一种类天蚕素抗菌肽及其应用

摘要

本发明公开了一种类天蚕素抗菌肽及其应用，属于分子生物学技术领域。类天蚕素抗菌肽由31个氨基酸组成，其分子量为3833.7Da。该抗菌肽能够抑制金黄色葡萄球菌、禽多杀性巴氏杆菌、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌等细菌的生长，与青霉素、链霉素、头孢唑啉钠、阿奇霉素等常用抗生素相比，抑菌效果相对较好，与Cecropin B、Cecropin A、Cecropin P1等常规的天蚕素抗菌肽相比，具有更强的抑菌活性。该抗菌肽对鸡沙门氏菌的最小抑菌浓度为625μg/mL，同时具有良好的热稳定性，在抗菌性药物的研究开发中具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种类天蚕素抗菌肽，以及该抗菌肽的应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

抗菌肽(Antibacterial peptide)是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱导产生的 一类小分子多肽，分子量为2000～7000Da，由20～60个氨基酸残基组成。世界上第一个 抗菌肽是由瑞典科学家G.Boman等人于1980年从天蚕蛹中发现的。此后，人们在细菌、 真菌、植物、昆虫、两栖类动物、鸟类、鱼类、哺乳动物乃至人类等多种生物体中陆续发 现并分离了多种抗菌肽。迄今为止，国内外报道大约有2000多种抗菌肽被鉴定、分离出 来，以天然抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽已达数千种。这些抗菌肽大多具有广谱抗 细菌、真菌、病毒、原虫和抑杀肿瘤细胞等活性，而且在天然免疫中也扮演着重要角色， 有些抗菌肽具有调节免疫、促中性粒细胞、T细胞的化学趋化、促进伤口愈合、诱导细胞 凋亡、抑制蛋白激酶C、抑制促肾上腺皮质激素等多方面生物功能。

长期、广泛、不加选择地使用抗生素药物引发了药物残留、细菌耐药性增强、机体自 身免疫力下降等一系列问题，给细菌性疾病的防治带来了极大的麻烦和困难，同时也给人 类的健康带来潜在的威胁。而具有广谱、高效抗病原微生物等特点的抗菌肽不同于传统的 抗生素药物，其独特的杀菌机制使细菌不易产生耐药性，这一发现为解决细菌对传统抗生 素日益增强的耐药性这一棘手的全球性难题提供了新的途径，提示抗菌肽可作为抗生素良 好的替代品在临床上得到广泛使用将是大势所趋。

目前，抗菌肽已引起了人们的广泛关注，其研究及应用已成为生物制药领域中的热点。 随着研究的不断深入，许多抗菌肽正在被开发成药物，其中天蚕素抗菌肽是目前研究最清 楚、效果最明显的抗菌肽。然而，与传统抗生素相比，天然来源的抗菌肽产量低、抗菌活 性不够理想，有的甚至存在细胞毒性。因此，在揭示抗菌肽结构与功能关系及作用机制的 基础上，以性质优良的抗菌肽为模板，对已有抗菌肽进行人工改造和设计新抗菌肽分子已 成为抗菌肽开发的一个重要内容。与天然来源的抗菌肽相比，人工设计的抗菌肽往往具有 更好的靶细胞特异性和抗菌活性，而且具有低溶血活性和对蛋白酶降解作用的低敏感性等 特点。因此，开发具有结构简单、抗菌活性高、化学合成容易的抗菌肽成为当前抗菌药物 开发迫切的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种类天蚕素抗菌肽。

同时，本发明还提供一种类天蚕素抗菌肽的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种类天蚕素抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。抗菌肽的分子量为 3833.7Da。所述抗菌肽包含天蚕素S-W-L-S-K-T-A-K-K-L-F抗菌活性结构，富含精氨酸 (Arg)和赖氨酸(Lys)，精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)残基带正电荷，可吸引细菌表面 的负电荷。同时，R-P-R-P-W-P-R-P基本结构单元构成双侧疏水性α-螺旋结构。

上述类天蚕素抗菌肽可通过人工合成，即多肽固相合成的方法或基因工程方法获得。

一种类天蚕素抗菌肽的应用，包括类天蚕素抗菌肽在制备抗菌性药物方面的应用。在 抗菌性药物中，类天蚕素抗菌肽可按常规方法制成不同药物剂型，如片剂、散剂、注射针 剂等。类天蚕素抗菌肽为抗菌药物的抗菌活性成分，在药物中，类天蚕素抗菌肽的含量范 围为0.2～50％。

所述的菌为金黄色葡萄球菌、禽多杀性巴氏杆菌、鸡沙门氏菌、鸡大肠杆菌中的一种 或多种。

具体的，类天蚕素抗菌肽在制备抗鸡沙门氏菌药物方面的应用。类天蚕素抗菌肽对鸡 沙门氏菌的抗菌性尤佳，最小抑菌浓度为625μg/mL，且经121℃高温高压处理后仍对鸡沙 门氏菌有抑菌作用，热稳定性良好。

本发明的有益效果：

本发明根据抗菌肽的作用机理和氨基酸组成的特点，同时参照Cecropin P1杀菌特点， 设计一种类天蚕素抗菌肽，由31个氨基酸组成，分子量为3833.7Da。该抗菌肽能够抑制 金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌等细菌的生长，与青霉素、链霉素、 头孢唑啉钠、阿奇霉素等常用抗生素相比，抑菌效果相对较好，与Cecropin B、Cecropin A、 Cecropin P1等常规的天蚕素抗菌肽相比，具有更强的抑菌活性。该抗菌肽对鸡沙门氏菌的 最小抑菌浓度为625μg/mL，热稳定性良好，在抗菌性药物的研究开发中具有良好的应用前 景。

附图说明

图1为本发明试验例1中类天蚕素抗菌肽对四种细菌体外抑菌活性试验结果；

图2为类天蚕素抗菌肽与常用抗生素体外抑菌活性试验结果；

图3为类天蚕素抗菌肽对沙门氏菌最小抑菌浓度测定结果；

图4为类天蚕素抗菌肽热稳定性测定结果。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例中类天蚕素抗菌肽，其氨基酸序列为:SWLSKTAKKLFKKIPKKRFPRPRPWP RPNMI(同SEQ ID NO.1所示)，分子量为3833.7Da。所述抗菌肽包含天蚕素 S-W-L-S-K-T-A-K-K-L-F抗菌活性结构，富含精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)，精氨酸(Arg) 和赖氨酸(Lys)残基带正电荷可吸引细菌表面的负电荷。同时R-P-R-P-W-P-R-P基本结构 单元构成双侧疏水性α-螺旋结构。

本实施例中类天蚕素抗菌肽由上海楚肽生物科技有限公司采用固相合成法合成，纯度 大于95％。

实施例2

本实施例中类天蚕素抗菌肽在制备抗菌性药物方面的应用，所述抗菌肽的氨基酸序列 为:SWLSKTAKKLFKKIPKKRFPRPRPWP RPNMI，分子量为3833.7Da。采用常规方法将 类天蚕素抗菌肽制成类天蚕素多肽菌素片剂，主药类天蚕素抗菌肽每片含量为0.2g，主药 的质量百分含量为50％，辅料由淀粉、蔗糖、滑石粉组成。

实施例3

本实施例中类天蚕素抗菌肽在制备抗菌性药物方面的应用，所述抗菌肽的氨基酸序列 为:SWLSKTAKKLFKKIPKKRFPRPRPWP RPNMI，分子量为3833.7Da。采用常规方法将 类天蚕素抗菌肽制成类天蚕素多肽菌素氯化钠注射液，每100mL注射液由以下组分组成： 主药类天蚕素抗菌肽0.2g，氯化钠0.9g，余量为注射用水。

实施例4

本实施例中类天蚕素抗菌肽在制备抗菌性药物方面的应用，所述抗菌肽的氨基酸序列 为:SWLSKTAKKLFKKIPKKRFPRPRPWP RPNMI，分子量为3833.7Da。采用常规方法将 类天蚕素抗菌肽制成类天蚕素多肽菌素葡萄糖注射液，每100mL注射液由以下组分组成： 类天蚕素抗菌肽0.2g，葡萄糖5g，余量为注射用水。

试验例

(1)类天蚕素抗菌肽体外抑菌活性试验

采用纸片法测定类天蚕素抗菌肽的体外抑菌活性。纸片法中药敏纸片按照常规方法制 备。选用新华1号定性滤纸，用打孔器打成直径为6mm的小圆纸片，纸片用纸包成包， 放在小瓶或平皿中，在120℃灭菌15min再置100℃干燥箱内烘干。将灭菌的滤纸片用无 菌镊子摊布于灭菌平皿中，以每张滤纸片饱和吸水量为0.01mL计算，50张滤纸加入药量 0.5mL，药液的配制方法见下表1。要不时翻动，使滤纸充分吸收药液，一般浸泡30min， 取出含药纸片放于纱布袋中，以真空抽气机使之干燥，或将纸片摊于37℃温箱中烘干，以 防药物失效。对青霉素纸片的干燥宜用低温真空干燥法，干燥后立即放入瓶中加塞，放干 燥器内保存，也可放在-20℃冰箱中。按上述方法制作青霉素、链霉素、阿奇霉素、头孢唑 啉钠、类天蚕素抗菌肽的药敏片，装小瓶中备用。

表1  药液的配制方法

将金黄色葡萄球菌、禽多杀性巴氏杆菌、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌四种细菌培养至对 数期，分别取100μL四种细菌对数期菌液均匀涂布于4个LB固体培养基中，培养基配方 如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L， 琼脂粉10g。每个LB固体培养基中放一个类天蚕素抗菌肽药敏片。将四个平板置于37℃ 培养24h，观察并记录结果，见下表2和图1，图1中类天蚕素抗菌肽药敏片均贴于各培 养皿中央，未作特殊标示，“巴”代表巴氏杆菌，“金”代表金黄色葡萄球菌，“鸡”代表 鸡大肠杆菌，“沙门”代表鸡沙门氏菌。

表2  类天蚕素抗菌肽对四种细菌的抑菌圈直径

结果显示，类天蚕素抗菌肽对金黄色葡萄球菌、禽多杀性巴氏杆菌、鸡沙门氏菌、鸡 大肠杆菌均有较强的抗菌活性。

(2)类天蚕素抗菌肽与常用抗生素抑菌活性比较

将金黄色葡萄球菌、禽多杀性巴氏杆菌、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌四种细菌培养至对 数期，分别取100μL四种细菌对数期菌液均匀涂布于4个LB固体培养基中(同上)，每个 固体培养基中分别放青霉素、链霉素、头孢唑啉钠、阿奇霉素和类天蚕素抗菌肽药敏片(依 次标记为1、2、3、4、5)各一个。将四个平板置于37℃培养24h，观察并记录结果，见 下表3和图2，图2中“巴”代表巴氏杆菌，“金”代表金黄色葡萄球菌，“鸡”代表鸡大 肠杆菌，“沙”代表鸡沙门氏菌，1～5依次代表青霉素、链霉素、头孢唑啉钠、阿奇霉素 和类天蚕素抗菌肽。

表3  类天蚕素抗菌肽与常用抗生素对四种细菌的抑菌圈直径

结果显示，青霉素、链霉素、头孢唑啉钠和类天蚕素抗菌肽对鸡大肠杆菌均有抑菌作 用，类天蚕素抗菌肽的抑菌效果与头孢唑啉钠相比较弱，与青霉素、链霉素的抑菌效果相 差不大；仅阿奇霉素和类天蚕素抗菌肽对沙门氏菌有抑菌作用，类天蚕素抗菌肽的抑菌效 果相对较弱；青霉素、链霉素、头孢唑啉钠和类天蚕素抗菌肽对巴氏杆菌均有抑菌作用， 类天蚕素抗菌肽的抑菌效果与青霉素、链霉素、头孢唑啉钠相比相差不大，均较强；青霉 素、链霉素、头孢唑啉钠、阿奇霉素和类天蚕素抗菌肽对金黄色葡萄球菌均有抑菌作用， 类天蚕素抗菌肽的抑菌效果与青霉素、链霉素、头孢唑啉钠相比相差不大，而弱于阿奇霉 素的抑菌效果。综上所述可知：类天蚕素抗菌肽对四种细菌均有抑制作用，且与抗生素相 比对各细菌抑菌效果相对较好。

(3)类天蚕素抗菌肽与常规的天蚕素抗菌肽抑菌活性比较

为进一步说明类天蚕素抗菌肽抗菌效果，将类天蚕素抗菌肽与常规的天蚕素抗菌肽抑 菌活性进行比较。选择三种常规的天蚕素抗菌肽，其氨基酸序列分别如下：

Cecropin A：KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK(如SEQ ID NO.2 所示)；

Cecropin B:KWKVFKKIEKMGRNIRNGIVKAGPAIAVLGEAKAL(如SEQ ID NO.3所 示)；

Cecropin P1:SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR(如SEQ ID NO.4所示)。

上述抗菌肽均由上海楚肽生物科技有限公司采用固相合成法合成，纯度大于95％。并 按照常规方法制备抗菌肽药敏片(同上)。

将金黄色葡萄球菌、禽多杀性巴氏杆菌、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌四种细菌培养至对 数期，分别取100μL四种细菌对数期菌液均匀涂布于4个LB固体培养基中，每个LB固 体培养基中分别放Cecropin A、Cecropin B、Cecropin P1和类天蚕素抗菌肽药敏片各一个。 将四个平板置于37℃培养24h，观察并记录每种抗菌肽的抑菌结果，见下表4。

表4  类天蚕素抗菌肽与常规的天蚕素抗菌肽对四种细菌的抑菌圈直径

结果显示，Cecropin A、Cecropin B和类天蚕素抗菌肽对鸡大肠杆菌有抑菌作用，类天 蚕素抗菌肽的抑菌效果相对较强；仅Cecropin B和类天蚕素抗菌肽对沙门氏菌有抑菌作用； 四种抗菌肽对禽多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，但类天蚕素抗菌肽对禽 多杀性巴氏杆菌的抑菌效果相对较强。综上所述可知：类天蚕素抗菌肽与Cecropin B、 Cecropin A、Cecropin P1等常规的天蚕素抗菌肽相比，具有更强的抑菌活性。

(3)类天蚕素抗菌肽最小抑菌浓度测定(MIC)

最小抑菌浓度(MIC)和热稳定性的测定选用沙门氏菌进行。取11支试管，分别编号 0～10，将0.4g类天蚕素抗菌肽用4mL LB液体培养基(不含琼脂粉)充分溶解到1号管 中，其他各试管中分别加入2mL LB液体培养基。用枪头从1号试管中吸出2mL注入2号 管中，依次类推，一直稀释到9号管，最后弃去2mL。每个稀释度均需更换枪头。向0号 管加20mg类天蚕素抗菌肽，浓度同1号管，作为无菌对照；向10号管加入4mL LB液体 培养基，作为无药对照。将事先培养好的沙门氏菌菌液充分摇匀，1～10号管每管一滴。 菌悬液大约稀释100倍，每毫升含细菌约105cfu。将试管置于37℃培养过夜，判读结果， 见图3。含抗菌肽最少而无细菌生长的稀释度，即为MIC。

结果显示，1～5号管液体澄清，与0号管相似；而6号管之后(包括6号)的试管中 液体混浊，与10号管相似，有细菌生长。则类天蚕素抗菌肽的MIC为5号管中类天蚕素 抗菌肽的浓度，即625μg/mL。

(4)类天蚕素抗菌肽稳定性试验

取3支试管，分别加入2mL LB液体培养基(同上)，并标记为“L”、“O”、“Φ”。“L” 和“O”管中分别加入类天蚕素抗菌肽10mg，充分震荡混匀，“Φ”管不做任何处理。将3 支试管于121℃高压处理20min。将事先培养好的沙门氏菌菌液充分混匀，向“L”和“Φ” 管中各加1滴。菌悬液大约稀释100倍，每毫升含细菌约105cfu。“O”管不做任何处理。 将3支试管于37℃培养过夜，观察结果并记录，见图4。

结果显示，比较3支试管，“L”和“O”管较澄清，“Φ”管浑浊，有细菌生长，可 知类天蚕素抗菌肽经过121℃高压处理后对沙门氏菌仍有抑菌作用，表明其热稳定性良好。