幼体和成熟柑橘植物的转化

摘要

本发明涉及用于幼体和成熟柑橘遗传转化的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明提供用于柑橘遗传转化的利用根瘤菌-介导的DNA投递的方法和组合物，以及通过任何DNA转移法，包括中华根瘤菌而提高成熟柑橘遗传转化频率的方法。从柑橘幼苗或或成熟柑橘植物的新形成芽(例如，来自嫁接在根茎上后成熟植物芽的新生芽或成熟植物的非常嫩的芽)的上胚轴制备的结间茎节通过在人工培养基诱导愈伤组织形成而预处理。基本上或完全除去在直接相邻的组织中的所有愈伤组织和任何发育分生组织区域，并且所述预处理的外植体随后通过中华根瘤菌或其他已知的方法转化。完整植物或嫁接于根茎上的芽随后从所述转化的细胞再生。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年8月26日提交的美国临时申请No.61/527,995的 优先权，此处将该申请整体通过述及并入本文用于所有目的。

电子提交文本文件的描述

将随同本文以电子方式提交的文本文件的内容通过述及整体并入本 文：一份计算机可读形式的序列表拷贝(文件名： INTE_007_01WO_SeqList_ST25.txt，记录日：2012年8月27日，文件大小 52kb)。

本发明的技术领域

本发明涉及植物生物技术领域。尤其，本发明涉及转化木本植物的方 法。在一些实施方案中，本发明涉及预处理成熟柑橘以使得能够大大提高 成熟柑橘的转化频率，由此通过利用根瘤菌菌种产生转基因的成熟柑橘植 物，幼芽和柑橘细胞。

发明背景

将此处所有出版物和专利申请通过述及并入，其范围如同每一篇独立 出版物或专利申请被详细和单独的通过述及并入一样。以下描述包括可能 有助于理解本发明的信息。其并非承认此处提供的任何信息是现要求保护 的发明的现有技术或与之相关，也并非承认任何明确或隐含引用的出版物 是现有技术。

永久的植物遗传修饰需要被称为转化的过程，将新的遗传物质引入所 述植物细胞基因组中。均一的，非-嵌合的，永久的植物遗传修饰需要新的 遗传物质引入所述植物细胞基因组中，随后从所述的一个细胞再生完整的 植物。均一的，非-嵌合的，永久的植物遗传修饰可以由新的遗传物质引入 所述核基因组，线粒体或叶绿体中而引起。由于每个细胞中存在细胞器的 多个拷贝，必须另外非常注意以确保所有所述细胞器为最初改变的细胞器 的直接后代。大多数植物转化因此能设计为靶向核基因组，并且需要新的 遗传物质整合入染色体中，在其中其成为新的，永久的基因座。

为了完成此，需要开发方法以引导DNA穿过一些物理障碍，具体地： 植物细胞壁，细胞膜和核膜。由于不同于具有极薄壁的动物细胞壁，植物 细胞壁值得特别提及，植物细胞壁形成由嵌在多糖和蛋白质的胶结物中的 纤维素原纤维组成的极厚(大约20纳米)的刚性结构。植物转化因此需要 不同于用于动物细胞转化的用于植物细胞壁穿透的专门的方法，其通常涉 及直接的DNA转移方法。

发明概述

本发明提供用于转化木本植物的方法。在一些实施方案中，本发明提 供用于转化柑橘类植物的方法。在一些实施方案中，所述柑橘类植物为幼 体植物或成熟植物。在一些实施方案中，所述方法包括组织预处理步骤。 在一些实施方案中，所述转化为直接转化，例如DNA-涂布的基因枪法(微 粒轰击)，或其他已知的直接转化方法。在一些实施方案中，所述转化为间 接转化，例如微生物-介导的转化。在一些实施方案中，所述间接转化通过 根瘤菌科菌种介导。在一些实施方案中，所述根瘤菌科菌种为土壤杆菌属 (Agrobacterium)菌种。在一些实施方案中，所述土壤杆菌属菌种为根癌 土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。在一些其它的实施方案中，所述根 瘤菌科菌种为非土壤杆菌属(Agrobacterium)微生物。在一些实施方案中， 所述非-土壤杆菌属微生物为中华根瘤菌属(Sinorhizobium)菌种。在一些 实施方案中，所述中华根瘤菌属菌种为苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。

本发明人已发现利用至少土壤杆菌属或非-土壤杆菌属间接转化方法 大大提高幼体和成熟柑橘的转化的组织预处理方法。在本发明的一个实施 方案中，苜蓿中华根瘤菌用于幼体和成熟柑橘的转化。在本发明的另一个 实施方案中，根癌土壤杆菌用于幼体和成熟柑橘的转化。本领域技术人员 可以使用利用根瘤菌科其他细菌的其他间接转化方法，也可以使用其他植 物细胞转化的直接方法，诸如DNA-涂布的基因枪法或其他已知的转化方 法。

在一些实施方案中，其中苜蓿中华根瘤菌用于幼体和成熟柑橘的转化， 得到的基于对选择试剂耐受的转化芽(在卡那霉素上培养的芽)的百分数 为约13％至约21％，约10％至约30％或约0.8％至约12.6％。在一些其他的 实施方案中，其中苜蓿中华根瘤菌用于幼体和成熟柑橘的转化，得到的基 于对选择试剂耐受的转化芽(在卡那霉素上培养的芽)的百分数范围为约 0.1％至50％；以及在一些实施方案中为约0.1％，约0.2％，约0.3％，约0.4％， 约0.5％，约0.6％，约0.7％，约0.8％，约0.9％，约1％，约2％，约3％， 约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％， 约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％， 约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％， 约29％，约30％，约35％，约40％，约45％或约50％。

在一些实施方案中，其中根癌土壤杆菌用于幼体和成熟柑橘的转化， 得到的具有对选择试剂耐受的转化芽(在卡那霉素上培养的芽)的百分数 为约4％至约16％，或至约17％。在一些其他的实施方案中，其中根癌土壤 杆菌用于幼体和成熟柑橘的转化，得到的基于对选择试剂耐受的转化芽(在 卡那霉素上培养的芽)的百分数范围为约0.1％至50％；以及在一些实施方 案中为约0.1％，约0.2％，约0.3％，约0.4％，约0.5％，约0.6％，约0.7％， 约0.8％，约0.9％，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％， 约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约 16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约 24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约35％，约 40％，约45％或约50％。

在某些实施方案中，用苜蓿中华根瘤菌或根癌土壤杆菌转化后的生根芽 (即，产生根的芽)的百分数为约2％至约5％，约1.5％至约5％或约2.7％至约 3.6％。在其他的实施方案中，用苜蓿中华根瘤菌或根癌土壤杆菌转化的生根 芽的百分数范围为约0.1％至约20％；以及在一些实施方案中为约0.1％，约 0.2％，约0.3％，约0.4％，约0.5％，约0.6％，约0.7％，约0.8％，约0.9％，约 1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，9％，约10％，约 11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％ 或约20％。

在某些实施方案中，用苜蓿中华根瘤菌或根癌土壤杆菌转化后的转基 因嫁接芽的百分数为约0.3％至约6％或约0.25％至约3.5％。在其他的实施 方案中，用苜蓿中华根瘤菌或根癌土壤杆菌转化的嫁接芽的百分数范围为 约0.1％至约20％；以及在一些实施方案中为约0.1％，约0.2％，约0.3％， 约0.4％，约0.5％，约0.6％，约0.7％，约0.8％，约0.9％，约1％，约2％， 约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，9％，约10％，约11％， 约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％或 约20％。

在一些实施方案中，所述预处理步骤包括在培养基上从柑橘植物的茎 节诱导愈伤组织形成。在一些实施方案中，所述茎节为从成熟柑橘植物新 出现芽(例如，来自嫁接在根茎上后成熟植物芽的新生芽或成熟植物的非 常嫩的芽)的上胚轴制备的结间茎节。在一些实施方案中，所述预处理步 骤进一步包括移除至少70％，至少80％，至少90％，至少99％或100％愈 伤组织和在直接相邻的组织中的任何发育分生组织区域。所述预处理的外 植体随后通过中华根瘤菌属或其他已知的方法转化。转化后，所述多个芽 培养物可以转移至选择培养基以区分转化的和未转化的细胞。随后从所述 转化的细胞再生完整的柑橘植物或将要嫁接至根茎上的芽。由于本发明可 用于转化成熟的柑橘，其通常抗拒甚至中等效率的转化，本发明提供了优 于现有方法的某些优点。

在一些实施方案中，本发明提供产生转化的幼体或成熟植物的方法， 包括：(a)在培养基上培养抗拒转化的非-分生组织柑橘组织以产生愈伤组 织；和(b)移除所述愈伤组织和所有分生组织。在一些实施方案中，所述 方法进一步包括(c)将核酸导入刚预处理的组织细胞中，由此产生包含所 述核酸的转化的细胞；和(d)从所述转化的细胞再生转化植物。所述组织 可以是从来自嫁接于根茎后的成熟柑橘植物芽的新生芽，成熟植物非常嫩 的芽或来自幼苗的结间上胚轴切除的结间的茎节。在一些实施方案中，所 述成熟的柑橘为商业上有价值的甜橙，诸如‘Hamlin’，‘Valencia’或 ‘Mid-Sweet’。在一些实施方案中，所述幼体柑橘为根茎，诸如‘Carrizo’。

在一些实施方案中，所述预处理培养基包含至少一种植物生长调节剂， 例如细胞分裂素。在另外的实施方案中，所述生长调节剂选自下组，6-糠 胺嘌呤(激动素)，6-苄基-氨基嘌呤(6-BAP)，6-二甲丙氨基-嘌呤(2ip)， 反式-6-(4-羟基-3-甲基丁-2-烯基)氨基嘌呤(玉米素)，TDZ，赤霉酸(GA)， IAA，NAA，麦草畏，2，3，5-T和2，4-D，及其功能衍生物。培养基中 生长调节剂的浓度在约0.01mg/L至约25mg/L之间，例如约0.02mg/L，约 0.04mg/L，约0.06mg/L，约0.07mg/L，约0.1mg/L，约0.2mg/L，约0.4mg/L， 约0.6mg/L，约0.8mg/L，约1.0mg/L，约2.0mg/L，约4.0mg/L，约6.0mg/L， 约8.0mg/L，约10.0mg/L，约12.0mg/L，约14.0mg/L，约16.0mg/L，约 18.0mg/L，约20.0mg/L，约22.0mg/L或约25.0mg/L。在一些实施方案中， 所述培养基中生长调节剂的浓度在约0.01mg/L至约10mg/L之间，约 0.01mg/L至约5mg/L之间或约0.05mg/L至约8mg/L之间。在一些实施方 案中，所述核酸通过微粒轰击、电泳法或电穿孔法，或利用属于根瘤菌科 的细菌导入细胞中。在一些实施方案中，所述核酸包含对所述双子叶植物 为异源的核酸。在一些实施方案中，所述核酸包含选择标记基因，例如编 码新霉素磷酸转移酶(nptII)活性的基因或编码具有GUS活性的多肽的基 因。在一些实施方案中，所述核酸为含有包含对所述植物异源的基因的核 酸的载体。

在又一些其它的实施方案中，所述方法的步骤(c)包括：选择包含转 化的成熟柑橘细胞的芽；在促进芽伸长的条件下培养所述芽以产生至少一 种转化的成熟柑橘的芽；并且随后培养所述至少一种转化的芽为成熟的转 化植物。例如，在将所述至少一种转化的芽嫁接培养在根茎上后所述至少 一种转化的芽成长为成熟的转化植物。在一些实施方案中，所述根茎从种 子培养而来。

在又一些其它的实施方案中，所述方法的步骤(c)包括：选择包含转 化的幼体柑橘细胞的芽；在促进芽伸长的条件下培养所述芽以产生至少一 种转化的幼体柑橘的芽；并且随后培养所述至少一种转化的芽为转化植物。 在一些实施方案中，在将所述至少一种转化的芽在促进根系形成的培养基 上培养后所述至少一种转化的芽成长为转化植物。

在又一些其它的实施方案中，所述方法的步骤(c)包括：选择包含转 化的幼体或成熟柑橘细胞的芽；在促进芽伸长的条件下培养所述芽以产生 至少一种转化的芽；克隆所述至少一种转化的幼体或成熟柑橘的芽；并且 随后通过将所述克隆嫁接在未转化的根茎上，或通过在促进根系形成的培 养基上培养所述克隆两者之一培养所述至少一种转化的芽为幼体或成熟的 转化植物。

本发明进一步提供通过以上任一方法产生的转化的柑橘植物部分或植 物细胞；以及通过以上任一方法产生的转化植物。在一些实施方案中，所 述转化植物为表达目的多肽的成熟的甜橙或幼体根茎。在一些实施方案中， 所述转化植物为表达具有抗-细菌活性的多肽的柑橘植物。本发明进一步提 供通过以上转化植物产生的种子，其中所述种子包含转化入所述柑橘植物 细胞培养物的核酸，以及从所述种子成长的植物。

本发明进一步提供产生包含转化的质体基因组的柑橘植物的方法，包 括：(a)在培养基上培养抗拒转化的非-分生组织柑橘组织以产生愈伤组织； 和(b)移除所述愈伤组织和所有分生组织。在一些实施方案中，所述方法 进一步包括(c)将核酸导入刚预处理的组织细胞的质体基因组中，由此产 生包含所述核酸的转化的细胞；和(d)从所述转化的细胞再生转化植物。 在一些实施方案中，所述转化细胞对转化质体基因组为同质的。在一些实 施方案中，所述植物对转化质体基因组为同质的。

在一些实施方案中，所述植物为木本双子叶植物。例如，所述植物为 芸香科(Rutaceae)成员。在一些实施方案中，所述培养基包含至少一种植 物生长调节剂，诸如细胞分裂素。在一些实施方案中，所述生长调节剂选 自下组，6-糠胺嘌呤(激动素)，6-苄基-氨基嘌呤(6-BAP)，6-二甲丙氨基 -嘌呤(2ip)，反式-6-(4-羟基-3-甲基丁-2-烯基)氨基嘌呤(玉米素)，TDZ， 赤霉酸(GA)，IAA，NAA，麦草畏，2，3，5-T和2，4-D。在一些实施 方案中，所述培养基中生长调节剂的浓度在约0.01mg/L至约25mg/L之间， 例如约0.02mg/L，约0.04mg/L，约0.06mg/L，约0.07mg/L，约0.1mg/L， 约0.2mg/L，约0.4mg/L，约0.6mg/L，约0.8mg/L，约1.0mg/L，约2.0mg/L， 约4.0mg/L，约6.0mg/L，约8.0mg/L，约10.0mg/L，约12.0mg/L，约14.0mg/L， 约16.0mg/L，约18.0mg/L，约20.0mg/L，约22.0mg/L或约25.0mg/L。在 一些实施方案中，所述培养基中生长调节剂的浓度在约0.01mg/L至约 10mg/L之间，约0.01mg/L至约5mg/L或约0.05mg/L至约8mg/L。所述核 酸可通过微粒轰击、电泳法或电穿孔法导入所述细胞中。在一些实施方案 中，所述核酸包含对所述双子叶植物为异源的核酸。例如，所述核酸为含 有包含对所述双子叶植物异源的基因的核酸的载体。

在一个方面，本发明提供用于转化柑橘植物细胞的方法，包括：(a) 至少将第一植物细胞与除土壤杆菌以外的细菌接触，所述细菌包含：(i) 包含Ti质粒的vir基因区域的第一核酸，其中所述vir基因区域用以将编码 目的序列的核酸以VirD2-依赖的方式导入所述植物细胞中；和(ii)包含有 效连接至目的核酸的一个或多个T-DNA边界序列；和(b)至少选择用目 的核酸转化的第一植物细胞，其中所述植物细胞为柑橘植物细胞。

在本发明的一些实施方案中，所述细菌可以是根瘤菌细胞。在某些实 施方案中，所述根瘤菌在合适的条件下生长以将通过所述根瘤菌细胞产生 多糖减到最低程度。所述根瘤菌细胞可以在接触所述植物细胞之前，在乙 酰丁香酮或诱导vir基因功能的其他化合物，诸如酚类化合物存在时生长。 所述根瘤菌细胞可以选自下组：根瘤菌属菌(Rhizobium spp.)、中华根瘤 菌属菌(Sinorhizobium spp.)、剑菌属(Ensifer spp.)、中间根瘤菌属菌 (Mesorhizobium spp.)、叶杆菌属菌(Phyllobacterium spp.)、苍白杆菌属 菌(Ochrobactrum spp.)和慢生根瘤菌属菌(Bradyrhizobium spp.)。在特 定的实施方案中，所述根瘤菌细胞为苜蓿中华根瘤菌。

在本发明提供的转化方法的另外的方面，转化的植物细胞可以包含在 来自柑橘种子的外植体中，例如来自幼苗、愈伤组织、细胞悬液、子叶、 上胚轴、分生组织或芽。所述外植体可以包括胚胎分生组织外植体；愈伤 组织；细胞悬液；子叶或来自叶、根或茎的组织。

在本发明提供的转化方法的另外的方面，转化的植物细胞可由来自成 熟柑橘植物的形成芽的外植体组成。所述外植体可以包括从柑橘幼苗或或 成熟柑橘植物的新形成芽(例如，来自嫁接在根茎上后成熟植物芽的新生 芽或成熟植物的非常嫩的芽)的上胚轴制备的非-胚胎结间茎节。所述外植 体可以包括其中所有分生组织被除去的非-胚胎结间茎节。

用于按照本发明转化的细菌可以包含例如通过电穿孔法或偶联导入的 核酸。所述序列可以包含对不依赖VirD2功能的偶联转移必须的核酸。所 述核酸可以包括第一和第二核酸。

在本发明另外的方面中，在此提供的转化方法可以包括在无选择试剂 时选择用目的核酸转化的植物细胞。选择用目的核酸转化的植物细胞可以 包括在选择试剂存在时培养所述植物细胞，其中所述目的核酸赋予对选择 试剂的耐受性或有效连接至赋予对选择试剂例如卡那霉素耐受性的另外的 核酸。在一些实施方案中，所述目的核酸包含选择、筛选或可计分标记基 因。这些遗传组分在此还作为功能性的遗传组分而被提及，因为其产生在 转化植物的鉴定中提供功能的产物或农艺学有用的产物。用作选择或筛选 手段的DNA可以在可再生的植物组织中起作用以产生赋予所述植物组织 对另外的有毒化合物抗性的化合物。许多筛选或选择标记基因是本领域已 知的并且可用于本发明中。对其提供抗性的可选择标记和基因的实例在 Miki和McHugh，2004中公开。用作选择、筛选或可计分标记的目的基因 包括但不限于gus、GFP(绿色荧光蛋白)、荧光素酶(LUX)、赋予对抗生 素如卡那霉素、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素、G418、氨基糖苷类、壮观 霉素、链霉素、潮霉素、博来霉素、腐草霉素、磺胺药物、链丝菌素、氯 霉素、氨甲喋呤、2-脱氧葡萄糖、三甲基甘氨醛、S-氨乙酸L-半胱氨酸、 4-甲基色氨酸、D-木糖、D-甘露糖、苄基腺嘌呤-N-3-葡糖苷酸酶耐受性的 基因、编码给予对除草剂如草甘磷(例如5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸盐合 酶(EPSPS))耐受性的酶的基因。也可以实施其他的选择程序，包括阳性 选择机制(例如使用大肠杆菌的manA基因，允许在甘露糖存在时生长)， 且其也落入本发明的范围内(也参见Miki和McHugh(2004))。在仍是 其他的实施方案中，所述目的核酸可以定义为不物理连接至筛选标记基因。 例如，所述标记基因和目的核酸可以是在从用目的核酸转化的植物细胞再 生的植物后代中遗传分离的。

根据本发明的细菌可至少含有包含另外的目的核酸的第三核酸，其中 所述柑橘植物细胞用所述第三核酸转化。在本发明的一些实施方案中，柑 橘植物可以从转基因的柑橘植物细胞再生，其中所述柑橘植物包含所述目 的序列。再生柑橘植物可包括从包含所述植物细胞的外植体诱导一个或多 个芽的形成，并且通过诱导根的形成或通过将新生芽嫁接在转基因的或非 转基因的根茎上，其中形成嫁接部并且所述嫁接芽包含目的核酸，至少将 新生芽培养为完整的能繁殖的植物。在某些实施方案中，所述根茎从柑橘 种子培养而来。在另外的实施方案中，所述根茎可从组织培养物培养并且 转移至土壤。在另外的实施方案中，通过塑料遮盖物保护所述嫁接芽和嫁 接部避免干燥、昆虫、微生物和其他的环境损害。

在另外的方面中，本发明提供选自下组的根瘤菌细胞：根瘤菌属菌 (Rhizobium spp.)、中华根瘤菌属菌(Sinorhizobium spp.)、剑菌属(Ensifer spp.)、中间根瘤菌属菌(Mesorhizobium spp.)、叶杆菌属菌(Phyllobacterium spp.)、苍白杆菌属菌(Ochrobactrum spp.)和慢生根瘤菌属菌 (Bradyrhizobium spp.)，所述细胞包含(i)包含Ti质粒的vir基因区域的 第一核酸，其中所述vir基因区域用以将编码目的序列的核酸以VirD2-依赖 的方式导入植物细胞中；和(ii)包含有效连接至编码目的序列的核酸的一 个或多个T-DNA边界序列。在一个实施方案中，所述细胞进一步定义为包 含筛选标记。在另外的实施方案中，所述根瘤菌细胞为苜蓿中华根瘤菌细 胞。

附图简述

下列图为本说明书的一部分并且被包括以进一步显示本发明的某些 方面。本发明可以通过参考所述图与本文呈现的具体实施方案的详细描述 相结合而更好地理解。

图1：pIPG955的示意图。LB，左T-DNA边界；RB，右T-DNA边 界。

图2：pIPG924的示意图。LB，左T-DNA边界；RB，右T-DNA边 界。

图3：利用抗-BC蛋白抗体显示BC表达的通过利用苜蓿中华根瘤菌 (SM955-16和SM955-17)以及根癌土壤杆菌(AGL1973-1、-2和-3)产 生的转基因的、自根‘Carrizo’的蛋白质印迹。

图4：利用抗-BC蛋白抗体显示BC表达的通过利用苜蓿中华根瘤菌 产生的转基因的成熟‘Hamlin’幼芽(MC-Sm955-2)和转基因的自根 ‘Carrizo’(sm955-1、-2、-12、-13、-14和-15)的蛋白质印迹。

图5：利用抗-BC蛋白抗体的，通过利用根癌土壤杆菌产生的转基因 的、成熟‘Hamlin’(MC-39)和成熟‘Valencia’(MC45，MC-56)幼芽 的蛋白质印迹。

图6：利用抗-BC蛋白抗体显示BC表达的通过利用苜蓿中华根瘤菌 产生的转基因的、成熟'Hamlin'(Ham-980-257和-269)和‘Valencia’ (Val-980-258))以及通过利用土壤杆菌产生的转基因的、成熟‘Hamlin’ (Ham-973-252)和‘Valencia’(Val-973-248)的蛋白质印迹。也显示了非 转基因的‘Hamlin’对照(Ham-C)和若干未表达‘Hamlin’逸野种(escapes) (Ham-973-270，980-260和-266)。

图7：pIPG973的示意图。LB，左T-DNA边界；RB，右T-DNA边 界。

图8：pIPG980的示意图。LB，左T-DNA边界；RB，右T-DNA边 界。

发明详述

以下为提供以帮助本领域技术人员实践本发明的发明详述。本领域的 普通技术人员可以在不背离本发明的精神或范围下对本文描述的实施方案 进行修饰和改变。

植物转化方法

已经报告了若干利用DNA的直接的植物转化方法。这些在历史上报告 的第一个为电穿孔法，其利用施加于含有植物细胞的溶液的电流(M.E. Fromm等.，Nature，319，791(1986)；H.Jones等.，Plant Mol.Biol.，13， 501(1989)和H.Yang等.，Plant Cell Reports，7，421(1988))。该技 术已几乎专门利用用酶处理以部分或完全除去厚细胞壁，形成原生质体的 植物细胞完成。有一些例外(Lee等.，1989；Chowrira等.，1998)，但这 些不导致完整转基因植物的再生。超声处理的使用为至今报告的提供植物 原生质体直接转化的另外的方法(Joersbo等.，1990)。如其它需要使用原 生质体的方法一样，该方法需要经历产生和保存植物原生质体，并且随后 在转化后将其再生为完整植物所必须的冗长的过程。即使在最佳环境中 (Potrykus，1990)，原生质体形成和再生是冗长的并且技术要求高的，并 且在许多植物品种中无法实现。即使组织是可再生的，常常得到的植物不 是能繁殖的。

第二种直接的转化方法，称为“基因枪轰击”，利用超细颗粒，通常为 涂布DNA的钨或金，并且随后以足够的力量喷射至植物组织表面上以使得 所述颗粒穿透植物细胞，包括厚细胞壁、膜和核膜，但至少不杀死其中的 一些(US5，204，253，US5，015，580)。所用的方法需要专门的装备和 昂贵的试剂。该方法的更严重的问题为进入特定细胞的每个颗粒通常涂布 有提供用于转化的DNA的多个拷贝，由此通常导致多倍DNA的插入 (Pederson等.，1997；Kohli等.，1998；Pawlowski&Somers，1998；Jackson 等.，2001)。多倍插入常常导致基因沉默并且插入数目越多基因表达水平越 低(Stoger等.，1998；Popelka等.，2003)。为了使该方法为实际目的工作， 需要冗长关注那些必须优化的因素的组合。这些包括：基因型特定的组织 培养(Shimada，1978)和转化应答(Iser等.，1999；Rasco-Gaunt等.，2001)， 培养起始时间外植体的品质和发育阶段(Armaleo等.，1990)，培养基组成 (Barro等.，1998)和培养条件，基因枪基因转移前后的培养期(Rasco- 憔悴的等.，1999)，组织培养物的渗透处理以降低基因枪基因转移期间的组 织损伤(Vain等.，1993)，转基因表达盒(Li等.，1997)，基因枪基因转移 系统和其具体的参数(Altpeter等.，1996)以及选择系统和其参数(Christou &Ford，1995)。很明显，需要更好的方法。

土壤杆菌-介导的植物转化涉及克隆在质粒上的DNA片断放置入活的 土壤杆菌细胞的第一步，其随后用于“感染”单独的活的植物细胞。该方 法因此为间接的转化方法，为本领域所熟知，并且当其工作时通常导致相 对稳定的转移DNA(T-DNA)插入植物中(Park等.2004)，插入基因的 稳定表达，常见的呈现正常表型的植物回收(Vidal等.，2003)，并且常常 在基因投递后观察到单个插入事件(Cheng等.，1997；Fang等.，2002)。 所述土壤杆菌感染方法需要附着于宿主植物细胞，其涉及非常特定的附着 过程，其为确定细菌特异性宿主范围的必要部分。附着于植物细胞是转化 必需的并且通过编码土壤杆菌基因的染色体介导(Lippincott和Lippincott， 1969；Douglas等.，1982)。

宿主范围还可以通过第二个独立的过程确定，其涉及Vir基因活化， 但Vir基因活化可通过利用乙酰丁香酮的化学诱导人工完成(Pitzschke1& Hirt，2010和其中的参考文献)。土壤杆菌的Vir基因位于称为肿瘤诱导(Ti) 质粒的200kb质粒上，其也编码用于菌株和菌种之间Ti质粒转移以及 T-DNA开始、进行和转移入所述植物细胞核的功能物，其在天然野生型菌 株中编码“致癌基因”，当在植物细胞中表达时，导致赘生物(Wood等.， 2001)。所述T-DNA通过两个边界区划界，称为右边界(RB)和左边界(LB)。 用于植物转化目的，所述天然的T-DNA通过除去在RB和LB内的肿瘤- 诱导基因而修饰(所述Ti质粒为“卸甲的”)，并且用目的基因替换。所述 T-DNA可以位于与携带方便DNA克隆的Vir基因的大质粒分离的质粒载体 上；所述系统称为T-DNA双元载体系统。

土壤杆菌中所述Vir基因的活化引起4型分泌系统的形成，其可以转 移来自细菌的毒力蛋白和附着于毒力蛋白的DNA，穿过植物细胞壁进入植 物细胞质，进入细胞核，并且最后在随机位点整合入核DNA中。VirD2基 因的活化尤其引起T-DNA的转移。位于两个边界之间的所有DNA转移入 植物细胞中。携带VirD2的质粒通过缺口T-DNA以产生在5'端共价连接 VirD2的单链转移DNA("T-链")而起作用。由VirE2基因编码的第二 Vir蛋白，包裹在T-DNA周围，并且所述整个蛋白-DNA复合物转移入植 物细胞中。VirE2和VirD2蛋白均编码核定位信号(NLS)序列，并且转移 入植物细胞质中后，这些NLS信号用来引导复合物至植物细胞细胞核，其 中T-链在土壤杆菌毒力蛋白和植物因子二者的帮助下整合到植物基因组 中。

土壤杆菌由此突破所有的三种物理障碍：厚细胞壁、细胞膜和核膜， 以导入DNA，并且所述方法是有文献记载的。许多专利涉及土壤杆菌介导 的转化以及特别设计用于土壤杆菌的特定的DNA投递质粒---例如， US4536475、EP0265556、EP0270822、WO8504899、WO8603516、US5591616、 EP0604662、EP0672752、WO8603776、WO9209696、WO9419930、 WO9967357、US4399216、WO8303259、US5731179、EP068730、WO9516031、 US5693512、US6051757和EP904362A1。这些参考文献举例说明了广泛的 而不是无限的土壤杆菌宿主范围，并且为其广泛应用的主要理由。

然而，由于单子叶植物没有天然宿主，单子叶植物，包括玉米、水稻、 小麦、大麦和甘蔗的土壤杆菌转化通常很难；许多非宿主双子叶植物种类 的感染同样极低并且为高度基因型依赖性的(Lee等.，2004)。例如，棉 花通过土壤杆菌的转化已基本上限于四倍体Coker栽培变种或紧密相关的 基因型(Gould和Megallus-cedeno，1997；Zapata等.，1999；Satyavathi 等.2002；Kategari等.2007)。至今没有报道利用任何方法的其他的四倍体 栽培变种或二倍体或本土棉花栽培变种的转化。此外，土壤杆菌比其它的 更加有效地感染一些植物组织。因此，覆盖土壤杆菌用途的大部分专利涉 及非常特定的方法以获得具体组织的转化，包括胚胎组织、愈伤组织、花 粉、顶端分生组织、花部分、种子和其他活的植物部分。例如，在上述引 用的棉花实例中，仅利用芽-尖转化方法。作为另外的实例，Zhong等. (2005)要求保护土壤杆菌或粒子轰击转化多个芽结构的用途，所述芽结 构从难以转化的南瓜、瓜、西瓜或向日葵种类的分生组织培养物诱导(美 国专利No.6，858，777)。对于所述组织没有任何利用非-土壤杆菌细胞的 教导或建议。

当出现或强行进行非宿主的土壤杆菌感染时，频率几乎总是比对宿主 的低得多。有时，强行进行所述感染的方法是未知的。这些指向对开发利 用非-土壤杆菌方法的更有效的植物转化方法的需求和必要性。

近年来所述的间接的植物转化方法利用统称为根瘤菌的植物相关细菌 的非-土壤杆菌群的活的成员(Broothaerts等.，2005，美国专利申请公开 20050289667；20050289672；US7888552和其中的参考文献)。根瘤菌与根 瘤菌目的土壤杆菌在相同的细菌科，并且包括根瘤菌属菌(Rhizobium spp.)、中华根瘤菌属菌(Sinorhizobium spp.)、剑菌属(Ensifer spp.)、中间 根瘤菌属菌(Mesorhizobium spp.)、叶杆菌属菌(Phyllobacterium spp.)、 苍白杆菌属菌(Ochrobactrum spp.)和慢生根瘤菌属菌(Bradyrhizobium spp.)。不同的根瘤菌呈现广泛的基因组差异，并且毫无疑问土壤杆菌和中 华根瘤菌属处于明显不同的种系发生进化枝(Galibert，F.等.2001；Wood 等.，2001)。重要的是，不同的根瘤菌也呈现显著不同的宿主范围，并且响 应不同的宿主-特异性分子信号(Long，2001)。Weller等.(2004，2005) 报道了含有根诱导(Ri)质粒，而不是Ti质粒的一些根瘤菌，包括根瘤菌 属种和苍白杆菌属种的菌株将DNA转移入(即转化)黄瓜和番茄植物中， 导致“发根”病。

可根据本领域所知进行分类，例如通过比较16S rDNA序列或其它分 类方法。很多根瘤菌属物种的野生型菌株通常能够在宿主植物例如豆科植 物(豆科(Fabaceae))的根组织中诱导固氮根瘤的形成。然而，特定植物 种使根生瘤的能力对于根瘤菌介导将DNA转移到植物种细胞中并不是必 需的。

Broothaerts等.，(2005)报道了通过利用添加至所述天然根瘤菌菌株的 双元Ti质粒转化系统的根瘤菌属种、中间根瘤菌和苜蓿中华根瘤菌菌株的 转化。转化限于拟南芥、烟草和水稻。近年来，Ye等.(US7888552)证 实了根瘤菌属种、中华根瘤菌属种和中间根瘤菌属种转化用土壤杆菌难以 转化的物种的用途。该专利限于大豆、芸苔、玉米和四倍体栽培变种Coker 棉花细胞。近年来，Wendt等.(2011)证实了根瘤菌属种、中间根瘤菌和 苜蓿中华根瘤菌转化马铃薯的用途。Broothaerts等.(2005)和Went等. (2011)均报道菌株-特异性优化为利用根瘤菌菌株转化植物组织所必需 的。

幼体柑橘利用土壤杆菌的转化被低转化效率所阻碍，而商品化的成熟 柑橘品种利用土壤杆菌的转化很少见以致于实际上无用。还没有报道通过 非-土壤杆菌菌株将DNA转移至柑橘细胞。因此，本领域存在对开发改善 的方法的极大需求，该方法允许利用任何手段，包括非-土壤杆菌菌株，并 且总的来说提高成熟柑橘和柑橘转化效率而对商业上重要的柑橘作物品种 诸如'Hamlin'和'Valencia'转化。可以通过本发明转化的另外的柑橘作物物种 包括甜橙、酸橙、葡萄柚、柠檬、来檬(Citrus aurantiifolia)、柚(Citrus maxima)、枸橼(Citrus medica)、柑桔(Citrus reticulata)、枳(Citrus trifoliata)、 金橘(Kumquats)、大翼橙(Papedas)、澳洲酸橙(Australian limes)和这 些物种的各种杂种、品种、变种和栽培变种。

所用的方法不必在供体或转化DNA或受体DNA中引入突变。所述遗 传改变必须由转化植物的后代稳定遗传。可以随后通过拿走多个转化植物 的切割物无性地或者通过种子有性地获得后代。用于植物繁殖的优选的方 法取决于所述物种；例如产果实的柑橘树几乎总是无性繁殖，虽然根茎几 乎总是由种子产生。

一些植物通常经由种子通过称为单性生殖的方法无性繁殖(Nogler， 1984)。单性生殖产生能繁殖的种子，其中所述胚胎完全得自母细胞而不是 雌雄配子的融合体以形成接合子。因此，单性生殖的胚胎具有与母本相同 的遗传成分。柑橘属和一些属于芸香科的紧密相关属的许多成员主要通过 珠心生胚的单性生殖而繁殖(Frost1943)。由于珠心胚胎通过常规的珠心 细胞有丝分裂而无性发育并且雄配子对其形成无贡献，珠心胚苗与母种亲 本相同。事实上，柑橘根茎的繁殖依赖来自珠心胚苗的无性植物的产生， 其使得单性生殖在柑橘根茎育种方案中成为最重要的并且高度保持特性的 一种(Garcia，R.1999)。

柑橘种子商业使用的唯一时间在根茎的产生中，并且随后唯一来自用 登记的根茎“母树”操作的专门的苗种场。‘Carrizo’枳橙是受偏好的根茎， 其为高度单性生殖的；来自‘Carrizo’的接合子胚胎(即，由遗传杂交产 生的那些)是极为珍贵的(‘Swingle’，1927)。很可能由于各种栽培变种 中花期的不同，即使是表现出比较高的(5％至10％)比例的接合子胚胎的 根茎，诸如‘Swingle’枳柚，大多数接合子胚胎经自体受精而非异花授粉 产生(Anderson等.，1991)。总的说来，根茎产生的栽培技术和单性生殖 特性通过根茎繁殖者的选择联合使得根茎远交非常稀罕。根茎操作务必清 除任何看起来不合标准的幼苗(其可能由自体受精，或非常罕见地由异花 授粉而产生；Anderson等.，1991)。

对比根茎产生，柑橘树幼芽产生果实的部分从不通过种子商业上繁殖， 在某种程度上是因为幼苗在突破幼年期前不会开花(因此不会产生果实)， 而该过程需要很多年。开花后，所述组织认为是“成熟的”。取决于品种， 成熟过程无论怎样需要五至十二年，并且这也适用接合子和珠心胚苗 (Clark，1983；Spiegel-Roy和Goldschmidt，1996)。因此代替从种子培养 产果实品种，柑橘的商业生产者总是嫁接称为幼芽的成熟的“取芽树”在 幼体根茎上，并且所述成熟的取芽树于是将在嫁接后第一年开花。也就是 说，所有商业的柑橘幼芽植物性地(即无性地)繁殖，因此所有都具有与 亲本相同的遗传成分。此包括可食用的肉质果和果皮，其也具有与亲本相 同的遗传成分。仅所述果实的种子具有遗传远交的可能性，且随后仅达到 品种为接合子而非单性生殖的程度(下段提及)。以所述果实产生的任何柑 橘种子对于繁殖目的是完全无用的，因为即使发芽，所述幼苗将是幼体且 多年保持如此。

已经实现利用土壤杆菌的幼体柑橘组织转化(Moore等.，1987；Cervera， 1998)，虽然取决于柑橘品种，频率为相对低的中度。然而幼体柑橘转化的 主要问题为那些转化的树在突破幼年期前不会开花。取决于品种，此使得 直至12年为止，不可能评估转基因树的果实品质、量和总的园艺性能。成 熟柑橘的转化为所述问题的一种可能的答案。然而，虽然一些幼体柑橘的 栽培变种通过当前利用土壤杆菌的方法的转化为低-中等频率的，目前仅有 的两个组(在西班牙和巴西)报道，且没有频率数据(Cervera等.，1998， 2008；Almeida等.，2003；Pena-Garcia等.，US6，103，955)，成熟柑橘 的转化极其困难。本发明之前，就发明人所知，成熟柑橘利用土壤杆菌的 转化在商业上仍然是不切实际的，并且没有报道利用任何其他转化方法的 柑橘转化。Pena-Garcia等.(US6，103，955)的方法需要将转化的成熟 柑橘体外微嫁接至体外栽培的柑橘砧木上的步骤，随后是将得到的体外微 嫁接的植物嫁接至其他柑橘砧木上或将体外培养植物移植入用于幼苗健化 的土壤中的另外的步骤。如本文公开的转化的成熟柑橘直接微嫁接至土壤 中的柑橘砧木根上节省了冗长且费时的步骤并且导致转化的树更快速的生 长，并且在US6，103，955中没有预期到或说明。

定义

提供以下定义以帮助本领域技术人员理解本发明的详细说明。

“选择标记”或“筛选标记”指核酸序列，其表达赋予便于含有其的 细胞、组织或植物鉴定的表型。

“转录”指从DNA模板产生RNA拷贝的过程。

“转化”指将外源核酸序列引入细胞或组织中的过程。转化可以是瞬 时的或稳定的。在稳定转化中，所述外源核酸的部分或全部结合入(例如 整合或稳定保持)核基因组DNA、质体DNA中，或能够在所述细胞核或 质体中自主复制。

“转基因的”指其中已经稳定转化外源核酸序列的生物体。

如此处所用的，说明书中和权利要求中用的动词“包括”和其变化形 式以其非-限制性的意义使用，表明包括该词后的项，但不排除没有具体提 及的项。

如此处所用的，术语“植物部分”指植物的任何部分，包括但不限于 芽、根、茎、种子、托叶、叶、花瓣、花、胚珠、苞叶、枝条、叶柄、结 间部、树皮、茸毛、分蘖枝、根茎、叶状体、叶片、花粉、雄蕊等等。生 长在一些培养基诸如土壤中的植物的两个主要部分常常称为“地上”部分， 也常常称为“芽”，和“地下”部分，也常常称为“根”。“新生芽”为那些 在最近的1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周中 在植物上以新的生长物出现的芽。

如此处所用的，术语“植物组织”指植物的任何部分。植物组织源自 其的植物器官的实例包括，但不限于叶、茎、根、块茎、种子、枝条、茸 毛、节结、叶腋、花、花粉、雄蕊、雌蕊、花瓣、花梗、柄、柱头、花柱、 苞叶、果实、树干、心皮、萼片、花粉囊、胚珠、肉茎、针状体、球果、 根茎、匍匐枝、芽、果皮、胚乳、胎盘、浆果、雄蕊和叶鞘。

植物茎通常分成结点和结间部。结点保留芽，其成长为一或多片叶、 花序(花)、根、其他的茎等等。结间部将一个结点与另一个间隔。“结间 茎节”指结间部的剪切段。

上胚轴”为子叶以上的胚芽。通常，上胚轴将发育为植物的叶。子叶 为植物种子内胚胎的一部分，在萌芽时可能成为幼苗的胚胎初生叶。

“嫁接”通过将两段活的植物组织连接在一起以使它们结合且形成功 能性植物，并且随后作为一种新的植物生长而产生。“幼芽”为形成新的植 物冠的植物的地上部分。“根茎”为植物的地下或下半部，有时包括将形成 新的植物根系的茎和一些枝条的部分。“嫁接部”为其中幼芽连接至根茎的 植物茎上的部位。嫁接于根茎的幼芽组织可以包括与根茎茎节大约相同直 径的茎节，并且包括叶，或在“取芽树”的情况下，可以小很多。取芽树 为来自所期望的幼芽品种的一年生枝的中部，用于提供用于嫁接的腋芽。 腋芽为在植物茎和叶柄连接处的胚芽。所述腋芽，源自幼芽且嫁接于根茎 上，将生成树的几乎全部的地上部分，除了在地上的根茎的茎部分。嫁接 幼芽形成可以光合支持根生长的茎和叶后，通常除去所有来自根茎的芽。 现今生长的大多数柑橘树由从取芽树嫁接至根茎的幼芽品种组成。嫁接后， “初生嫩芽”为从所述嫁接物，包括来自腋芽的嫁接物形成的最新的茎和 叶。

如此处所用的，短语“源自”指起源或来源，并且可以包括天然存在 的、重组的、未提纯的或纯化的分子。如本文在别处定义的，源自一个起 源或来源的核酸或氨基酸可以具有各种核苷酸改变或蛋白质修饰。

在一些实施方案中，本发明提供源自通过本文描述的组合物、方法和 系统产生的植物的品种。如此处所用的，术语“品种”指物种的细分，由 物种内的个体群组成，其形式上或功能上与其他类似的个体系列不同。

如此处所用的，术语“品种”或“栽培变种”指可以通过结构特征和 特性从相同物种内其他品种鉴定出的类似植物的群。如此处所用的术语“品 种”具有符合1972年11月10日、1978年10月23日和1991年3月19 日在日内瓦修订的1961年12月2日的用于新植物品种保护的国际公约 (UPOV条约)定义的相同的意思。因此，“品种”指最小已知等级的单个 植物学分类单位内的植物群，该群不管是否完全符合授予育种者权利的条 件，可以i)通过产生给定基因型或基因型组合的特性的表现而定义，ii) 通过至少一种所述特性的表现而与任何其他的植物群区分和iii)在其不变 的适用于繁殖方面被认为是一个单元。

在一些实施方案中，本发明提供源自通过本文描述的组合物、方法和 系统产生的植物的基因型。如此处所用的，术语“基因型”指个体细胞、 细胞培养物、组织、生物体(例如植物)或生物群的遗传组成。

在一些实施方案中，本发明提供源自通过本文描述的组合物、方法和 系统产生的植物的克隆。如此处所用的，术语“克隆”指遗传或源自单个 前体并且遗传上与其相同或实质相同的细胞、细胞群、部分、组织、生物 体(例如植物)或生物群。在一些实施方案中，所述克隆在包含至少一个 无性生殖步骤的方法中产生。

“外植体”或“母体植物”为在组织培养过程期间将要发育的细胞来 源。例如，外植体可以是来自顶端分生组织、末端芽、腋芽、不定芽、副 芽、拟末端芽、新生层、侧生分生组织、侧芽、植物生长芽、生殖芽、混 和芽、芽段、芽尖、茎节、来自茎的未成熟结节、侧条、籽苗、种子、开 始长出地面的芽、未成熟的花芽、花序、冠节、叶节或其任何部分的任何 节或群。“愈伤组织”为源自植物组织或外植体的未器官化的薄壁组织细胞 团。愈伤组织可以经由再生过程分化为完整的植物。

“木本植物”为具有坚硬木质化组织或木质部尤其是茎和芽的植物。 木本植物通常为多年生植物并且包括乔木、灌木和藤本植物。木本植物另 外的实例包括，但不限于果树、刺槐、桤木、白杨、山毛榉、桦树、香枫、 小无花果树、杨树、柳树、冷杉、松树、云杉、落叶松、雪松和铁杉。

“柑橘”为柑橘属或相关属的植物。柑橘属包括芸香科(Rutaceae)的 乔木和灌木。“成熟的柑橘”开花且结果。

术语“一”或“一个”指一个或多个实体；例如“一个基因”指一个 或多个基因或至少一个基因。同样地，术语“一”(或“一个”)，“一个或 多个”和“至少一个”在本文可互换使用。此外，不定冠词“一”或“一 个”引用的“一个要素”不排除存在一个以上要素的可能性，除非上下文 清楚地要求有一个且仅有一个要素。

如此处所用的，术语“杂交”、“杂交的”、“异花授粉”或“杂交育种” 指一株植物上一个花的花粉施加(人工地或天然地)至另一株植物上花的 胚珠(柱头)的过程。

如此处所用的，术语“载体”、“质粒”或“构建体”宽泛地指编码外 源核酸的任何质粒或病毒。所述术语也应当解释为包括便于核酸转移入病 毒粒子或细胞的非-质粒和非-病毒化合物，诸如例如，聚赖氨酸化合物等等。 所述载体可以是适合作为核酸，或其突变体投递至细胞的投递工具的病毒 载体，或所述载体可以是适于相同目的的非-病毒载体。用于DNA投递至 细胞和组织的病毒和非-病毒载体的实例为本领域所熟知，并且例如在Ma 等.(1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：12744-12746)中描述。

本发明提供用于商业上重要植物的细胞，诸如柑橘植物细胞，包括广 泛使用的‘Hamlin’和‘Valencia’幼芽和‘Carrizo’根茎通过中华根瘤菌 的有效的遗传转化的方法和组合物。本发明克服了本领域中相当大的限制， 包括成熟柑橘通过土壤杆菌的有限的转化效率，以及无法描述通常可用于 成熟柑橘植物，包括‘Hamlin’和‘Valencia’品种通过利用非-土壤杆菌 菌株的转化和再生的技术。例如，虽然对于一些植物种和品种已经实现除 土壤杆菌以外的细菌的使用，但转化频率低。

至今许多情况中已要求相当多的研究以应用甚至被更好地开发的转化 方法诸如土壤杆菌-介导的转化至不同植物品种。根瘤菌目内的不同物种呈 现不同的宿主范围和附着不同植物组织的不同能力。不同物种的植物常常 呈现相当大的生理学差异其影响遗传转化的可控制性。因此用于一种植物 物种转化的方法常常不能有效工作，即使有的话，转化其他植物及转化能 力并不必然如利用所述方法即使转化相关物种的能力那样可预期的。这对 于植物的细菌转化尤其正确，其涉及所用菌株和靶标植物细胞之间复杂的 生物化学的相互作用。根瘤菌与天然环境中的植物互相作用并且因此可以 表现出宿主-特异性，其影响对于许多作物物种是未知的。

因此，鉴定顺从根瘤菌-介导的转化的植物并且开发允许提高转化效率 的方法是非常重要的目的。本发明通过在一个实施方案中提供使用根瘤菌 科(例如根瘤菌或土壤杆菌)转化商业上重要的植物，诸如芸香科的成员 (例如柑橘)的技术克服了本领域的限制。芸香科成员，包括柑橘之前并 不知可通过根瘤菌转化。本发明还提供利用根瘤菌或土壤杆菌有效转化柑 橘植物的技术，包括幼体或成熟柑橘，其已知顺从通过土壤杆菌的转化， 但频率低。本发明还提供用于不同土壤杆菌的组织靶标的组织靶标转化的 方法。例如，土壤杆菌通常需要受伤部位以感染植物，根瘤菌目的一些其 他成员，包括根瘤菌科诸如中华根瘤菌属，经穿透植物组织的侵染线自然 感染植物根部，允许使用非-受伤组织作为转化靶标。

多数情况下的目的为将感染性的DNA试剂最佳传送入完整的、直立的 柑橘植物中。

本发明可以和任何合适的植物转化质粒或载体一起使用，其包含与以 足以赋予特定的所需特性的方式表达的一个或多个核酸一起，如上所述的 选择或筛选标记和相关的调控元件。本发明设想合适的农艺学目的的结构 基因的实例包括但不限于，用于疾病、昆虫或害虫耐受性、除草剂耐受性 的基因、用于质量改善的基因，所述质量改善诸如产率、营养增强、环境 或压力耐受性，或在植物生理学、生长、发育、形态、植物产品包括果实 催熟(美国专利No.5，512，466)、环境压力抗性(美国专利No.6，072， 103)、药物肽和分泌肽(美国专利No.6，812，379；6，774，283；6，140， 075；6，080，560)、改善的进行特性(美国专利No.6，476，295)、改善 的可消化性(美国专利No.6，531，648)和改善的风味(美国专利No.6， 011，199)方面合乎需要的改变。如本领域技术人员考虑到本公开所能理 解的，任何这些或其他的遗传要素、方法和转基因可与本发明一起使用。

或者，目的核酸可通过经基因沉默技术如共抑制、反义、RNAi、miRNA 的表达(天然的或设计的)、反作用siRNA的表达和核酶的表达而抑制内 源基因表达而影响这些表型(参见例如美国专利申请公开U.S. 20060200878)。

可通过本发明包括的方法导入的示例性的核酸包括，例如来自另一物 种的DNA序列或基因，或甚至源自或存在于相同物种中，但通过遗传工程 方法而不是标准的繁殖或育种技术结合入受体细胞中的基因或序列。然而， 术语“外源的”也意指通常不存在于转化细胞中，或者或许不是简单地以 转化DNA片段或基因中所发现的形式、结构等等存在的基因，或通常以所 希望的，例如已过表达而存在的基因。因此，所述术语“外源的”基因或 DNA是用来指导入受体细胞的任何基因或DNA片段，无论类似的基因是 否可能已经存在于所述细胞中。外源DNA包括的DNA类型可包括已经存 在于所述植物细胞中的DNA、来自另一个植物的DNA、来自不同生物体 的DNA或外部生成的DNA，诸如包含基因反义信息的DNA序列或编码基 因合成或改进型的DNA序列。

虽然已经如上描述了本发明的各种实施方案，很清楚的是其仅以例证， 而不是限制的方式存在。本发明不限于所述的组合物和方法，也不限于特 定的蛋白质或材料，本发明也不限于产品特定的等级或批量。因此，本发 明的宽度和范围将不会受上述示例性的实施方案限制，而仅应当根据以下 权利要求和其同等物而定义。

实施例

下列实施例包含用以证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应 该理解随后在实施例中公开的技术表示本发明人发现的技术在本发明的实 践中更好地起作用，并且因此可认为是组成了用于实践的更优模式。然而， 本领域的技术人员根据本说明书应当理解在不背离本发明的构思、精神和 范围时公开的特定实施方案中可产生许多变化并且仍然可获得类似的或同 样的结果。更具体地，很显然的是化学和生理学相关的某些试剂可以代替 本文所述的试剂，而将会获得相同的或类似的结果。所有对本领域技术人 员显而易见得所述类似的替换和修饰被认为在正如所述附加的权利要求所 定义的本发明的精神、范围和构思之内。

实施例1

中华根瘤菌属和土壤杆菌属菌株

苜蓿中华根瘤菌菌株1021携带高毒力质粒pTiWB3，其为源自具有附 加的宽宿主范围复制起点oriT的根癌土壤杆菌菌株C58的卸甲Ti质粒 (pEHA105)(Broothaerts等.，2005)并且获自CAMBIA(Canberra， Australia)。苜蓿中华根瘤菌菌株在TY(胰蛋白胨0.5％，酵母提取物0.3％ 和7mm氯化钙)培养基中培养。

根癌土壤杆菌菌株AGL1为AGL0的重组缺陷型(-recA)，其携带C58 背景的高毒力的卸甲的Ti质粒(pTiBo542)；并且获自G.Lazo(Lazo等.， 1991)。土壤杆菌属菌株在YEP(酵母提取物1％，蛋白胨1％和0.5％氯化 钠)培养基中培养。

实施例2

中华根瘤菌属和土壤杆菌属的转化

通过用冷却的去离子水和10％甘油洗涤TY培养基中的对数期培养物 而制备中华根瘤菌属感受态细胞，并且在-80℃贮藏。通过利用与0.5μg pIPG955混合的100μl解冻的苜蓿中华根瘤菌1021/pTWBi3感受态细胞通 过电穿孔法导入双元载体pipg955(图1)，并且在冰上孵育30分钟。混 合物转移入预冷的小玻璃管(1mm间隙)中并且利用Eppendorf2510电转 化仪(Hauppauge，NY)以1100伏特电穿孔。混合物转移入1ml TY培养 基中并且在28℃以150rpm振荡孵育16小时。200μl培养基涂布于含有 100μg/mL壮观霉素(以选择pIPG955)250μg/mL链霉素(以选择菌株 1021)以及150μg/mL卡那霉素(以选择pTWBi3)的TY琼脂平板上。平 板在28℃孵育3天。

通过用冷却的去离子水和10％甘油洗涤TY培养基中的对数期培养物 而制备土壤杆菌属感受态细胞，并且在-80℃贮藏。通过利用与0.5μg pIPG924混合的100μl解冻的根癌土壤杆菌AGL1/pTiBo542感受态细胞通 过电穿孔法导入双元载体pIPG924(图2)，并且在冰上孵育30分钟。混合 物转移入预冷的小玻璃管(1mm间隙)中并且利用Eppendorf2510电转化 仪(Hauppauge，NY)以1100伏特电穿孔。混合物转移入1ml YEP培养基 中并且在28℃以150rpm振荡孵育2小时。20μl培养基涂布于含有40μ g/mL卡那霉素以选择pIPG924的YEP琼脂平板上。平板在28℃孵育2天。

实施例3

双元转化载体

利用本领域技术人员所知的标准分子技术构建双元转化载体。制备质 粒构建体pIPG955(图1；SEQ ID NO：1)和pIPG980(图8；SEQ ID NO：4)用于非-土壤杆菌属菌株中。制备质粒构建体pIPG924(图2；SEQ ID NO：2)和pIPG973(图7；SEQ ID NO：3)用于土壤杆菌属菌株中。 所有构建体以pCAMBIA2301(Cambia，Canberra，Australia)为基础，且 所有都携带pVS1宽的宿主范围复制起点和用于在大肠杆菌中维持高拷贝 的pBR322复制起点。pIPG924通过pCAMBIA2301的双35S启动子用胭脂 碱合酶(nos)启动子的第一取代而构建，nos启动子用于驱动新霉素磷酸 转移酶基因(nptII)，其赋予卡那霉素抗性，用于柑橘中的选择。35S：：GUS 基因随后用来自甜菜黄色多形多核病毒(BYV)的核苷酸13499-13637 (Peremyslov等.，1999)的病毒外壳蛋白控制元件取代，所述核苷酸可操 作地融合到用过氧化氢酶内含子间隔的抗-细菌BC基因(参见美国专利No. 7，919，601和PCT/US08/70612，其在此作为参考引入)。pIPG973与pIPG924 相同，除了单个35S启动子用于取代pIPG924中的BYVP启动子。

与pIPG924类似地构建pIPG955，pCAMBIA2301的双35S启动子用 驱动nptII基因的nos启动子取代，其赋予柑橘中的选择，随后用BC：：内 含子片断和由单个35S启动子可操作地驱动的富含甘氨酸的肽(GRP)前 导序列取代GUS基因。此外，细菌卡那霉素抗性基因用来自用于携带 pTWBi3的非-土壤杆菌菌株中的pCAMBIA1105的壮观霉素抗性基因片断 取代。pIPG980与pIPG955相同，除了缺失GRP前导序列，且内含子移至 BC基因的远下游。

pIPG955通过电穿孔法转移入苜蓿中华根瘤菌/pTWBi3并且通过小量 制备DNA的PCR分析确定。pIPG924通过电穿孔法转移入根癌土壤杆菌 AGL1/pTiBo542并且通过类似的PCR分析确定。

实施例4

来自中华根瘤菌属的双元和卸甲Ti辅助质粒的提取

卸甲Ti辅助质粒，pTWBi3和pTiBo542，与双元质粒pIPG955和 pIPG924一起，分别从苜蓿中华根瘤菌1021和根癌土壤杆菌AGL1提取。 简要地，5ml具有卡那霉素150mg/l、链霉素250mg/l和壮观霉素100mg/l 的TY过夜培养物离心，重悬浮于250μlP1缓冲液中，与250μlP2缓冲液 混合，并且用350μl P3缓冲液中和(缓冲液来自QIAGEN maxi-prep试剂 盒)。在室温下温育5分钟后，以12，000g在4℃离心混合物10分钟。大 约750μl上清液与750μl异丙醇混和并且在4℃离心10分钟。用70％乙 醇洗涤片状沉淀物一次并且不经干燥重悬浮于50μlTE中。质粒制备物随 后在4℃贮藏。质粒DNA用作用于利用Broothaerts(2005)所述的方法 PCR分析的模板。pIPG955和pIPG924质粒再转化入大肠杆菌中，随后以 更高拷贝提取质粒并且测序插入物以确定经由苜蓿中华根瘤菌或传代后的 稳定性。

实施例5

苜蓿中华根瘤菌-介导的幼体柑橘转化

从佛罗里达州合格种子生产者获得柑橘栽培变种‘Carrizo’种子并且 表面杀菌的‘Carrizo’种子用于苜蓿中华根瘤菌-介导的转化。为了表面杀 菌所述种子，通过人工剥皮除去外种皮，且剥皮的种子随后置于70％异丙 醇中2-3分钟。倒掉异丙醇且加入100ml0.6％次氯酸钠溶液10分钟。倒掉 氯溶液且所述种子用无菌去离子水漂洗3次。种子在纸巾上吸干且1-2颗 种子置于8"(大的)无菌试管中大约6ml的固化萌芽培养基上。萌芽培 养基由0.5X MS盐、1.5％蔗糖和0.7％琼脂组成，pH5.7。种子随后允许在 26℃萌芽且在暗的温箱中生长。来自4-5周老的培养物的黄化的柑橘幼苗 用作外植体来源。

在无菌条件下通过从黄化幼苗剪切大约1cm长的上胚轴节制备外植 体。上胚轴节用预浸培养基(由0.5X MS盐、8％麦芽糖、0.05％MES、足 够强度MS维生素组成，pH5.7)在室温下覆盖30分钟。

预浸后，倒掉培养基，代之以如下制备的苜蓿中华根瘤菌细菌悬浮液 覆盖所述外植体20分钟：从具有卡那霉素150mg/l和壮观霉素100mg/l的 TY培养基中的单个克隆培养20ml包含pIPG955的苜蓿中华根瘤菌 /pTWBi3过夜起始培养物。通过3000X离心10分钟收集细胞，并且用番 茄转化(TMT)培养基(1X MS盐，3％蔗糖，pH5.8-CH加100μM乙酰 丁香酮漂洗2-3次。细胞重悬浮于大约50ml TMT+100μM乙酰丁香酮中， 细胞密度调整为O.D.＝1.0，并且轻轻振荡30-60分钟。

倒掉苜蓿中华根瘤菌悬浮液，并且吸干接种的外植体且置于混合细胞 培养平板上，在连续暗的条件下25℃孵育约9-12天。在此期间，呈现苜蓿 中华根瘤菌过度生长的外植体置于新鲜的混合细胞培养平板上。混合细胞 培养培养基由1X MS盐、3％蔗糖、足够强度MS维生素、1mg/l BAP、0.5mg/l NAA、0.7％琼脂组成，pH5.7。

暗温育后，外植体转移至具有卡那霉素选择的再生培养基(1X MS盐、 3％蔗糖、足够强度MS维生素、1mg/l BAP、0.5mg/l NAA、250mg/l氨噻 肟头孢菌素、25mg/l硫酸卡那霉素、0.7％琼脂、pH5.7)并且在26℃暗中 维持另外的3-6天，至暗中总共15天。平板随后转移至具有16/8小时光照 -黑暗光照周期的生长室于26℃15-30天直至芽形成。具有芽的外植体随后 转移至芽伸长培养基表面上(1X MS盐、3％蔗糖、足够强度MS维生素、 0.5mg/l BAP、0.1mg/l NAA、250mg/l氨噻肟头孢菌素、25mg/l硫酸卡那霉 素、0.7％琼脂，pH5.7)。从所述外植体移去伸长至大于1cm长度的芽并且 转移至生根培养基1[0.25X MS盐、2％蔗糖、1/4强度MS维生素、5mg/l IBA (吲哚-丁酸)、0.5mg/l NAA、250mg/l氨噻肟头孢菌素、0.7％琼脂，pH5.7] 于26℃在16/8小时光照-黑暗光照周期下7-10天。

芽随后转移至生根培养基2平板(0.25X MS盐、2％蔗糖、1/4强度 MS维生素、250mg/l氨噻肟头孢菌素、0.7％琼脂、pH5.7)于26℃在16/8 小时光照-黑暗光照周期下7-20天。生根的芽随后又转移至标准试验试管中 (所述试管中约3”培养基)的生根培养基2以允许根生长。根为大约2" 长后，植物转移至土壤并且用塑料覆盖所述罐以保持高湿度约1周时期。 随后在观察到旺盛生长后除去塑料。植物保持另外的3周直至产生多片叶。 除去一片叶用于蛋白质提取并且通过蛋白质印迹测试转基因的表达。生根 的秧苗转移至温室用于进一步生长和测试。

基于蛋白质印迹分析，苜蓿中华根瘤菌将携带所需转基因BC的 T-DNA投递入幼体柑橘‘Carrizo’细胞，产生表达所述所需转基因的完全 转基因的、生根的‘Carrizo’柑橘植物(图3和表1)。通过以起始外植体 数目1.5至4.7％范围的频率的直接转化方法，转基因生根的幼体柑橘植物 获自苜蓿中华根瘤菌-介导的转化实验。这些柑橘植物的转基因性质通过蛋 白质印迹证实。

表1.苜蓿中华根瘤菌-介导的幼体柑橘转化总表。

实验批次# 12/30 12/20 01/03 起始#外植体 206 116 193 #卡那霉素上的芽 26(13％) 15(13％) 41(21％) #生根的芽 3(1.5％) 2(1.7％) 9(4.7％)

实施例6

利用没有分生组织的预处理的外植体的苜蓿中华根瘤菌-介导的幼体 柑橘转化

如实施例5所述从佛罗里达州合格种子生产者获得柑橘栽培变种 'Carrizo'种子，表面杀菌并且在黑暗中萌芽。来自4-5周老的培养物的黄化 的柑橘幼苗用作外植体来源。

在无菌条件下通过从黄化幼苗剪切大约1cm长的上胚轴节制备外植 体。上胚轴节用预浸培养基(由0.5X MS盐、8％麦芽糖、0.05％MES组成， pH5.7)在室温下覆盖30分钟。

预浸后，倒掉培养基并且吸干外植体且转移至无选择的再生培养基(1X MS盐、3％蔗糖、足够强度的MS维生素、1mg/l BAP、0.5mg/l NAA、250mg/l 氨噻肟头孢菌素、0.7％琼脂，pH5.7)并且在26℃黑暗中维持，直至在所 述外植体剪切面上观察到愈伤组织(约15天)。选择表现出愈伤组织形成 的外植体，并且在如实施例5中正确描述的那样制备的苜蓿中华根瘤菌接 种体中，利用剪切之前浸渍的解剖刀完全除去已形成的任何愈伤组织和分 生组织。随后吸干外植体并且转移至混合细胞培养平板上，在连续暗的条 件下25℃孵育约9-12天。在此期间，呈现苜蓿中华根瘤菌过度生长的外植 体置于新鲜的混合细胞培养平板上。混合细胞培养培养基由1X MS盐、3％ 蔗糖、足够浓度MS维生素、1mg/l BAP、0.5mg/l NAA、0.7％琼脂组成， pH5.7。

所有随后的再生步骤，包括芽出现和生根，如实施例5所述正确地进 行。

基于蛋白质印迹分析，利用该预处理方法，苜蓿中华根瘤菌将携带所 需转基因BC的T-DNA投递入幼体柑橘‘Carrizo’细胞，产生表达所述所 需转基因的完全转基因的、生根的‘Carrizo’柑橘植物(图3和表1)。通 过以起始外植体数目2至5％范围的频率的预处理方法，转基因生根的幼体 柑橘植物获自苜蓿中华根瘤菌-介导的转化实验。这些柑橘植物的转基因性 质通过蛋白质印迹证实。

表2.苜蓿中华根瘤菌-介导的幼体柑橘转化总表(预处理方法)。

实验批次# 03/23 04/29 起始#外植体 80 500 #卡那霉素上的芽 24(30％) 49(10％) #生根的芽 4(5％) 10(2％)

实施例7

对比的根癌土壤杆菌-介导的幼体柑橘转化

为了比较利用苜蓿中华根瘤菌和用相同的方法对相同的组织，但代之 以利用土壤杆菌属而获得的转化频率，根癌土壤杆菌AGL1用于转化。如 实施例5所述从佛罗里达州合格种子生产者获得柑橘栽培变种'Carrizo'种 子，表面杀菌并且在黑暗中萌芽。来自4-5周老的培养物的黄化的柑橘幼 苗用作外植体来源。如实施例5所述正确制备柑橘组织并且处理，除了外 植体与如下制备的根癌土壤杆菌细菌悬浮液孵育10分钟：从具有卡那霉素 40mg/l的YEP培养基中的单个克隆培养20ml包含pIPG924的根癌土壤杆 菌AGL1的过夜起始培养物。通过3000X离心10分钟收集细胞，并且用 TMT培养基(1X MS盐，3％蔗糖，pH5.8)加100μM乙酰丁香酮漂洗2-3 次。细胞重悬浮于大约50ml TMT+100μM乙酰丁香酮中，细胞密度调整 为O.D.＝0.3，并且轻轻振荡30-60分钟。

如实施例5所述，倒掉根癌土壤杆菌悬浮液，并且吸干接种的外植体 且置于混合细胞培养平板上，在连续暗的条件下25℃孵育约2天。混合细 胞培养2天后，如实施例5所述，外植体转移至具有卡那霉素的再生培养 基在连续黑暗的条件下15天。此后，外植体转移至具有16/8小时光照-黑 暗光照周期的生长室于26℃15-30天直至芽形成，并且另外如实施例5所 述进一步处理。

基于蛋白质印迹分析，土壤杆菌属将携带所需转基因BC的T-DNA投 递入幼体柑橘‘Carrizo’细胞，产生表达所述所需转基因的完全转基因的、 生根的‘Carrizo’柑橘植物(图3和表3)。以起始外植体数目2.7％至3.6％ 范围的频率从土壤杆菌属-介导的转化实验获得转基因的生根幼体柑橘植 物，其频率可与利用中华根瘤菌属获得的1.5至4.7％相比。有趣的是卡那 霉素抗性芽数目为17％。这些柑橘植物的转基因性质通过蛋白质印迹证实。

表⒊土壤杆菌属-介导的幼体柑橘转化总表。

实验批次# 11/10 11/15 起始#外植体 186 112

#卡那霉素上的芽 32(17％) 19(17％) #生根的芽 5(2.7％) 4(3.6％)

实施例8

利用无分生组织的预处理的外植体的苜蓿中华根瘤菌-介导的成熟柑 橘转化。

作为起始材料，使用嫁接在来自商业柑橘苗圃的幼体柑橘栽培变种 ‘Carrizo’或‘Swingle’根茎上或在之上“发芽”的成熟柑橘栽培变种 'Hamlin'、'Valencia'和'Mid-Sweet'甜橙树的芽。移去约6-8"长度的年轻的、 新形成的、半硬的芽，其代表从新出芽的苗圃树嫁接后最初的2或3个萌 芽，并且直接置于水中。或者，可以使用约12-18”长度的年轻的嫁接树的 完全呈现的、变硬的三角形的主茎，避免所述茎的木本、圆的部分。除去 叶和刺并且在蒸馏水中漂洗两次。该组织通过浸于添加几滴Tween-20的 1.2％氯漂(对于三角形的主茎为2.4％)中8-10分钟(对于三角形的主茎为 30分钟)而表面杀菌。该组织随后漂洗5次，每次利用无菌去离子水浸入 2分钟。切掉且丢弃末端，剪切大约1cm长的结节并且保留。这些外植体 用预浸培养基(由0.5X MS盐、8％麦芽糖、0.05％MES组成，pH5.7)在 室温下覆盖10分钟。

预浸后，倒掉培养基并且吸干外植体且转移至芽诱导培养基(1X MS 盐、2.5％蔗糖、足够强度的MS维生素、3mM MES、250mg/l PVP-40、20ml/l 椰子汁、1mg/l BAP、0.5mg/l NAA、250mg/l氨噻肟头孢菌素、100mg/l羧 苄青霉素、10mg/l硝酸银、0.7％琼脂，pH5.7)在黑暗中于26℃2-4周，直 至在所述外植体剪切面上观察到愈伤组织(约2-4周)。选择表现出愈伤组 织形成的外植体，并且利用解剖刀完全除去已形成的任何愈伤组织和分生 组织。在一些实验中，所述解剖刀在剪切苜蓿中华根瘤菌接种体之前为浸 渍的。在一些实验中，所述切块浸在苜蓿中华根瘤菌接种体中。

如下制备苜蓿中华根瘤菌接种体：从具有卡那霉素150mg/l和壮观霉 素100mg/l的TY培养基中的单个克隆培养20ml包含pIPG955的苜蓿中华 根瘤菌/pTWBi3过夜起始培养物。50μl该培养物接种至150ml的TY培养 基并且过夜培养至OD＝1.0。通过3000X离心10分钟收集细胞，并且用成 熟的柑橘转化(MCT)培养基(1X MS盐、8％蔗糖、3mM MES、250mg/l PVP-40、20ml/l椰子汁，pH5.7)漂洗。细胞重悬浮于150ml MCT中，并 且轻轻振荡30-60分钟。在植物组织接触这些细胞之前立即添加乙酰丁香 酮(200μM)。

苜蓿中华根瘤菌培养后，吸干外植体并且转移至混合细胞培养基 (CCM)平板上，在连续暗的条件下25℃孵育9-12天。混合细胞培养培 养基由1X MS盐、2.5％蔗糖、足够强度MS维生素、3mM MES、250mg/l PVP-40、20ml/l椰子汁、1mg/l BAP、0.5mg/l NAA、10mg/l硝酸银和0.7％ 琼脂组成，pH5.7。在此期间，呈现苜蓿中华根瘤菌过度生长的外植体置于 新鲜的CCM平板上。

在黑暗中CCM培养基上9-12天后，外植体转移至芽诱导培养基 (SIM)，其由CCM加200mg/l氨噻肟头孢菌素和100mg/l羧苄青霉素组成， 并且在黑暗中于26℃维持2-4周，总共在黑暗中温育2-8周以促使愈伤组 织形成。表现出愈伤组织形成的外植体随后转移至包含20mg/l硫酸卡那霉 素的新鲜的SIM平板。平板随后转移至具有16/8小时光照-黑暗光照周期 的生长室于26℃2-8周直至芽形成。

具有芽的外植体随后转移至芽伸长培养基表面上(SEM)，其由1X MS 盐、2.5％蔗糖、足够强度MS维生素、3mM MES、0.5mg/l BAP、0.1mg/l NAA、 250mg/l氨噻肟头孢菌素、100mg/l羧苄青霉素、20mg/l硫酸卡那霉素、0.7％ 琼脂组成，pH5.7。从所述外植体除去伸长至大于约1cm长度的芽并且嫁 接于在土壤中从种子生长来的非-转基因的或转基因的‘Carrizo’根茎上。

基于蛋白质印迹分析，利用该预处理方法，苜蓿中华根瘤菌将携带所 需转基因BC的T-DNA投递入成熟柑橘‘Hamlin’和‘Valencia’细胞， 产生嫁接于‘Carrizo’柑橘植物上的表达所述所需转基因的完全转基因的 幼芽(图4&6和表4)。通过利用该预处理方法以约一半成功嫁接芽数目 的频率从苜蓿中华根瘤菌-介导的转化实验获得转基因的成熟柑橘植物。以 0.8％-12％起始外植体数目的范围的频率获得成功嫁接的芽。大致一半这些 柑橘幼芽植物(0.4％至6％)的转基因性质通过蛋白质印迹证实(图4&6； 一些数据没有显示)。

表4.苜蓿中华根瘤菌-介导的成熟柑橘转化总表。

实施例9

成熟转化的芽嫁接至土壤中从种子来的根茎上。

从佛罗里达州合格的苗圃获得生长在土壤中的一至两个月大的柑橘栽 培变种‘Carrizo’幼苗(约6-10”高)。从每个幼苗除去所有叶，利用吸收 70％乙醇的纸巾轻轻地表面杀菌全部的茎。顶节点以上利用无菌解剖刀除 去茎的顶端，留下约1cm的结间部。解剖刀随后用于从剪切茎的顶部产生 约5mm深的纵切，并且将所述茎切分为V-形。随后在幼芽准备用于嫁接 时将一滴无菌水添加至V-切口中以保持所述区域湿润。

从组织培养物除去具有伸长至大于约1cm长度的芽的转化的成熟柑橘 外植体(通常具有2-3片叶)，并且从所述外植体切掉伸长的芽，产生在所 述茎的底部产生V形切口。成熟幼芽中的V形切口随后小心放入所述根茎 的V形切口中，并且所述表面一起小心地成形且用2.0mm的嫁接夹固定就 位。随后塑料聚乙烯折叠-顶夹层袋小心地覆盖放于全部的嫁接幼芽，不接 触嫁接部，并且慢慢挤压关闭，完全围绕在土系之上的嫁接幼芽周围。所 述围栏通过利用位于嫁接部以下土系以上的夹子保持在适当位置。通过两 个短的木棒(野餐棒)固定就位充气袋的边，置于罐中且通过带子附着于 塑料袋围栏。利用结核菌素注射器将大约10ml无菌水随后注入塑料袋围栏 中。

嫁接植物随后在27℃，装备有荧光灯(16小时光周期)的生长室中温 育两周。在围栏之内的水根据需要利用结核菌素注射器更换。嫁接植物随 后转移至高光照强度生长室并且保持另外的两周。

实施例10

利用有分生组织的预处理的外植体的苜蓿中华根瘤菌-介导的成熟柑 橘转化。

作为起始材料，使用嫁接在来自商业柑橘苗圃的幼体柑橘栽培变种 ‘Carrizo’或‘Swingle’根茎上或在之上“发芽”的成熟柑橘栽培变种 'Hamlin'、'Valencia'和'Mid-Sweet'甜橙树的芽。移去约6-8"长度的年轻的、 新形成的、半硬的芽，其代表从新出芽的苗圃树嫁接后最初的2或3个萌 芽，并且直接置于水中。除去叶和刺并且在蒸馏水中漂洗两次。该组织通 过浸于添加几滴Tween-20的1.2％氯漂中8-10分钟而表面杀菌。该组织随 后漂洗5次，每次利用无菌去离子水浸入2分钟。切掉且丢弃末端，剪切 大约1cm长的结节并且保留。丢弃所有结点。这些外植体用预浸培养基(由 0.5X MS盐、8％麦芽糖、0.05％MES组成，pH5.7)在室温下覆盖10分钟。

预浸后，倒掉培养基并且吸干外植体且转移至芽诱导培养基(1X MS 盐、2.5％蔗糖、足够强度的MS维生素、3mM MES、250mg/l PVP-40、20ml/l 椰子汁、1mg/l BAP、0.5mg/l NAA、250mg/l氨噻肟头孢菌素、100mg/l羧 苄青霉素、10mg/l硝酸银、0.7％琼脂，pH5.7)在黑暗中于26℃2-5周，直 至在所述外植体剪切面上观察到愈伤组织。选择表现出愈伤组织形成的外 植体，并且转移至光照下1-2周。呈现1-4mm初生芽的外植体利用结核菌 素注射针弄伤，在每个初生芽底部附近打一个洞。结核菌素注射针在苜蓿 中华根瘤菌接种体中预浸渍(弄伤之前)。

如下制备苜蓿中华根瘤菌接种体：从具有卡那霉素150mg/l和壮观霉 素100mg/l的TY培养基中的单个克隆培养20ml包含pIPG955的苜蓿中华 根瘤菌/pTWBi3过夜起始培养物。50μl该培养物接种至无抗生素的150ml 的TY培养基并且过夜培养至OD＝1.0。通过3000X离心10分钟收集细胞， 并且用成熟的柑橘转化(MCT)培养基(1X MS盐、8％蔗糖、3mM MES、 250mg/l PVP-40、20ml/l椰子汁，pH5.8)漂洗。细胞重悬浮于150ml MCT 中，并且轻轻振荡30-60分钟。将植物组织与这些细胞接触之前立即将乙 酰丁香酮加至200μM并且Silwet L-77加至0.02％。

苜蓿中华根瘤菌培养后，吸干外植体并且转移至混合细胞培养基 (CCM)平板上，在连续暗的条件下25℃孵育9天。混合细胞培养培养基 由1X MS盐、2.5％蔗糖、足够强度MS维生素、3mM MES、250mg/l PVP-40、 20ml/l椰子汁、1mg/l BAP、0.5mg/l NAA、10mg/l硝酸银和0.7％琼脂组成， pH5.7。在此期间，呈现苜蓿中华根瘤菌过度生长的外植体置于新鲜的CCM 平板上。

在黑暗中CCM培养基上10天后，外植体转移至芽诱导培养基(SIM)， 其由CCM加200mg/l氨噻肟头孢菌素和100mg/l羧苄青霉素组成，并且在 黑暗中于26℃维持1-4周，总共在黑暗中温育2-8周以促使愈伤组织形成。 表现出愈伤组织形成的外植体随后转移至包含20mg/l硫酸卡那霉素的新鲜 的SIM平板。平板随后转移至具有16/8小时光照-黑暗光照周期的生长室 于26℃2-8周直至芽形成。

具有芽的外植体随后转移至芽伸长培养基表面上(SEM)，其由1X MS 盐、3％蔗糖、足够强度MS维生素、0.5mg/l BAP、0.1mg/l NAA、250mg/l 氨噻肟头孢菌素、20mg/l硫酸卡那霉素、0.7％琼脂组成，pH5.7。从所述 外植体除掉伸长至大于约1cm长度的芽并且嫁接于在土壤中从种子生长来 的非-转基因的‘Carrizo’根茎上。

实施例11

利用无分生组织的预处理的外植体的土壤杆菌属-介导的成熟柑橘转 化

如实施例8所述，作为起始材料，使用嫁接在来自商业柑橘苗圃的幼 体柑橘栽培变种'Carrizo'或'Swingle'根茎上或在之上"发芽"的成熟柑橘栽培 变种'Hamlin'、'Valencia'和'Mid-Sweet'甜橙树的芽，并且正确处理，除了根 癌土壤杆菌AGL1用于转化以及所述组织在CCM平板上保持2天替换为 9-12天。

如下制备根癌土壤杆菌接种体：从具有40mg/l的YEP培养基中的单 个克隆培养20ml包含pIPG924的根癌土壤杆菌AGL1的过夜起始培养物。 10μl该培养物接种至50ml的YEP培养基并且过夜培养至OD小于0.6。 通过3000X离心10分钟收集细胞并且细胞密度调整为O.D.＝0.3。再离心 所述细胞，并且用成熟的柑橘转化(MCT)培养基(1X MS盐、8％蔗糖、 3mM MES、250mg/l PVP-40、20ml/l椰子汁，pH5.8)漂洗。细胞重悬浮 于150ml MCT中，并且轻轻振荡30-60分钟。将植物组织与这些细胞接触 之前立即将乙酰丁香酮(200uM)和Silwet L-77加至0.02％。

基于蛋白质印迹分析，利用该预处理方法，根癌土壤杆菌将携带所需 转基因BC的T-DNA投递入成熟柑橘‘Hamlin’、‘Valencia’和‘Mid-Sweet’ 细胞，产生表达所述所需转基因的转基因的幼芽(图5和6以及表5)。这 些转基因的幼芽嫁接于在土壤中从种子生长来的非-转基因的'Carrizo'根茎 上。通过利用该预处理方法以约一半成功嫁接芽数目的频率从土壤杆菌属- 介导的转化实验获得转基因的成熟柑橘植物。以起始外植体数目0.5％至7％ 范围的频率获得成功地嫁接的芽，其频率可与实施例8中的利用中华根瘤 菌属获得的0.6％至12％频率相比。大致一半这些柑橘幼芽植物(0.25至 3.5％)的转基因性质通过蛋白质印迹证实(图5和6；一些数据没有显示)。

表5.土壤杆菌属-介导的成熟柑橘幼芽转化总表。Ham，‘Hamlin’；Val， ‘Valencia’。

除非另外定义的，此处所用的所有技术和科学名词具有本发明所属本 领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。分子生物学中的常见术语 的定义可在Benjamin Lewin，Genes IX，牛津大学出版社出版，2007 (ISBN-100131439812)；Kendrew等.(eds.)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-63202182-9)；和Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biology and Biotechnology：A Comprehensive Desk Reference，VCH出版社股份有限公司出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology， 修订版，2000中找到。虽然与此处所述的那些相似或同等的任何方法和材 料可用于本发明的实践或检验，此处描述了更优选的材料和方法。

不论方法在哪里描述和要求保护，很清楚的是本发明的方法并不要求 所述方法所列的过程和/或步骤一定需要以所示的顺序正确完成，也不要求 每一个人或公司一定需要自己完成所有步骤。例如，当具有所涉及的一个 以上过程和/或步骤时，本发明设想一个个人或公司可以完成所述方法的一 个或多个过程和/或步骤，而另一个个人或公司可以完成相同方法的一个或 多个其他的过程和/或步骤。例如，在预处理柑橘结间茎节的方法中，一个 个人可以产生、选择和培养来自所述节的愈伤组织而不同的个人或公司可 以进行得到的愈伤组织的转化。

所有引用的出版物、专利和专利公开用于所有目的整体并入本文作为 参考。作为参考并入本文的还有保藏在GenBank的核酸序列和多肽序列， 其在说明书中被引用。

本文讨论的出版物因其在本申请申请日前公开而单独提供。本文没有 认为承认由于在先发明本发明无权提早所述出版物的日期。

虽然本发明已经结合具体的实施方案描述，很清楚的是能够进一步修饰， 并且该申请试图涵盖总的来说遵循本发明原则并且包括背离本说明书而在 本发明所述技术领域内已知的或惯例内的任何本发明的改变、使用或修改， 且可以应用以上阐述的和如下所附加的权利要求范围内的必要特征。

引用的参考文献

Anderson,C.M.,Castle,W.S.,and Moore,G.A.1991.Isozymic identification of zygotic seedlings in‘Swingle’Citrumelo Citrus paradisi X Poncirus trifoliata nursery and field populations.J.Amer.Soc.Hort.Sci. 116:322-326.

Broothaerts W,Mitchell HJ,Weir B,Kaines S,Smith LM,Yang W,Mayer JE,Roa-Rodríguez C,Jefferson RA.2005.Gene transfer to plants by diverse species of bacteria.Nature.433:629-633

Chao,-C-C-T；Fang,-J-G；Devanand,-P-S.2005.Long distance pollen flow in mandarin orchards determined by AFLP markers-implications for seedless mandarin production.J.Amer.Soc.Hort.Sci.130:374-380.

Cervera,M.,Pina,J.A.,Juarez,J.,Navarro,L.,and Pena,L.1998. Agrobacterium-mediated transformation of citrange:factors affecting transformation and regeneration.PLANT CELL REP18:271-278.

Cervera,M.,Juarez,J.,Navarro,A.,Pina,J.A.,Duran-Vila,N.,Navarro, L.,and Pena,L.1998.Genetic transformation and regeneration of mature tissues of woody fruit plants bypassing the juvenile stage.Transgenic Research 7:51-59.

Cervera,M.,Navarro,A.,Navarro,L.,and Pena,L.Production of transgenic adult plants from clementine mandarin by enhancing cell competence for transformation and regeneration.Tree Physiol.28,55-66.2008.

Clark,JR.1983.Age related changes in trees.J.Arboriculture9:201-5.

Douglas CJ,Halperin W,Nester EW(1982)Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells.J Bacteriol152:1265–1275

Frost HB(1943)Seed reproduction:development of gametes and embryos. In:Webber HJ,Batchelor LD(eds)The Citrus industry,vol1.University of California Press,Berkeley,Calif.,pp767–815.

Galibert,F.et al.2001.The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti.Science293:668–672.

Garcia,R.,Asins,M.J.,Forner,J.,and Carbonell,E.A.1999.Genetic analysis of apomixis in Citrus and Poncirus by molecular markers.Theoretical and Applied Genetics99:511-518.

Gould J.H and M.Megallanes-Cedeno1998Adaptation of cotton shoot apex culture to Agrobacterium mediated transformation,Plant Mol.Biol.Rep. 16:1-10

Kategari I.S,Vamadevaiah H.M,Udikeri S,Khadi B.M,Polumetla A.K 2007.Genetic transformation of an elite Indian genotype of cotton(Gossypium hirsutum L)for insect resistance Curr.Sci.1843-1847

Koltunow,A.M.,Soltys,K.,Nito,N.,and Mcclure,S.1995.Anther,Ovule Seed,and Nucellar Embryo Development in Citrus-Sinensis Cv‘Valencia’. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne de Botanique73:1567-1582.

Lazo,G.R.,P.A.Stein,and R.A.Ludwig.1991.A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Bio/Technology9:963–967.

Lippincott B,Lippincott JA(1969)Bacterial attachment to a specific wound site as an essential stage in tumor initiation by Agrobacterium tumefaciens.J Bacteriol97:620–628

Long,S.2001.Genes and Signals in the Rhizobium-Legume Symbiosis.Plant Physiol.125:69-72.

Manner,H.I.,R.S.Buker,V.Easton Smith,and C.R.Elevitch.2006.Citrus species(citrus),ver.2.1.In:Elevitch,C.R.(ed.).Species Profiles for Pacific Island Agroforestry.Permanent Agriculture Resources(PAR),Hawaii.

Miki and McHugh,2004.Selectable marker genes in transgenic plants: applications,alternatives and biosafety.J.Biotechnol.107:193-232.

Moore,G.A.,Jacono,C.C.,Neidigh,J.L.,Lawrence,S.D.and Cline,K.

Regeneration of transgenic plants.Plants Cell Rep.11:238-2542.

Moore,G.A.and Cline,K.1987.Genetic transformation studies in Citrus using the Agrobacterium tumefaciens vector system.Annual Review Microbiology22:1007.

Nogler GA(1984)Gametophytic apomixis.In:Jhri BM(ed)Embryology of angiosperms.Springer,Berlin Heidelberg New York,pp475–518.

Peremyslov,V.V.,Hagiwara,Y.,and Dolja,V.V.1999.HSP70homolog functions in cell-to-cell movement of a plant virus.Proc.Natl Acad.Sci. 96:14771-14776.

Pitzschke,A.and Hirt,H.2010.New insights into an old story: Agrobacterium-induced tumour formation in plants by plant transformation. EMBO J29:1021-1032.

Slc,S and Gokceoglu,M2007.Pollen analysis of honeys from Mediterranean region of Anatolia.Grana46:57-64

Spiegel-Roy,P and Goldschmidt,EE.(1996)pp185-6in Biology of Citrus.Cambridge University Press,230pp.

‘Swingle’,WT(1927)Seed production in sterile Citrus hybrids-its scientific explanation and practical significance.Hort.Soc.New York Mem. 3:19-21.

Wallace,H.M.,King,B.J.,and Lee,L.S.2002.Pollen flow and the effect on fruit size in an'Imperial'mandarin orchard.HortScience37:84-86.

Ward,J.E.,Akiyoshi,D.E.,Regier,D.,Datta,A.,Gordon,M.P and Nester, E.W.,1988.Characterization of the virB operon from an Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid.J.Biol.Chem.263:5804–5814.

Wendt,T.,Doohan,F.,Winckelmann,D and Mullins,E.,2011.Gene transfer into Solanum tuberosum via Rhizobium spp.Transgenic Res.20: 377-386.

Wood,D.W.et al.2001.The genome of the natural genetic engineer Agrobacterium tumefaciens C58.Science294:2317–2323.

Zapata C,Srivalakanakul M,Park S.H,Lee B.M,Salas M.G Smith R.H (1999)Improvement in shoot apex regeneration of two fibre crops:cotton and Kenaf.Plant Cell Tissue and Organ Cult.12:43-50