在玻璃基片上形成一层连续而 光亮的金膜，金膜厚度为47～50nm；

2）对负载在玻璃基片上的金膜进行预处理：将负载在玻璃基片上的金膜放入H₂O₂与 浓硫酸（质量浓度为98%）的体积比为3:7的混合溶液中浸泡2min，取出后依次用乙醇、 去离子水冲洗，干燥备用，记为Au；

3）称取0.0028g的十八硫醇溶于10ml的乙醇中，超声15min，制成十八硫醇的乙醇 溶液；

4）将预处理后的负载在玻璃基片上的金膜置于十八硫醇的乙醇溶液中，浸泡2h进行 自组装，取出后依次用乙醇、去离子水冲洗，并用洗耳球吹干，置于4℃条件下2h以上， 得第一自组装金膜，即金膜上组装小分子十八烷基硫醇，记为Au-C₁₈SH；

5）将步骤4）所得第一自组装金膜置于2ml的氨基功能化石墨烯（G-NH₂）与羊抗小 鼠IgG的耦合物溶液中，在37℃条件下浸泡2h进行自组装，取出后用磷酸盐缓冲液（PBS） 冲洗并吹干，得第二自组装金膜，即将氨基功能化石墨烯与羊抗小鼠IgG的耦合物组装在 第一自组装金膜，记为Au-C₁₈SH-G-NH₂-IgG；

6）将120μL、浓度为6μg/ml的盐酸克伦特罗抗体溶液滴加到步骤5）所得第二自组 装金膜进行抗体组装，使盐酸克伦特罗抗体覆盖第二自组装金膜表面，在25℃、相对湿度 为40%RH的环境中静置1h后，用磷酸盐缓冲液冲洗并通风干燥，再置于37℃条件下进一 步干燥1h，即得所述的生物传感器敏感膜，即盐酸克伦特罗抗体吸附在氨基功能化石墨烯 表面，记为Au-C₁₈SH-G-NH₂-IgG-antibody。

其中，所述氨基功能化石墨烯（G-NH₂）与羊抗小鼠IgG的耦合物溶液是由以下方法 制备的：

a.将40μL的浓度为1mg/ml的氨基功能化石墨烯混悬液加入400μL的浓度为2mg/ml 的羊抗小鼠IgG混悬液中，在18℃、280rpm条件下震荡培养12h，得混合物A；

b.将步骤a所得混合物A离心水洗两次，得混合物B；所述离心水洗每次加水量为 600μL，每次离心水洗的时间为10min，离心的转速为12500rpm；

c.向步骤b所得混合物B中加入600μL、质量浓度为15%的聚乙二醇（PEG）溶液， 在15℃、280rpm条件下振荡培养1.5h，得混合物C；

d.将步骤c所得混合物C离心水洗三次，再加入800μL的磷酸盐缓冲液，即得耦合 物浓溶液；所述离心水洗每次加水量为600μL，每次离心水洗的时间为10min，离心的转 速为12500rpm；

使用时，取120μL耦合物浓溶液稀释到2ml，即得氨基功能化石墨烯与羊抗小鼠IgG 的耦合物溶液。

其中，所述氨基功能化石墨烯（G-NH₂）是由以下方法制备的：将100mg氧化石墨烯 分散到40ml乙二醇中，超声2h后，得混合物D；将1ml氨水加入混合物D中，将反应体 系置于具有聚四氟乙烯衬底的反应釜中，在180℃条件下反应10h，将反应产物真空抽滤 并水洗，得混合物E；将混合物E用蒸馏水透析48h以去除杂质粒子后，在60℃条件下干 燥24h，研磨后用500目不锈钢筛网过滤，即得氨基功能化石墨烯。

本实施例的生物传感器敏感膜在检测盐酸克伦特罗方面的应用，所述抗体溶液为盐酸 克伦特罗抗体溶液，浓度为6μg/ml。

其检测方法包括下列步骤：

A.将盐酸克伦特罗与辣根过氧化物酶的耦合物按照1:1000的比例稀释后，与标准浓 度的盐酸克伦特罗按照体积比为1:1的比例混合，得样品A；

B.将所述生物传感器敏感膜安装到SPR生物传感器上，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液 以20μl/min的速度在线冲洗敏感膜，直至检测曲线基本稳定；

C.将样品A以10μl/min的速度进行在线吸附检测，待吸附稳定后，用磷酸盐缓冲液 以20μl/min的速度冲洗至稳定，即得盐酸克伦特罗检测曲线。

其中，加入盐酸克伦特罗与辣根过氧化酶的耦合物的目的为放大待测样品盐酸克伦特 罗的被检测信号，提高生物传感器敏感膜的检测灵敏度。

所述盐酸克伦特罗与辣根过氧化物酶的耦合物是由以下方法制备的：

i）将0.5mg的盐酸克伦特罗溶于0.5ml的去离子水中，再加入15μL的盐酸（1M）和 20μL的NaNO₂溶液（1M），振荡混合15min，得混合物F；

ii）将11.9mg的辣根过氧化物酶溶于1ml的去离子水中，再加入20μL的NaOH溶液 （1M），混合后冷却至4℃，得混合物G；

iii）将混合物F加入混合物G中，在280rpm条件下振荡培养2h，得混合物H；

iv）将混合物H在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中透析1天后，加入1ml的乙二醇，置 于-20℃条件下储存备用。

实施例2

本实施例的生物传感器敏感膜，是由以下方法制备的：

1）制备金膜：将2×2cm玻璃基片装在真空蒸镀机中，用真空泵抽真空，使镀膜腔中 的真空度达到1.3×10^-3Pa，加热坩锅使高纯度的金丝在1200℃的温度下溶化并蒸发成气态 金，气态金微粒在移动的玻璃基片表面沉积，经冷却还原即在玻璃基片上形成一层连续而 光亮的金膜，金膜厚度为47～50nm；

2）对负载在玻璃基片上的金膜进行预处理：将负载在玻璃基片上的金膜放入H₂O₂与 浓硫酸（质量浓度为98%）的体积比为3:7的混合溶液中浸泡4min，取出后依次用乙醇、 去离子水冲洗，干燥备用，记为Au；

3）称取0.0028g的十八硫醇溶于10ml的乙醇中，超声30min，制成十八硫醇的乙醇 溶液；

4）将预处理后的负载在玻璃基片上的金膜置于十八硫醇的乙醇溶液中，浸泡4h进行 自组装，取出后依次用乙醇、去离子水冲洗，并用洗耳球吹干，置于4℃条件下4h以上， 得第一自组装金膜，即金膜上组装小分子十八烷基硫醇，记为Au-C₁₈SH；

5）将步骤4）所得第一自组装金膜置于2ml的氨基功能化石墨烯（G-NH₂）与羊抗小 鼠IgG的耦合物溶液中，在37℃条件下浸泡4h进行自组装，取出后用磷酸盐缓冲液冲洗 并吹干，得第二自组装金膜，即将氨基功能化石墨烯与羊抗小鼠IgG的耦合物组装在第一 自组装金膜，记为Au-C₁₈SH-G-NH₂-IgG；

6）将120μL、浓度为8μg/ml的盐酸克伦特罗抗体溶液滴加到步骤5）所得第二自组 装金膜进行抗体组装，使盐酸克伦特罗抗体覆盖第二自组装金膜表面，在25℃、相对湿度 为50%RH的环境中静置2h后，用磷酸盐缓冲液冲洗并通风干燥，再置于37℃条件下进一 步干燥2h，即得所述的生物传感器敏感膜，即盐酸克伦特罗抗体吸附在氨基功能化石墨烯 表面，记为Au-C₁₈SH-G-NH₂-IgG-antibody。

其中，所述氨基功能化石墨烯（G-NH₂）与羊抗小鼠IgG的耦合物溶液是由以下方法 制备的：

a.将40μL的浓度为1mg/ml的氨基功能化石墨烯混悬液加入400μL的浓度为2mg/ml 的羊抗小鼠IgG混悬液中，在18℃、280rpm条件下震荡培养24h，得混合物A；

b.将步骤a所得混合物A离心水洗两次，得混合物B；所述离心水洗每次加水量为 600μL，每次离心水洗的时间为10min，离心的转速为12500rpm；

c.向步骤b所得混合物B中加入600μL、质量浓度为15%的聚乙二醇（PEG）溶液， 在15℃、280rpm条件下振荡培养3h，得混合物C；

d.将步骤c所得混合物C离心水洗三次，再加入800μL的磷酸盐缓冲液，即得耦合 物浓溶液；所述离心水洗每次加水量为600μL，每次离心水洗的时间为20min，离心的转 速为12500rpm；

使用时，取120μL耦合物浓溶液稀释到2ml，即得氨基功能化石墨烯与羊抗小鼠IgG 的耦合物溶液。

其中，所述氨基功能化石墨烯（G-NH₂）是由以下方法制备的：将100mg氧化石墨烯 分散到40ml乙二醇中，超声4h后，得混合物D；将1ml氨水加入混合物D中，将反应体 系置于具有聚四氟乙烯衬底的反应釜中，在180℃条件下反应20h，将反应产物真空抽滤 并水洗，得混合物E；将混合物E用蒸馏水透析96h以去除杂质粒子后，在60℃条件下干 燥48h，研磨后用500目不锈钢筛网过滤，即得氨基功能化石墨烯。

本实施例的生物传感器敏感膜在检测盐酸克伦特罗方面的应用，所述抗体溶液为盐酸 克伦特罗抗体溶液，浓度为8μg/ml。

其检测方法包括下列步骤：

A.将盐酸克伦特罗与辣根过氧化物酶的耦合物按照1:1000的比例稀释后，与标准浓 度的盐酸克伦特罗按照体积比为1:1的比例混合，得样品A；

B.将所述生物传感器敏感膜安装到SPR生物传感器上，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液 以20μl/min的速度在线冲洗敏感膜，直至检测曲线基本稳定；

C.将样品A以10μl/min的速度进行在线吸附检测，待吸附稳定后，用磷酸盐缓冲液 以20μl/min的速度冲洗至稳定，即得盐酸克伦特罗检测曲线。

其中，加入盐酸克伦特罗与辣根过氧化酶的耦合物的目的为放大待测样品盐酸克伦特 罗的被检测信号，提高生物传感器敏感膜的检测灵敏度。

所述盐酸克伦特罗与辣根过氧化物酶的耦合物是由以下方法制备的：

i）将0.5mg的盐酸克伦特罗溶于0.5ml的去离子水中，再加入15μL的盐酸（1M）和 20μL的NaNO₂溶液（1M），振荡混合15min，得混合物F；

ii）将11.9mg的辣根过氧化物酶溶于1ml的去离子水中，再加入20μL的NaOH溶液 （1M），混合后冷却至4℃，得混合物G；

iii）将混合物F加入混合物G中，在280rpm条件下振荡培养4h，得混合物H；

iv）将混合物H在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中透析2天后，加入1ml的乙二醇，置 于-20℃条件下储存备用。

实施例3

本实施例的生物传感器敏感膜，是由以下方法制备的：

1）制备金膜：将2×2cm玻璃基片装在真空蒸镀机中，用真空泵抽真空，使镀膜腔中 的真空度达到1.3×10^-2Pa，加热坩锅使高纯度的金丝在1400℃的温度下溶化并蒸发成气态 金，气态金微粒在移动的玻璃基片表面沉积，经冷却还原即在玻璃基片上形成一层连续而 光亮的金膜，金膜厚度为47～50nm；

2）对负载在玻璃基片上的金膜进行预处理：将负载在玻璃基片上的金膜放入H₂O₂与 浓硫酸（质量浓度为98%）的体积比为3:7的混合溶液中浸泡2min，取出后依次用乙醇、 去离子水冲洗，干燥备用，记为Au；

3）称取0.0028g的十八硫醇溶于10ml的乙醇中，超声15min，制成十八硫醇的乙醇 溶液；

4）将预处理后的负载在玻璃基片上的金膜置于十八硫醇的乙醇溶液中，浸泡2h进行 自组装，取出后依次用乙醇、去离子水冲洗，并用洗耳球吹干，置于4℃条件下2h以上， 得第一自组装金膜，即金膜上组装小分子十八烷基硫醇，记为Au-C₁₈SH；

5）将步骤4）所得第一自组装金膜置于2ml的羧基功能化氧化石墨烯（GO-COOH） 与羊抗小鼠IgG的耦合物溶液中，在37℃条件下浸泡2h进行自组装，取出后用磷酸盐缓 冲液冲洗并吹干，得第二自组装金膜，即将羧基功能化氧化石墨烯与羊抗小鼠IgG的耦合 物组装在第一自组装金膜，记为Au-C₁₈SH-GO-COOH-IgG；

6）将120μL、浓度为4μg/ml的盐酸克伦特罗抗体溶液滴加到步骤5）所得第二自组 装金膜进行抗体组装，使盐酸克伦特罗抗体覆盖第二自组装金膜表面，在25℃、相对湿度 为60%RH的环境中静置1h后，用磷酸盐缓冲液冲洗并通风干燥，再置于37℃条件下进一 步干燥1h，即得所述的生物传感器敏感膜，即盐酸克伦特罗抗体吸附在羧基功能化氧化石 墨烯表面，记为Au-C₁₈SH-GO-COOH-IgG-antibody。

其中，所述羧基功能化氧化石墨烯（GO-COOH）与羊抗小鼠IgG的耦合物溶液是由 以下方法制备的：

a.将40μL的浓度为1mg/ml的羧基功能化氧化石墨烯混悬液加入400μL的浓度为 2mg/ml的羊抗小鼠IgG混悬液中，在18℃、280rpm条件下震荡培养12h，得混合物A；

b.将步骤a所得混合物A离心水洗两次，得混合物B；所述离心水洗每次加水量为 600μL，每次离心水洗的时间为10min，离心的转速为12500rpm；

c.向步骤b所得混合物B中加入600μL、质量浓度为15%的聚乙二醇（PEG）溶液， 在15℃、280rpm条件下振荡培养1.5h，得混合物C；

d.将步骤c所得混合物C离心水洗三次，再加入800μL的磷酸盐缓冲液，即得耦合 物浓溶液；所述离心水洗每次加水量为600μL，每次离心水洗的时间为10min，离心的转 速为12500rpm；

使用时，取120μL耦合物浓溶液稀释到2ml，即得羧基功能化氧化石墨烯与羊抗小鼠 IgG的耦合物溶液。

其中，所述羧基功能化氧化石墨烯（GO-COOH）是由以下方法制备的：将氧化石墨 烯置于盐酸中浸泡24h后，在1250rpm转速条件下离心分离，水洗至中性，真空干燥；将 干燥后的氧化石墨烯配制成浓度为1mg/ml的悬浮液；将NaOH和ClCH₂COONa按照 NaOH、ClCH₂COONa与氧化石墨烯的质量比为50:50:1的比例加入悬浮液中，水浴超声 2h，得混合物I；将混合物I用稀盐酸调至中性，离心并用去离子水洗涤至产物充分分散， 得混合物J；将混合物J用蒸馏水透析48h以去除杂质离子后，在60℃条件下干燥24h， 研磨后用500目不锈钢筛网过滤，即得。

本实施例的生物传感器敏感膜在检测盐酸克伦特罗方面的应用，所述抗体溶液为盐酸 克伦特罗抗体溶液，浓度为4μg/ml。

其检测方法包括下列步骤：

A.将盐酸克伦特罗与辣根过氧化物酶的耦合物按照1:1000的比例稀释后，与标准浓 度的盐酸克伦特罗按照体积比为1:1的比例混合，得样品A；

B.将所述生物传感器敏感膜安装到SPR生物传感器上，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液 以20μl/min的速度在线冲洗敏感膜，直至检测曲线基本稳定；

C.将样品A以10μl/min的速度进行在线吸附检测，待吸附稳定后，用磷酸盐缓冲液 以20μl/min的速度冲洗至稳定，即得盐酸克伦特罗检测曲线。

其中，加入盐酸克伦特罗与辣根过氧化酶的耦合物的目的为放大待测样品盐酸克伦特 罗的被检测信号，提高生物传感器敏感膜的检测灵敏度。

所述盐酸克伦特罗与辣根过氧化物酶的耦合物是由以下方法制备的：

i）将0.5mg的盐酸克伦特罗溶于0.5ml的去离子水中，再加入15μL的盐酸（1M）和 20μL的NaNO₂溶液（1M），振荡混合15min，得混合物F；

ii）将11.9mg的辣根过氧化物酶溶于1ml的去离子水中，再加入20μL的NaOH溶液 （1M），混合后冷却至4℃，得混合物G；

iii）将混合物F加入混合物G中，在280rpm条件下振荡培养2h，得混合物H；

iv）将混合物H在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中透析1天后，加入1ml的乙二醇，置 于-20℃条件下储存备用。

实验例1

本实验例对实施例1所用氨基功能化石墨烯（G-NH₂）进行XPS测试，通过XPSpeak 软件对所得的图谱进行分峰，测试结果如图2、3所示。在G-NH₂的C1s图（图2）中， 含有四个的峰，约在284.7eV、286.3eV、287.8eV和285.7eV处，分别是对应C-C/C-H、 C-O、O-C=O和C-N四种基团；G-NH₂中的C/O元素含量比分别为0.55。除此之外，在 G-NH₂中还出现了明显的N1s信号，N元素的含量约为3.1%；通过对N1s分峰得到两个 峰，如图3所示，分别处在399.8eV和401.3eV处，对应于C-N/N-H和N-C=O，说明在 G-NH₂中不仅存在氨基基团，同时也存在一些酰胺基团。

实验例2

本实验例对实施例3所用羧基功能化氧化石墨烯（GO-COOH）进行XPS测试，通过 XPSpeak软件对所得的图谱进行分峰，测试结果如图4所示。从图4可以看出，在284.7eV 处为C-C基团，在286.3eV处为C-O基团，在287.7eV处为C=O基团，在287.8eV处为 O-C=O基团。

实验例3

实施例3的自组装过程及检测过程的吸附动力学曲线图，如图5所示。

在自组装有十八硫醇的金膜表面通过G-IgG、CLB抗体、CLB标准液时吸附动力学曲 线的变化如图5所示，由于吸附过程伴随有脱洗的发生，所以曲线存在一些波动，吸附曲 线较粗糙。实验检测采用的是在线循环吸附，且各种溶液的浓度均很小，因而吸附的量很 小。GO-COOH经过40多分钟的吸附，吸附量为100RU，被磷酸盐冲洗后吸附值降为73RU； 敏感膜对抗体的吸附量为70RU，经冲洗吸附量变为40RU；检测时，对盐酸克伦特罗的检 测值为130RU。

实验例4

本实验例对不同敏感膜的SPR共振角进行检测，结果如图6所示。

根据SPR检测原理可知，SPR能够实现的跟踪检测传感器芯片表面液体介质折射率的 变化，当金膜表面介质的厚度发生变化时，其对光的折射率也相应的发生变化，导致SPR 共振角改变。图5中a-d分别表示的是敏感膜为纯金膜及其依次组装上十八硫醇、氨基功 能化石墨烯与羊抗小鼠IgG耦合物、盐酸克伦特罗抗体的共振角图谱，e指敏感膜d在线 检测盐酸克伦特罗时的共振角图谱。从图5可以看出，与纯金膜相比，当金膜表面接有以 上物质后，SPR共振角所对应的扫描步长从3800降至28000，这表明自组装后金膜的厚度 逐渐增大，也验证了层层自组装行为的发生。

实验例5

本实验例采用实施例1所得生物传感器敏感膜利用连续检测的方法对盐酸克伦特罗进 行了检测，结果如图7所示。

不同浓度盐酸克伦特罗流过敏感膜表面所得到的连续检测曲线如图7所示，其中包括 4个连续检测过程。标准浓度盐酸克伦特罗与敏感膜表面剩余的抗体结合形成曲线上1～4 对应的上升部分。平台期对应通入缓冲液后盐酸克伦特罗从敏感膜表面解离的过程。由于 抗体从敏感膜表面解离的速度缓慢，短时间内无明显的解离下降信号。随着盐酸克伦特罗 浓度增加以及检测时间的延续，生物传感器表面的抗体与盐酸克伦特罗的结合逐渐达到饱 和。其在吸附动力学曲线上的表现是，0.5ng/mL时曲线变化明显，而随着后来浓度的增加， 曲线变化并不明显。这正是因为，敏感膜表面的抗体数量有限，随着检测的进行其变化越 来越不明显。因此，实施例1所得生物传感器敏感膜对盐酸克伦特罗的检测底线在0.5 ng/mL。

上述实施例及实验例中所用SPR生物传感器为HT-SPR-2005型生物传感器。