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利用4个蛋白联合预测食道癌患者预后的试剂盒

摘要

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测石蜡包埋组织中目的蛋白表达情况的试剂。本发明解决该技术问题的技术方案是提供了一种评价食道癌患者预后信息的检测试剂盒。该试剂盒包括4种目的蛋白的抗体-δ-catenin、Dynamin-2、Erbin和LAP-1抗体,还包括山羊血清、0.01M柠檬酸盐修复液、3%H

著录项

法律信息

  • 法律状态公告日

    法律状态信息

    法律状态

  • 2018-05-29

    未缴年费专利权终止 IPC(主分类):G01N33/68 授权公告日:20151125 终止日期:20170509 申请日:20140509

    专利权的终止

  • 2015-11-25

    授权

    授权

  • 2014-10-15

    实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/68 申请日:20140509

    实质审查的生效

  • 2014-09-10

    公开

    公开

说明书

技术领域

本发明涉及联合多个蛋白抗体并利用免疫组织化学超敏型二步法去检测食道癌患者标本 的表达情况进而预测患者预后的试剂盒。

背景技术

食道鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)在我国是一种常见的上消 化道恶性肿瘤,在国人的恶性肿瘤死亡率中位居第四位。全世界每年40余万的新发食道癌病 例中,一半以上发生在我国,我国也是世界上公认的食道癌第一高发国。上世纪70年代,在 全国范围内实施了恶性肿瘤普查,确立河北磁县、河南林县、山西阳泉、四川盐亭、广东潮 汕和江苏淮安等地区为中国食道癌六大高发区。

准确预测食道癌患者的预后对于临床进一步的治疗和随访具有重要意义。然而,目前除 了国际TNM分期外还没有一种简便有效的方法可以更加准确地预测食道癌患者的预后。然 而,TNM分期预测患者的预后比较繁琐,需要准确地评价肿瘤的浸润深度、转移淋巴结的个 数、肿瘤有无远处转移等,况且国际TNM分期的制定缺少大量国人食道癌的病例资料,因 此在评价我国患者的预后时适用性比较差,而本发明所采用的4个指标联合预测患者预后的 试剂盒比单个指标检测具有更高的预测效果,同时也明显高于TNM分期的预测能力,并且 本发明所基于的免疫组织化学超敏型二步法是一种成熟可靠、可在基层医院广泛使用的方法。 本试剂盒中4种抗体蛋白的背景介绍如下。

δ-catenin蛋白作为黏附分子Catenin家族中的一员,除了在神经元突触处发挥重要的生理 作用外,其在肿瘤演进过程中所发挥的作用也越来越受到人们的关注。最近的文献也报道了 δ-catenin在肺癌、前列腺癌、大脑星形细胞瘤及卵巢癌中的表达明显增高且和患者的不良预 后密切相关。然而,在国人恶性肿瘤死亡率居第四位的食道癌中δ-catenin的表达情况如何及 其与患者预后的关系尚不清楚。本发明的前期研究发现δ-catenin在食道癌组织中高表达并与 患者的不良预后密切相关。

Dynamin-2蛋白主要定位在细胞连接处,并参与细胞伪足的形成。在子宫颈鳞状细胞癌中 Dynamin-2的表达增加。本发明的前期研究发现Dynamin-2在食道癌组织中的表达与患者的 不良预后密切相关。

Erbin蛋白定位在细胞连接半桥粒处,在皮肤鳞状细胞癌中Erbin的表达增加。本发明的 前期研究发现Erbin在食道癌组织中高表达并与患者的不良预后密切相关。

LAP-1蛋白也定位在细胞连接处,特别是神经元突触膜上。该蛋白在肿瘤组织中表达的 研究甚少。本发明的前期研究发现LAP-1在食道癌组织中的表达与患者的不良预后密切相关。

虽然上述每种蛋白均具有预测食道癌患者预后的能力,但把4种蛋白联合起来预测食道 癌患者的预后则具有更强的判断效能,甚至高于国际公认的TNM分期的预测能力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于免疫组织化学方法的4个蛋白抗体联合预测 食道癌患者预后的试剂盒。

其中,上述的免疫组织化学方法主要是检测中性福尔马林固定和石蜡包埋的标本。

其中,上述试剂盒主要包括4种蛋白抗体,分别是δ-catenin、Dynamin-2、Erbin和LAP-1 抗体。

其中,上述试剂盒还包括:山羊血清,0.01M柠檬酸盐修复液,3%H2O2,Polymer增强 剂,Polymer聚合物,DAB显色试剂,PBS溶液。

附图说明

图1是δ-catenin蛋白在不同表达人群的Kaplan-Meier生存曲线(X2=6.671,P=0.010)

图2是Dynamin-2蛋白在不同表达人群的Kaplan-Meier生存曲线(X2=5.181,P=0.023)。

图3是Erbin蛋白在不同表达人群的Kaplan-Meier生存曲线(X2=4.633,P=0.031.)。

图4是LAP-1蛋白在不同表达人群的Kaplan-Meier生存曲线(X2=8.546,P=0.003)。

图5是4种蛋白联合后判断该人群的Kaplan-Meier生存曲线(X2=18.574,P<0.001.)。

图6是ROC曲线(注:4种蛋白联合后形成的曲线下面积最大,为0.627)。

具体实施方式

我们收集了299例2007-2011年的食道癌患者的手术标本存档蜡块。下面结合附图实施 例作进一步详细描述。

免疫组织化学超敏型二步法步骤如下。

标本经连续切片、二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后,用超敏型二步法检测目的蛋白的表达, 具体方法如下。

(1)切片经0.01M柠檬酸盐修复液抗原修复、3%H2O2灭活内源性过氧化物酶、山羊血 清封闭后,分别与δ-catenin、Dynamin-2、Erbin、LAP-1抗体4℃孵育过夜。

(2)切片与Polymer增强剂和Polymer聚合物分别孵育后经DAB显色。

(3)切片经苏木素复染核,梯度酒精脱水,二甲苯透明和中性树胶封片。

(4)切片在完成上述每步后均经PBS溶液洗涤。

所有的免疫染色切片经2位病理医师采用盲法独立评分。肿瘤细胞浆中出现棕黄色颗粒 被认为是阳性信号。染色强度分为4级:0,阴性;1,弱染色;2,中度染色;3,强染色。 阳性细胞百分数分为5级:0,0~5%;1,6~25%;2,26~50%;3,51~75%;4,≥76%。 每个标本的总分数是由肿瘤细胞染色强度和肿瘤细胞阳性百分数两部分的乘积得出的,范围 是0~12。为了方便统计,我们把所有病例分为低表达和高表达2组,1代表低表达组,2代 表高表达组,其cut-off值根据X-tile软件确定。δ-catenin:0~7分为低表达组,8~12分为 高表达组;Dynamin-2:0~4分为低表达组,6~12分为高表达组;Erbin:0~1分为低表达 组,2~12分为高表达组;LAP-1:0~4分为低表达组,6~12分为高表达组。

4个指标联合起来判断食道癌患者预后的方程式如下。

Y=α×A+β×B+γ×C+δ×D,其中α、β、γ、δ为系数,通过Cox回归可以得出数值,故方程 式变为Y=0.367×A+0.349×B+0.556×C+0.410×D。A、B、C、D为该例标本中4个蛋白的表达 状态,1代表低表达,2代表高表达。计算出每例标本的Y值后按照从小到大的顺序排列, 其中位于中间位置的病例对应的Y值为cut-off值,即2.092。小于等于该值的病例为低危组, 高于该值的病例为高危组,这样分成2组后再进行单因素统计分析。此外,也可以通过绘制 ROC曲线去比较每个蛋白形成的曲线下面积(AUC)的大小。

数据的统计学处理。

使用SPSS13.0统计软件处理数据。各蛋白的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿 瘤位置、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移状态、TNM分期之间的关系使用Chi-Square 检验;各蛋白的表达与患者的生存时间的关系使用Kaplan-Meier生存分析;预测影响患者预 后的独立危险因素使用Cox比例风险回归模型;每种蛋白预测食道癌患者预后的效能使用 ROC曲线;P<0.05被认为有统计学显著性。

结果显示:4个蛋白的表达都与食道癌患者的TNM分期及淋巴结转移状态密切相关。

Cox风险回归模型检测各蛋白单独或联合表达后的Risk值及是否是患者预后的独立危险 因素如下。

δ-catenin的表达状态与患者的生存时间密切相关,并且还是独立的预后因子(Risk=1.775, 95%CI=1.282-2.459,P=0.001)。

Dynamin-2的表达状态与患者的生存时间密切相关,但不是独立的预后因子(Risk=1.295, 95%CI=0.933-1.798,P=0.123)。

Erbin的表达状态与患者的生存时间密切相关,但不是独立的预后因子(Risk=1.215,95% CI=0.867-1.705,P=0.258)。

LAP-1的表达状态与患者的生存时间密切相关,但不是独立的预后因子(Risk=1.417,95% CI=0.951-2.111,P=0.087)。

4个蛋白联合具有更强的食道癌预后预测能力,同时也是独立的预后因子(Risk=1.854, 95%CI=1.336-2.574,P<0.001),甚至高于TNM分期(Risk=1.798,95%CI=1.290-2.507, P=0.001)和淋巴结转移状态(Risk=1.781,95%CI=1.272-2.493,P=0.001)的预测能力。

4个蛋白联合后形成的ROC曲线面积是最大的,同时也具有较高的敏感性和特异性。

  AUC(曲线下面积) 敏感性 特异性 TNM staging 0.620 56.5% 67.6% Dynamin expression 0.566 41.6% 71.7% Erbin expression 0.547 59.7% 49.7% LAP-1expression 0.559 22.1% 89.7% δ-catenin expression 0.595 50.6% 68.3% Combined expression 0.62757.1%68.3%

综上,δ-catenin,Dynamin-2,Erbin,LAP-1联合后的Risk值是1.854,高于它们单独评 价患者时相应的Risk值(分别为1.775,1.295,1.215,1.417),甚至高于TNM分期和淋巴 结转移状态所对应的Risk值(分别为1.798,1.781),同时4个指标的联合还是独立的评价食 道癌患者预后的危险因素(P<0.001)。

4个指标联合后得出的Kaplan-Meier生存曲线比每个指标单独评价得出的Kaplan-Meier 曲线差别更明显,且X2值是最大的(X2=18.574),而P值是最小的(P<0.001)。

4个指标联合后得到的ROC曲线下面积是0.627,均大于每种指标单独评价时所形成的 ROC曲线下面积,甚至高于TNM分期所形成的曲线下面积(0.620),同时4个指标联合后 预测食道癌患者的预后也具有较高的敏感性和特异性(分别为57.1%和68.3%),均高于国际 公认的预后评价指标-TNM分期(56.5%和67.6%)。因此说δ-catenin、Dynamin-2、Erbin、 LAP-1联合后评价食道癌患者的预后具有更高的预测价值,并且比TNM分期更好操作及适 用性更强。

评价临床上个体食道癌患者的预后信息时,只需把所得到的该患者4个蛋白表达的免疫 组化分数对应的表达状态数值(1代表低表达,2代表高表达)套入公式 Y=0.367×A+0.349×B+0.556×C+0.410×D中,就可以得出Y值,然后与我们确定的cut-off值 2.092比较,小于该值的患者属于低危组(3年生存率为40.74%),大于该值的患者属于高危 组(3年生存率为21.13%)。

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