响应环境水分胁迫的水稻干旱诱导型启动子POsDro4

摘要

本发明提供一种响应环境水分胁迫的水稻干旱诱导型启动子POsDro4及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒和植物表达载体。具体而言，本发明的发明人发现、提取并鉴定了一种水稻干旱诱导型启动子，并将上述启动子应用在植物基因工程中。本发明提供的启动子在受到环境水分胁迫时特异性的驱动外源基因在植物中表达，因此可以用于提高和改善水稻的生长特性和耐逆性，从而培育出理想的水稻品种。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明 涉及一种植物干旱诱导基因表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转 基因调控体系中驱动目标基因受到环境水分胁迫时适量表达。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，世界上三分之一以上的人口都以稻米为主食， 其生产规模的稳定与发展，在粮食生产中占有举足轻重的位置。干旱等 非生物逆境一直是限制作物生长和产量的重要因素，并且随着全球环境 恶化、气候异常等变化将日益危害着我国的粮食生产安全。

近年来，随着经济的发展，全球范围内对稻米产量和品质提出了越来 越高的要求，由于分子生物学的不断发展，转基因已经成为研究功能基因 组学的有效手段，并且通过转基因途径改良植物抗逆性正逐步得到可行 性论证和普遍接受。因此，通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和 提高水稻单产、改良稻米品质，在农业生产中具有很好的应用前景。

由于启动子是基因表达调控因子中最重要的因子，基本决定一个基 因是否表达、何时表达和何处表达。由于诱导型启动子使基因的表达往 往只限于某些特定的器官和部位，不仅能使目的基因的表达产物在该器 官和组织积累，增加区域表达量，同时可避免植物体内不必要的营养浪 费减少对植物生长的副作用。因此，利用此类启动子驱动外源基因在相 应的组织特异表达，能更好地适应植物的自然生理规律，使外源基因在 植物中定向、安全、高效地表达。

在水资源日益缺乏、旱灾频发的今天，降低水稻的用水量，提高水 资源的有效利用率已成为育种家们关注的主要课题。水稻又是耗水第一 大户，因此，培育耐旱水稻品种是节约水资源和提高水资源利用率的一 个重要途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种响应环境水分胁迫的水稻干旱诱导型启动 子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。为了实现上述 目的，本发明的发明人发现、克隆并鉴定了一个响应环境水分胁迫的植物 内源干旱诱导型启动子，并利用该启动子构建抗旱相关基因表达载体， 通过遗传转化方法达到提高植物的抗旱性的目的。

具体而言，一方面，本发明提供一种响应环境水分胁迫的水稻干旱诱 导型启动子，所述响应环境水分胁迫的水稻干旱诱导型启动子包含序列表 中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序 列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的水稻干旱诱导表 达启动子，本文中称为POsDro4或启动子POsDro4。

优选地，本发明提供的响应环境水分胁迫的水稻干旱诱导型启动子的 DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列，即POsDro4或启动子POsDro4。

另一方面，本发明提供一种响应环境水分胁迫的水稻干旱诱导型启动 子，所述响应环境水分胁迫的水稻干旱诱导型启动子为在SEQ ID No:1所 示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突 变体或等位基因或衍生物。

另一方面，本发明还提供一种包含上述响应环境水分胁迫的水稻干旱 诱导型启动子的表达盒。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含 上述的响应环境水分胁迫的水稻干旱诱导型启动子，在所述重组表达载体 中，所述响应环境水分胁迫的水稻干旱诱导型启动子连接于待表达的基因 序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体 为pCAMBIA1391-POsDro4，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序 列即POsDro4或启动子POsDro4构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达 载体，本文中称为pCAMBIA1391-POsDro4。

另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上 述响应环境水分胁迫的水稻干旱诱导型启动子、上述表达盒、上述重组表 达载体。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

再一方面，本发明提供上述响应环境水分胁迫的水稻干旱诱导型启动 子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述响应环 境水分胁迫的水稻干旱诱导型启动子连接于载体的待表达的基因序列上游 (例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体， 将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子 叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No：1 中相同)：

TGCACGACCTGAGTCTTATTGGGCCCCTGCCTGGGTTGAGTGTGCGGCCCAAGGG CTGGCACGGTCCAGCCCGACGTGTAGGTCGGGCCATGGCGGCCCAATTGACCTAA GGCTAGGCCCGGTCATGCCTGGGCCGTGCTGGGCTAGGTGGCCTAGTTGGCCATC TATACCACTGACCCGTGGGGCCCACACTACTACAGAAACAGAGATTAGTGCCGAT TGGGAAACCCCCTTAGGTGCCGGTTTTCCCAATCGGCACAAGGGAGGTGGCGCTG ATTTGAAATCAAATATGTCCTGGTTACTTAGAACCGACACCTTTTAGGTTCGACG AATAAAAAAAAGCCGGTCCTATGCATCGGCTTGAGCCGAGCAGTCCCTCAACTAC TCTACTCATCAAGAACAAGACTGAATAAGTAAATCCGCATCACATTCATCAAGAA CAAGAATGAACAAGAACATTCATCACAGCAAGCACATCCGCATCCACATCCAAC ATTCATCCACAACACAAAATTTGCATCAAATTTATGCAATAAAAAAAAGAAGGG ATTCACACCTCTTCGAGCCGTCGTCTATTGTATGAATTGATACAATAGTTGCTTAC TATTGTATGAATTGGCTATTACATTGGTCATAAATGATTTAGAGTTAGCAGCTGCC TATACTATTAAACTTGCTCTAATTCTATAGAGGTTGTTATTATTCTTAATTAAGTG TCCTTTCAGTAAAAGCATTTATATAGAGAGAGAGAGGATTATAAGTCGGAATTGC ATACTGTAGTTCTGTACATTTTTATCTCGCATACGTTTCTCCTCGCTCAAATGTCA ACAAGTAATATAGGTGATGTGTTACAGCGCGTACTCCGTTACGGCACGTGTTCAC TCGGTGATACACATCAACTTTATTATTTGCTCCTTTGGATTAGATTACATTAAATA CCTTTATGTGCAAAATCTCCCTCGTGCAGTCTACATATGCACTGTCACTACATCAA GGACAAACGTACGTGTCCCTATGCTCCAACAATAAGGAACATATTCTCAGAGCAG CCCATCTCTCGTCAGCTAGCTCATCACGCAACTCGCACCCTCCTCGCTTCTTTTAG TCCTATATTTGTAAATCAAAATTTAAATGTTGAAACCTAATTTTATGATTTTATCA CCGTAATTTGCTTTATAATATTTATTTTTAAATCCCAAAAATACATACATAAAAGT TTATTTATAAATCTATCTTCTATTATATATTAGTAAAAGTTTAATAAACTTTATAC AAAAGCTCATAAGTCATAAGACATCACTTGACACTCTACTAAATCGCCACGTGAC ATTTTAATAATTGAAGAAAATTAGAAAAAACAAAAAACATTAGCTTTTAATTTTT ATTATGACTAGAAAAAAATGCCCGTACGTTACAACGGGTGAAAATTATTTTAATC TTATTTTTGTTATACAGTATAACTAAAGTAAAATTTCACTGTGAGAATTCGCTTGA TATATATTCTTTTAGAAAATCAGGAGCTGTAATTAGGAATCCGATCATCTCAAGTT ATATTGCAAACAAACTTCTCAAATACGGATATGCATTTTTAAATGCAAATAAACT TACAAATAGACTCATACACGGATAACGTACTAAAATACGAGCAAAAATATCTTTA ATTTTTATAATAGTAGAGATTAATAAAGCATGTTGAATATATGGATAGGTATAAG CTAAACGAGGGGACATTGAGTTCAGTCTACGATACGCCTGGAAAAGATAACAAA AATAACCGAAAGAATGCCGTGAAACCCAACACGCGTCCCATGCAAATCCTATCC GTTTTGCAGCTTGCCACGCTTCTACACACAACCAGAAGAAGTCACAGGCCAACGA CGAATCTATAAATGATACATCCACCAAACTGCACAGCACTTCAGCTGCAACGGAG AAATCGACGCAAAAACAAACCGCAGAAAGAAAGAAAAAAACAAGAAAGGCAAG AAAGCTACTGGTTTTCAGCTCGATCATCTTGTGATTAGCTCACACACTTTTTGCCA CCTTTTTGC

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表 示的序列“TGCACGACCTGAGTCTTATTGG”为获得启动子过程中使用的正向引物 的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列 “ACACTTTTTGCCACCTTTTTGC”为获得启动子过程中使用的反向引物的留 存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序 列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文 中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留 存序列后的DNA序列。即便后续本领域技术人员基于本发明的描述通过其 他引物，也提取出了上述启动子的核心部分，其也落入本发明的保护范围。

综上所述，本发明的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv. Nipponbare)中分离克隆LOC_Os10g09850.1基因上游包括转录起始位点在 内的2051bp的DNA序列，并将其命名为POsDro4(序列表中的SEQ ID No: 1)。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得 相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株 EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。 对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在干旱诱导处理 后，根、茎、叶各组织的Gus基因表达水平相对较高并显蓝色，从而证明 该2051bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因 在水稻干旱诱导处理后表达。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成 型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植 物表达载体，经转化后，在干旱诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异 性表达，从而提高外源靶标基因在植物中的表达量，增加转基因的效果。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子POsDro4能够控制所驱动的基因在受到环 境水分胁迫是在植株内诱导表达，在实际应用中特别是植物抗逆性改良中 具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因工程改造，如通过该 启动子调控目标基因在植株中适时表达，可以提高和改善水稻的生长特性 和环境适应性，从而培育出实用有效的转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将POsDro4启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图， 其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-POsDro4示 意图，其中示出了利用POsDro4启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

图3为干旱诱导处理后GUS染色图片，图中A、B、C分别作为非胁 迫对照(正常浇水)的POsDro4：：GUS转基因植株的叶、茎和根组织GUS 染色24小时的结果，D、E、F是干旱胁迫3周后(停止浇水)的POsDro4：： GUS转基因植株的叶、茎和根组织GUS染色24小时的染色结果。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这 些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实 施例中所用的生化试剂、耗材原料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的POsDro4启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare) 全基因组序列，依据水稻POsDro4基因的序列设计扩增引物，并根据选用 的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1A，来自于CAMBIA， 公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测 试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正 向引物(SEQ ID No:2)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物 (SEQ ID No:3)5’端带BamHI，酶切位点(GGATCC)，引物序列如下：

正向引物：AAGCTTTGCACGACCTGAGTCTTATTGG HindIII

反向引物：GGATCCGCAAAAAGGTGGCAAAAAGTGT BamHI 由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子POsDro4的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子 POsDro4，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s， 循环35次；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2051bp，将其连接到 PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上， 按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进 而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳 性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和BamHI进行双酶切验证， 如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的 克隆即为所要获得的启动子POsDro4，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子POsDro4的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒， 用HindIII和BamHI双酶切，回收启动子POsDro4片段。同时利用HindIII 和BamHI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上 述的POsDro4片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司) 进行连接，得到启动子POsDro4与Gus基因融合的植物表达载体 pCAMBIA1391-POsDro4(图1B)，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农 杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基 因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子POsDro4驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有 1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子 40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸 钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚 接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离， 将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农 杆菌转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组 表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子 筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai， et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated  transformation based on phosphomannose isomerase positive selection in  Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。

共获得33株POsDro4-pCAMBIA1391植株(POsDro4：：gus转基因水 稻植株)。

步骤2、POsDro4：：gus转基因水稻植株的水分胁迫处理

以正常生长3周的转基因水稻植株为材料，在填满土壤的75cm高， 20cm直径PVC管中种植，在浇透水分后，持续三周不浇水，植株叶片干 至出现萎蔫，取叶片材料进行GUS组织化学染色。同时，以持续浇水的植 株材料为对照。

步骤3、GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as a  sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987， 6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中， 37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95％乙醇处理，至阴性对照材料 呈白色。结果显示，持续不浇水的POsDro4：：gus转基因水稻植株的根、 茎、叶组织经GUS染色后呈现蓝色，而保持浇水的对照POsDro4：：gus转 基因水稻植株的根、茎、叶组织无染色。结果说明，在水分胁迫(缺水) 条件下，启动子POsDro4能够驱动Gus基因在水稻植株中高水平表达，结 果见图3。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员 可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属 于本发明所附权利要求的范围。