一种重组蛋白rPmt4p及其表达与在制备防治侵袭性白念珠菌感染疫苗中的应用

摘要

本发明属于医学和生物工程技术领域，本发明提供了一种重组蛋白rPmt4p及其表达，以及该重组蛋白rPmt4p在制备防治侵袭性白念珠菌感染疫苗中的应用。进一步地，本发明提供了一种预防或治疗侵袭性白念珠菌感染的蛋白疫苗，该蛋白疫苗的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的蛋白疫苗在动物模型中显著增加感染小鼠的生存率，并诱导持久的体液及细胞应答。本发明方法简单，生产成本低廉，易于推广。

说明书

技术领域

本发明属于医学和生物工程技术领域，具体涉及一种重组蛋白rPmt4p及其 表达与在制备防治侵袭性白念珠菌感染疫苗中的应用。

背景技术

随着抗肿瘤放化疗、介入治疗、器官移植术后免疫抑制剂的广泛应用，尤 其是艾滋病的流行，免疫功能低下或缺陷的病人数量不断增加，侵袭性真菌感 染已逐渐成为一种常见病、多发病，并已成为免疫功能低下人群死亡的主要原 因。念珠菌是机会性致病真菌中的主要一属，其中白念珠菌(Candida albicans) 的毒力最强，感染率最高，引起严重的侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)， 死亡率高达40％。我国2013年最新统计数据表明，白念珠菌是侵袭性念珠菌血 症的主要病原菌，占57％左右。

Pmt4p是白念珠菌细胞壁上的甘露糖蛋白(Protein mannosyltransferase)， Prill SK等人研究发现，在小鼠尾静脉注射5×10⁵PMT4基因缺失菌后与野生型 对照组相比存活率是100％，证明了PMT4是与念珠菌菌丝生长及毒力有显著性 关系的基因(Prill SK,et al.(2005)PMT family of Candida albicans:five protein  mannosyltransferase isoforms affect growth,morphogenesis and antifungal resistance. Mol Microbiol 55(2):546-60)。

目前尚无文献报道用生物工程方法制备重组Pmt4p蛋白，也尚无文献报道 Pmt4p蛋白用于预防或治疗侵袭性念珠菌感染的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种白念珠菌细胞壁上的甘露糖重组蛋白rPmt4p， 本发明的另一目的在于提供该重组蛋白rPmt4p的表达，以及该重组蛋白rPmt4p 在制备防治侵袭性白念珠菌感染疫苗中的应用。

本发明人研究发现，白念珠菌SC5314的细胞壁上的甘露糖蛋白Pmt4p (GENBANK NO：3644096)的301至520氨基酸序列，可用于制备一种治疗 侵袭性念珠菌感染的蛋白疫苗。

本发明的第一方面，是提供一种重组蛋白rPmt4p，其氨基酸序列如SEQ ID  NO:1所示。

本发明的第二方面，是提供上述的重组蛋白rPmt4p在制备预防或治疗侵袭 性白念珠菌感染疫苗中的应用。

本发明的第三方面，是提供一种预防或治疗侵袭性白念珠菌感染的蛋白疫 苗，该蛋白疫苗的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

该蛋白疫苗是通过以下方法制备得到的：

A、克隆如SEQ ID NO:2所示的DNA序列；

B、构建含有如SEQ ID NO:2所示的DNA序列的重组质粒；

C、在真核表达系统酿酒酵母INVSc1中表达如SEQ ID NO:1所示的重组蛋 白(rPmt4p)。

步骤A中，克隆DNA序列，以白念珠菌SC5314基因组DNA为模板，引 物PMT4-Exp-F如SEQ ID NO:3所示，引物PMT4-Exp-R如SEQ ID NO:4所 示。

步骤B中，构建重组质粒所用的质粒载体为PYES2/CT质粒。

本发明的具体技术方案如下：

1、Pmt4p蛋白表达基因的克隆

以白念珠菌SC5314基因组DNA为模板，引物PMT4-Exp-F： GCggatccATGTCTAGATCTGGCCCAGGTGATGC(SEQ ID NO:3)及 PMT4-Exp-R：ATTTgcggccgcGAAATTCCAAATATTGTCC(SEQ ID NO:4)扩 增，PCR扩增产物片段长度为660bp(SEQ ID NO:2)；

2、重组真核表达质粒的构建

将上述获得的重组Pmt4p基因片段插入到PYES2/CT质粒中，构建 PYES2/CT-PMT4重组质粒，将上述重组质粒转化感受态细胞DH-5α，重组质粒 酶切鉴定正确后送测序，序列如SEQ ID NO:2所示，重组片段序列与Pmt4p蛋 白301至520氨基酸序列完全一致。

3、阳性重组质粒DNA的转染

将酶切和测序结果都为阳性的重组质粒转染到表达菌株酿酒酵母INVSc1 中。

4、菌落PCR鉴定阳性转染克隆

挑取转染后在SC-ura^-的固体平板上长出的单克隆，每个平板上挑取10个单 克隆，每个克隆加入35μl Zymolyase混匀，37℃孵育60min；孵育后的产物2μl 作为模板用相应的4对引物进行PCR扩增；挑取没有转染重组质粒DNA的 INVSc1单克隆作为阴性对照。

5、基因组PCR鉴定阳性转染克隆

菌落PCR鉴定为阳性的单克隆在SC-ura^-的液体培养基中，30℃培养过夜； 提取基因组；用相应的4对引物进行基因组PCR扩增，并用琼脂糖凝胶电泳验 证。

6、目的重组蛋白的诱导表达

将菌落PCR和基因组PCR都鉴定为阳性的克隆在SC-ura^-的液体培养基中， 30℃振荡培养过夜，调节菌液OD₆₀₀＝0.4，在1500g，4℃条件下，离心5min， 弃上清，加入50ml的诱导培养基重新混匀，30℃振荡培养；分别在不同的时间 点测定OD₆₀₀的值；1500g，4℃，离心5min，弃上清；用1ml灭菌双蒸水洗3 次，-80℃保存备用。

7、目的重组蛋白的提取

收集诱导培养基培养的菌液，1500g，4℃，离心5min，弃上清；用灭菌双 蒸水洗3次，用裂解液重悬细胞，1500g，4℃，离心5min，弃上清；再加裂解 液调整菌液的OD₆₀₀＝1；加入等体积的直径为0.4mm的酸洗玻璃珠，在细胞涡 旋匀浆器上涡旋破碎细胞30s，然后在冰水中停30s，重复6-8次，直至细胞大 部分被裂解；吸出裂解后的菌液，高速离心15000g，4℃，离心10min，取上清 到新的EP管中，-80℃保存备用。

8、BCA法测定蛋白浓度

使用BCA检测试剂盒测蛋白浓度。

9、最佳诱导时间的考察

提取用半乳糖诱导后不同时间点收集的菌液蛋白，用BCA法测定蛋白浓度， 确定最佳诱导时间

10、目的蛋白的纯化

使用Ni螯合的树脂和6×His标签蛋白结合的亲和层析纯化出分子量为30kD 的目的蛋白。

11、Western blot检测表达的目的蛋白

使用10％聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳，蛋白上样量为20-30μg，电泳结束后用 半干法将蛋白转移到NC膜上，加封闭液室温2h；PBST洗液洗膜5次，每次 5min；用Anti-V5的以1:5000稀释后，4℃孵育过夜；孵育结束后用PBST洗液 洗膜5次，每次5min；加二抗DYLightTM800-Labeled Antibody to Mouse IgG (H+L)1:10000稀释后室温孵育2h，孵育过程中轻微的振荡；用PBST洗液洗 膜5次，每次5min；再用PBS洗膜2次，NC膜用Odyssey红外成像系统扫描， 可见目的蛋白条带位置正确。

本发明提供了一种抗侵袭性念珠菌感染的蛋白疫苗制备，并且在动物模型 中显著增加感染小鼠的生存率，并诱导持久的体液及细胞应答。本发明方法简 单，生产成本低廉，易于推广。

附图说明

图1克隆、表达、纯化与鉴定重组蛋白rPmt4p；

M 是marker，

1 以SC5314基因组DNA为模板，PCR扩增产物，有目的660bp条带，

2 空质粒pYES2/CT双酶切的条带，

3 重组质粒pYES2/CT-PMT4双酶切产物，有目的660bp条带。

图2是双酶切验证为阳性的重组质粒DNA测序比对结果。

图3是重组蛋白最佳诱导时间的考察。

图4是重组蛋白表达纯化的SDS-PAGE图；

1   酿酒酵母INVSc1用IPTG诱导结果，

2-4 转染空质粒pYES2/CT的酿酒酵母INVSc1用半乳糖诱导并纯化后的结 果，

5-7 转染重组质粒pYES2/CT-PMT4的酿酒酵母INVSc1用半乳糖诱导并纯化 后的结果，有目的30kD条带。

图5是Western blot检测表达的目的蛋白结果；

1-2 转染空质粒pYES2/CT的酿酒酵母INVSc1表达纯化产物，

3-4 转染重组质粒pYES2/CT-PMT4的酿酒酵母INVSc1表达纯化产物，有 目的30kD条带。

图6是重组蛋白rPmt4p免疫后系统性念珠菌感染小鼠的生存率结果。

图7是重组蛋白rPmt4p免疫后系统性念珠菌感染小鼠的脏器活菌数检测。

图8是重组蛋白rPmt4p免疫之后抗血清中IgG及IgM对rPmt4p抗原及SC5314 活菌抗原的效价；其中A是重组蛋白rPmt4p免疫之后抗血清中IgG及IgM对 rPmt4p抗原的效价，B是重组蛋白rPmt4p免疫之后抗血清中IgG及IgM对 SC5314活菌抗原的效价。

图9是重组蛋白rPmt4p免疫后抗血清中细胞因子的含量。

图10是重组蛋白rPmt4p免疫后抗血清对中性粒细胞杀伤作用。

图11是重组蛋白rPmt4p免疫后抗血清与氟康唑协同抗菌作用。

图12是质粒pYES2/CT图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明 范围的限制。

本发明用以构建真核表达载体的基本骨架为pYES2/CT(购自Invitrogen， 英潍捷基(上海)贸易有限公司)，构建过程以及制备过程中，质粒扩增所用 的宿主菌为DH5α(购自Takara，宝生物工程(大连)有限公司)；蛋白表达系 统采用酿酒酵母INVSc1(购自Invitrogen，英潍捷基(上海)贸易有限公司)。

实施例1：重组蛋白rPmt4p表达基因的克隆

一、提取白念珠菌的全基因组序列

SC5314在YPD液体培养基中，30℃振荡培养16h；收集菌液500μl，3000rpm， 离心5min，吸去上清；加入120μl YD Digestion Buffer混匀，再加5ul R-Zymolyase 混匀，37℃孵育1h；加入120μl YD lysisi Buffer，温和的混匀，加250μl的氯仿， 彻底混匀1min，10000rpm，离心2min，吸出最上层液体(注意不要吸到中间的 细胞壁层)放入Zymo-SpinIIIcolum柱中，静置1min，10000rpm，离心1min； 加入300μl DNA wash buffer，室温静置1min，10000rpm，离心1min；用DNA wash  buffer重复洗两次，将Zymo-SpinIIIcolum柱放到一个新的EP管中，在膜上加 入月50μl的DNA洗脱液，静置15min，10000rpm，离心1min；多功能酶标仪 定量，-80℃保存备用。

二、目的基因的PCR扩增及载体构建

为了获得Pmt4p蛋白300至520氨基酸表达基因，以上述基因组为模板，设 计合成引物如下：

PMT4-Exp-F：GCggatccATGTCTAGATCTGGCCCAGGTGATGC

PMT4-Exp-R：ATTTgcggccgcGAAATTCCAAATATTGTCC

并按照下述PCR体系及扩增条件克隆PMT4基因片段。

PCR反应体系及扩增条件如下表1及表2所示：

表1：PCR反应体系

表2：PCR反应条件

循环结束后，产物经电泳(见图1)鉴定大小正确后于4℃保存，长期保存 需移至-20℃或-80℃条件。

PCR产物的酶切及纯化：酶切反应体系如表3所示：

表3：PCR产物的酶切反应体系

双酶切后的基因片段与用相同的限制性内切酶酶切过的载体质粒PYES2/CT 在连接酶的作用下连接起来，连接体系如表4所示：

表4：酶切后连接体系

16℃过夜

连接产物的转化，具体步骤如下：

把连接有目的基因的载体质粒PYES2/CT转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞 中。从-80℃取出感受态大肠杆菌DH5α到冰浴溶解；30μl感受态大肠杆菌加5μl 连接有目的片段的载体质粒，加双蒸水至100μl，混匀，冰浴20min；42℃热休 克60-90s，冰浴2min；加入900μl LB液体培养基，37℃培养振荡1h， 3000-6000rpm，离心15s；吸去上清900μl，剩下100μl吹打混匀，100μl涂在含 有100μg/ml Ampicillin的LB平板上，待平板析干后倒置于37℃温箱培养过夜。 提取质粒，双酶切鉴定并测序，结果如图2所示。

实施例2：重组蛋白的诱导剂检测

实验流程如下：

1、将菌落PCR和基因组PCR都鉴定为阳性的克隆在SC-ura^-的液体培养基 中，30℃振荡培养过夜，调节菌液OD₆₀₀＝0.4，在1500g，4℃条件下，离心5min， 弃上清，加入50ml的诱导培养基重新混匀，30℃振荡培养；分别在不同的时间 点测定OD₆₀₀的值；1500g，4℃，离心5min，弃上清；用1ml灭菌双蒸水洗3 次，-80℃保存备用。

2、收集诱导培养基培养的菌液，1500g，4℃，离心5min，弃上清；用灭菌 双蒸水洗3次，用裂解液重悬细胞，1500g，4℃，离心5min，弃上清；再加裂 解液调整菌液的OD₆₀₀＝1；加入等体积的直径为0.4mm的酸洗玻璃珠，在细胞 涡旋匀浆器上涡旋破碎细胞30s，然后在冰水中停30s，重复6-8次，直至细胞 大部分被裂解；吸出裂解后的菌液，高速离心15000g，4℃，离心10min，取上 清到新的EP管中，-80℃保存备用。

3、提取用半乳糖诱导后不同时间点收集的菌液蛋白，用BCA法测定蛋白 浓度，确定最佳诱导时间。使用Ni螯合的树脂和6x×His标签蛋白结合的亲和 层析纯化出目的蛋白。提取SC5314念珠菌蛋白用Western blot检测表达的目的 蛋白。

验证的结果见图3、4、5。图3结果表明，半乳糖诱导12h时，重组蛋白rPmt4p 表达量最高；图4、5结果表明，用半乳糖诱导并纯化后能得到目的重组蛋白 rPmt4p30kD条带。

实施例3：本发明重组蛋白rPmt4p疫苗的免疫应答实验

为了验证重组蛋白rPmt4p的有效性，我们将雌性BALB/c小鼠(6-8周龄) 随机分为4组，10只/组，经皮下注射途径免疫，再通过尾静脉注射1×10⁶cells/ 只的SC5314。实验分组见表5，结果见图6。

表5 实验分组

重组蛋白rPmt4p20μg/只与完全弗氏佐剂以1:1体积混合乳化，形成油包水 的乳剂后对小鼠多点皮下注射进行免疫；21天后，10μg/只的重组蛋白rPmt4p 与不完全弗氏佐剂以1:1的体积混合乳化，形成油包水的乳剂后对小鼠多点皮下 注射进行加强免疫；在加强免疫两周以后用1×10⁶cells/只的SC5314攻击，观察 15天内小鼠的存活情况。结果如图6显示，重组蛋白rPmt4p的保护率可达54.5％。

每组取5只小鼠在用SC5314感染5天后颈部脱臼处死，取出小鼠的心、肝、 脾、肺、肾、脑，检测脏器活菌落数目(CFU)，结果如图7所示。在用SC5314 攻击后，与空白组和仅用佐剂免疫组相比，重组蛋白rPmt4p免疫组，除了脾和 肺以外，在心、肝、脑、肾中的真菌负荷都均有显著的减少，尤其是在肾脏中。 结果证明：小鼠机体对重组蛋白rPmt4p的免疫应答可在减少组织的真菌负荷， 从而在保护机体抵抗白念珠菌感染的过程中起着重要的作用。

在免疫第35天收集的血清中IgG及IgM的效价不论是在以rPmt4p为抗原 或活SC5314菌为抗原，与为免疫相比显著升高，如图8所示。此外，血清中细 胞因子如TNF-α、IL-17A、IL-12、IL-10、IL-4在免疫组都显著升高，结果见图 9。

用重组蛋白rPmt4p免疫小鼠后的抗血清10％及20％可以提高中性粒细胞对 白念珠菌的杀伤作用，结果如图10所示。

10％的抗血清还可以协同氟康唑对白念珠菌的杀伤作用，如图11所示。

以上实验证明，通过皮下免疫重组蛋白rPmt4p可以产生较强的体液免疫应 答及细胞免疫应答，诱导产生细胞因子，对侵袭性念珠菌感染有较好的保护作 用。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业 的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中 描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还 会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发 明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。