一种用于制备肝细胞靶向转递小干扰RNA的方法

摘要

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种用于制备肝细胞靶向转递小干扰RNA的方法。本发明公开了一种用于制备肝细胞靶向转递小干扰RNA的方法，反应底物包括乳糖酸或半乳糖衍生物、末端氨基修饰RNAi多核苷酸和EDC，其中，乳糖酸或半乳糖衍生物作为耦合反应的羧基供体和靶向耦合物的半乳糖基供体，末端氨基标记RNAi多核苷酸作为耦合反应的伯氨基供体，EDC作为零长度交联剂。本发明所公开的方法操作简便、产率高、活性好，实现了小干扰RNA与肝细胞特异性配基―半乳糖基的共价耦合，耦合物被肝细胞特异性摄取后，表现出针对目标基因的沉默活性。

说明书

技术领域

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种用于制备肝细胞靶向转递小干扰RNA的方法。

背景技术

RNA干扰(RNAi)为由一类小干扰RNA分子介导的转录后基因沉默现象，广泛应用于基因功能鉴定和基因治疗研究领域。小干扰RNA分子通常是由19～23对碱基构成的双链结构，分子量13～15kd，携带38～40个净负电荷，因此小干扰RNA裸分子自身无法穿越负电荷细胞膜，常需要阳性脂质体包裹携带转染细胞。此外，小干扰RNA系统使用时，其生物分布十分广泛，在肝、肾、心、脾、肠等多脏器广泛分布，造成靶组织内RNAi活性不足，补偿性加量后易出现靶外基因沉默、免疫刺激和miRNA竞争抑制等副作用。因此，小干扰RNA药物转化的主要障碍在于缺乏理想的高效细胞靶向转递手段。

肝脏作为人体的重要代谢器官，易受病毒感染、代谢性疾病、肿瘤等的侵害。提高小干扰RNA裸分子靶向进入肝细胞是加快RNAi治疗肝疾时药物转化的关键。目前，协助小干扰RNA肝细胞靶向转递媒介物大体可分为病毒载体和非病毒载体两类。前者转染效率高，其靶向性的实现可通过肝细胞特异性启动子获得，但免疫排斥反应和基因重组风险限制其临床转化。非载体类靶向转递可以借助阳离子复合物(脂质体或多聚体)或化学修饰等手段，将有肝细胞特异识别能力的配基以共价键或非共价键的方式与小干扰RNA结合得以实现。其中，非共价键结合是小干扰RNA肝细胞靶向转递研究的常见技术。

非共价键结合小干扰RNA靶向复合物优势在于方法灵活多样，不改变小干扰RNA分子结构，体外研究结果较为理想。如Oishi(2007年)将半乳糖化聚乙二醇和多聚赖氨酸形成非共价键复合体，依靠静电携带小干扰RNA(颗粒直径110nm)。体外示踪表明复合物顺利地转入了Huh7细胞。再如，Kim(2007年)将脂质体、胆固醇、载脂蛋白apoA-Ⅰ静电结合小干扰RNA，形成小干扰RNA非共价键复合物，体外转递肝细胞，其摄取量是无apoA-Ⅰ的3倍。Sato(2007年)利用半乳糖化胆固醇衍生物(C4-chol)与中性脂质体DOPE及小干扰RNA非共价键结合成75.3±5.8nm的复合物颗粒，体内实验表明约80％的小干扰RNA复合物分布于肝实质细胞。

非共价靶向小干扰RNA复合物不足在于非共价键导致结构不稳定，易降解；直径过大(＞50nm)，难以通过毛细血管壁，容易被肝Kupffer细胞清除；激活补体系统，易被网状内皮系统清除；药代指标不理想，药物转化空间不大。

配基与小干扰RNA依靠共价键结合后肝细胞转递的优势明显，形成的耦合物分子均质，可控性好，容易纯化。配基化小干扰RNA单分子直径小，容易通过肝血窦毛细血管壁，药代学指标清晰。如，利用胆固醇主要在肝脏代谢的特点，Lorenz和Soutschek(2004年)将胆固醇与小干扰RNA正义链5’端共价耦合后发现，稳定性明显提高(半衰期95min，血浆清除率0.5mL/min)。虽然其在心、肺、脂肪等多组织器官均有分布，但以肝脏和空肠摄取最多。再如，Rozema(2007年)以半乳糖胺为配基，将丁基-氨基-乙烯醚聚合物通过侧链羧基二甲基酐键与聚乙二醇和N-乙酰半乳糖胺共价连接后，与小干扰RNA5’端二硫键共价结合，形成大小为10nm的单分子化合物。体外转染证实其具有与阳性脂质体siQUEST相同的肝细胞转染效率，可降低目标基因表达80％。体内主要分布在肝细胞，只少量被肝窦非实质细胞和肾、脾摄取。

配基与小干扰RNA共价键结合相关技术较少见诸报道，主要障碍在于耦联反应条件要求较高，需要设计更为简便、巧妙的中间桥联分子。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于制备肝细胞靶向转递小干扰RNA的方法，该方法可以实现小干扰RNA与肝细胞特异性半乳糖配基的共价连接，利用该方法合成的半乳糖化小干扰RNA耦合物具有不依赖于脂质体的靶向转递肝细胞特性。

为此，本发明公开了一种用于制备肝细胞靶向转递小干扰RNA的方法，反应底物包括乳糖酸或半乳糖衍生物、末端氨基修饰RNAi多核苷酸和1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺(EDC)，其中，乳糖酸或半乳糖衍生物作为耦合反应的羧基供体和靶向耦合物的半乳糖基供体，末端氨基标记RNAi多核苷酸作为耦合反应的伯氨基供体，EDC作为零长度交联剂。

所述方法包括下列步骤：0.05M～0.1M2-吗啉乙磺酸钠(MES)缓冲液pH4.5中进行，乳糖酸与末端氨基标记RNAi多核苷酸摩尔比例为1：1～2000：1，EDC与乳糖酸摩尔比例为1：1～100：1。

在一实施例中，所述方法为25mM乳糖酸、12.5μM末端氨基标记RNAi多核苷酸与0.1M EDC三者混合于0.1M MES pH4.5缓冲液中，短暂振荡后离心，于25℃反应2h或4℃过夜，使羧基与伯氨基发生缩合反应，形成半乳糖化RNAi多核苷酸共价耦合物。

本发明所公开的方法实现了小干扰RNA与肝细胞特异性配基――半乳糖基的共价耦合，在肝细胞膜表面去唾液酸糖蛋白受体介导下，在体外细胞水平表现出不依赖于阳性脂质体转染试剂的特异性肝细胞摄取。转递后，半乳糖化小干扰RNA耦合物能够表现出针对目标基因的沉默活性。基于同样技术，本发明所建立的肝细胞靶向转递小干扰RNA技术还可用于其它核酸分子的肝细胞靶向转递。

附图说明

图1M：5bp DNA Marker；1、裸NH2-siRNA，4μg/100μL；2、半乳糖化小干扰RNA，1.5μg/100μL

图2Huh7肝细胞摄取半乳糖化小干扰RNA共价耦合物

半乳糖化小干扰RNA浓度分别为1：0μM；2：1μM；3：2μM；4：4μM；5：0.2μM的裸siRNA和X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent；A：Huh7细胞，B：MDA细胞。

具体实施方式

术语“RNA干扰(RNAi)多核苷酸”是能诱导RNA干扰的分子，其通过与哺乳动物细胞的RNA干扰通路组成部分相互作用以序列特异方式降解或抑制转基因的信使RNA(mRNA)转录本翻译。两种主要RNAi多核苷酸是小(或短)干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA)。RNAi多核苷酸可选自下组:siRNA、微RNA、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码能诱导RNA干扰的表达盒。siRNA包括的双链结构通常含15-50个碱基对，优选21-25个碱基对，并具有与细胞内所表达靶基因或RNA中编码序列相同(完美互补的)或几乎相同(部分互补的)的核苷酸序列。siRNA还具有3'双核苷酸突出。siRNA可由形成发夹结构的两个退火多核苷酸或单核苷酸组成。本发明的siRNA分子包含有义区域和反义区域。在一个实施方式中，偶联物的siRNA从两种寡核苷酸片段中组装，其中一种片段包含所述siRNA分子反义链的核苷酸序列，且第二片段包含所述siRNA分子有义链的核苷酸序列。在另一实施方式中，有义链通过接头分子如多核苷酸接头或非核苷酸接头连接反义链。微RNA(miRNA)是约22个核苷酸长度的非编码小RNA基因产物，指导其mRNA靶标的破坏或翻译抑制。若miRNA和靶mRNA之间是部分互补，则所述靶mRNA的翻译被抑制。若广泛互补，则所述靶mRNA被切割。对于miRNA，所述复合物结合通常位于mRNA3！UTR的靶位点，其通常仅与所述miRNA部分同源。“种子区域”为miRNA5'末端的一段约七(7)个连续核苷酸，与其靶标形成完美碱基配对-在miRNA特异性中起关键作用。RISC/miRNA复合物与mRNA的结合可导致蛋白翻译抑制或mRNA的切割和降解。近期数据表明若沿着全长miRNA和其靶标有完美同源性而不是仅在种子区域显示完美碱基配对，则mRNA切割优选发生(Pillai等，2007)。

RNAi多核苷酸表达盒可在细胞中转录产生小发夹RNA，其能作为siRNA、分离的有义和反义链线性siRNA或miRNA行使功能。RNA聚合酶III转录的DNA含有选自下表的启动子:U6启动子、H1启动子和tRNA启动子。RNA聚合酶II启动子包括Ul、U2、U4和U5启动子、snRNA启动子、微RNA启动子和mRNA启动子。

已知miRNA序列的列表可在研究组织维护的数据库中找到，如维尔康姆基金会桑格研究所(Wellcome Trust Sanger Institute)、宾州生物信息中心(Penn CenterforBioinformatics)、斯隆凯特林癌症纪念纪念中心(Memorial Sloan KetteringCancerCenter)和欧洲分子生物实验室等。已知的有效siRNA序列和关联结合位点也在相关文献中充分记述。RNAi分子容易用本领域已知的技术设计和生产。此外，计算工具可用于增加发现有效和特异性序列基序的可能性(Pei等2006,Reynolds等2004,Khvorova等2003,Schwarz等2003,U1-Tei等2004,Heale等2005,Chalk等2004,Amarzguioui等2004)。

本发明的RNAi多核苷酸可被化学修饰。该化学修饰的非限制性示例包括:硫代磷酸酯核苷酸间连接、2'-O-甲基核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核糖核苷酸、2'-脱氧核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、和倒置脱氧脱碱基残基掺入。用于各种多核苷酸结构时，这些化学修饰显示在细胞中保持多核苷酸活性，同时增加这些化合物的血清稳定性。化学修饰的siRNA还可使人中干扰素活性激活的可能性最小化。

在一个实施方式中，本发明的化学修饰RNAi多核苷酸包括具有两条链的双链体，其一或二者可化学修饰，其中各链为约19～约29核苷酸。在一个实施方式中，本发明的RNAi多核苷酸包括一种或多种修饰的核苷酸，同时保持在细胞内介导RNAi或在体外系统中重建的能力。RNAi多核苷酸可经修饰，其中化学修饰包括一个或多个(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)核苷酸。本发明的RNAi多核苷酸可包括修饰的核苷酸，其占RNAi多核苷酸中所存在核苷酸总数的某一百分比。同样，本发明的RNAi多核苷酸通常可在约5～约100％(如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的核苷酸位置)的核苷酸位置上包括修饰的核苷酸。给定RNAi多核苷酸中存在的修饰核苷酸的实际百分比取决于所述RNAi多核苷酸中存在的核苷酸总数。若RNAi多核苷酸是单链，则修饰百分比可基于单链RNAi多核苷酸中存在的核苷酸总数。同样，若RNAi多核苷酸是双链，则修饰百分比可基于有义链、反义链或有义和反义链二者中存在的核苷酸总数。此外，给定RNAi多核苷酸中存在的修饰核苷酸的实际百分比还可取决于所述RNAi多核苷酸中存在的嘌呤和嘧啶核苷酸总数。例如，其中RNAi多核苷酸中存在的所有嘧啶核苷酸和/或所有嘌呤核苷酸经过修饰。

RNAi多核苷酸调控基因编码的RNA表达。由于多种基因可彼此共有一定程度的序列同源性，所以RNAi多核苷酸可设计为靶向具有足够序列同源性的一类基因。因此，RNAi多核苷酸可包括与不同基因靶标之间共有或对特异基因靶标独特的序列互补的序列。因此，RNAi多核苷酸可设计为靶向具有数种基因之间同源性的RNA序列的保守区域，从而靶向基因家族中的数种基因(如不同基因同种型、剪接变体、突变基因等)。在另一实施方式中，RNAi多核苷酸可设计为靶向对单一基因中特异RNA序列独特的序列。

术语“互补”指多核苷酸与另一多核苷酸序列通过常规沃森克里克或其他非常规类型形成氢键的能力。涉及本发明的多核苷酸分子时，多核苷酸分子与其靶标(有效结合位点)或互补序列的结合游离能量足以推进所述多核苷酸的相关功能，如酶的mRNA切割或翻译抑制。核酸分子结合游离能量的测定为本领域熟知(Frier等1986,Turner等1987)。互补百分比表示第一多核苷酸分子中毗连链的碱基百分比，所述分子可与第二多核苷酸序列形成沃森-克里克碱基配对。完美互补表示多核苷酸序列的毗连链中所有碱基与第二多核苷酸序列中相同数量的连续碱基形成氢键。

抑制、下调或敲减基因表达表示如用所述基因转录的RNA水平或从所述RNA翻译的多肽、蛋白或蛋白亚基水平所测量，所述基因的表达低于没有阻断本发明多核苷酸偶联物时观察到的水平。用本发明组合物所递送多核苷酸进行的基因表达抑制、下调或敲减，优选低于存在对照失活核酸(序列杂乱的核酸或钝化错配的核酸)时或所述多核苷酸未偶联掩蔽聚合物时观察到的水平。

RNAi多核苷酸偶联物

RNAi多核苷酸偶联物提供了改良的RNAi多核苷酸体内递送。功能性递送表示所述RNAi多核苷酸递送到细胞并预期具有生物学活性、基因表达的序列特异性抑制。给予哺乳动物脉管系统的许多分子(包括多核苷酸)通常由肝脏从身体中清除。肝脏对多核苷酸的清除中所述多核苷酸发生降解或另外加工以从身体中去除且其中所述多核苷酸没有引起基因表达的序列特异性抑制，所述清除不视作功能性递送。

通过共价连接所述RNAi多核苷酸和所述靶向配体部分形成RNAi多核苷酸偶联物。可以合成或修饰所述多核苷酸使其含有反应基团A。可以合成或修饰所述靶向部分使其含有反应基团B。选择反应基团A和B，从而其能用本领域已知的方法通过共价键而连接。

所述靶向部分连接所述RNAi多核苷酸的3'末端。对于siRNA多核苷酸，所述靶向部分可连接有义链或反义链，尽管优选有义链。在一些实施方式中，所述siRNA通过含有反应基团A(例如伯胺基团)的短烷基链连所述接靶向部分。然后，反应基团A偶联靶向部分上的反应基团B(例如羧基基团)。

为了靶向肝内的肝细胞，优选的靶向配体是半乳糖簇。半乳糖簇包含具有2～4种末端半乳糖衍生物的分子。如本文所用，术语半乳糖衍生物包括半乳糖和对去唾液酸糖蛋白受体的亲和性等于或超过半乳糖的半乳糖衍生物。末端半乳糖衍生物通过其C-1碳连接分子。去唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)对肝细胞独特并结合分支的半乳糖末端糖蛋白。优选的半乳糖簇具有各自对去唾液酸糖蛋白受体具有亲和性的3种末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物。更优选的半乳糖簇具有3种末端N-乙酰-半乳糖胺。本领域其他常见术语包括三触角型(tr1-antennary)半乳糖、三价半乳糖和半乳糖三聚体。已知三触角型半乳糖衍生物簇以比二触角型或单触角型半乳糖衍生物结构更强的亲和性结合ASGPr(Baenziger和Fiete,1980，Cell,22，611-620；ConnoIIy等，1982，J.Biol.Chem.，257，939-945)。需要多价以获得nM亲和性。与递送聚合物共给予时，提高单半乳糖衍生物浓度可以模拟出多触角型半乳糖衍生物的受体亲和活性。

半乳糖簇含各自连接中央分支点的三种半乳糖衍生物。所述半乳糖衍生物通过所述糖的C-1碳结合中央分支点。半乳糖衍生物优选通过接头或间隔子连接所述分支点。优选的间隔子是灵活的亲水间隔子(美国专利5885968；Biessen等J.Med.Chem.1995Vol.39ρ.1538-1546)。优选的灵活亲水间隔子是PEG间隔子。优选的PEG间隔子是PEG3间隔子。分支点可为任何小分子，其允许所述三种半乳糖衍生物结合，还允许所述分支点结合RNAi多核苷酸。示例性分支点基团是二赖氨酸。二赖氨酸分子含三种胺基(可通过其结合三种半乳糖衍生物)和羧基反应基团(二赖氨酸可通过其结合RNAi多核苷酸)。分支点与RNAi多核苷酸的结合可通过接头或间隔子发生。优选的间隔子是灵活的亲水间隔子。优选的灵活亲水间隔子是PEG间隔子。优选的PEG间隔子是PEG3间隔子(三个乙烯单元)。所述半乳糖簇还可用本领域已知方法连接所述RNAi多核苷酸的3'或5'末端。对于具有2条链的RNAi多核苷酸，例如siRNA，所述半乳糖簇可连接除反义链5'末端的其余任意末端。

优选的半乳糖衍生物是N-乙酰-半乳糖胺(GalNAc)。对去唾液酸糖蛋白受体具有亲和性的其他糖可选自含有以下的列表:半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。已研究大量半乳糖衍生物对去唾液酸糖蛋白受体的亲和性(参见例如:1bst,S.T.和Drickamer，K.J.B.C.1996，271，6686)或其易用本领域一般方法确定。

体内给药方式

药理学和毒理学中，给药途径是使药物、液体、毒剂或其他物质接触身体的途径。通常，用于治疗哺乳动物的药物和核酸给予方法为本领域熟知，且可用于给予本发明组合物。本发明化合物可通过任何合适途径在根据所述途径适当调整的制剂中应用，最优选肠胃外。因此，可通过注射，例如静脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内注射给予本发明化合物。因此，本发明还提供含有药学上可接受载体或赋形剂的药物组合物。

给予的肠胃外途径包括脉管内(静脉内、动脉内)、肌肉内、实质内、皮内、真皮下(subdermal)、皮下(subcutaneous)、肿瘤内、腹膜内、鞘内、硬膜下、硬膜外和淋巴内注射，使用注射器和针或导管。本文所述脉管内表示称为脉管的管状结构内，其连接体内的组织或器官。所述管状结构的腔内，体液流向或流自身体部分。体液的示例包括血液、脑脊液(CSF)、淋巴液或胆汁。脉管的示例包括冠状动脉、细动脉、毛细管、小静脉、窦状小管、静脉、淋巴管、胆管和唾液腺管或其他外分泌腺管。脉管内途径包括通过诸如动脉或静脉等血管的递送。血液循环系统提供药物的全身扩散。

所述RNAi多核苷酸靶向部分偶联物在药学上可接受载体溶液中注射。药学上可接受指药理学/毒理学角度上哺乳动物可以接受的那些特性和/或物质。短语药学上可接受指给予哺乳动物时生理上可耐受且通常不产生过敏或其他不利或毒性反应的分子实体、组合物和特性。本文所用术语“药学上可接受”优选指被SFDA批准，或中国药典或其它公认药典所列用于动物应用，更具体用于人。

治疗效果

RNAi多核苷酸靶向部分偶联物用于研究目的或用于在治疗细胞中产生变化。RNAi多核苷酸靶向部分偶联物用于研究试剂和各种治疗、诊断、靶标确认、基因组开发、基因工程改造和药物基因组应用。

肝脏是基因治疗最重要的靶组织，因为其在代谢(如各种血胆脂醇过多中的脂蛋白代谢)和循环蛋白(如血友病中的凝结因子)分泌中起关键作用。此外，常见获得性疾病如慢性肝炎和硬化且也可能用基于多核苷酸的肝脏疗法治疗。影响或被肝脏影响的许多疾病或病症可通过敲减(抑制)肝脏中基因表达来治疗。该肝脏疾病和病症可选自含有以下的列表:肝癌(包括肝细胞癌，HCC)、病毒感染(包括肝炎)、代谢紊乱(包括高脂血症和糖尿病)、纤维症和急性肝损伤。

待给予的RNAi多核苷酸偶联物的量(剂量)可凭经验确定。用0.1～10mg/kg动物体重的siRNA-偶联物和5～60mg/kg动物体重的递送聚合物能有效敲减基因表达。小鼠中的优选量为0.25～2.5mg/kg siRNA-偶联物。RNAi多核苷酸偶联物的量容易提高，因为其通常在大剂量下无毒。

本发明选择人磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因为目标，观察半乳糖化小干扰RNA共价耦合物对肝细胞株Huh7的靶向转递能力，以及针对目标基因的RNAi沉默效应。下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。

实施例1乳糖酸与末端氨基标记小干扰RNA耦合反应

配制S1：0.4M EDC于0.2M MES缓冲液，pH4.5，-20℃保存，使用前平衡至室温；配制S2：0.1M乳糖酸溶液于0.2M MES缓冲液pH4.5，-20℃保存，使用前平衡至室温；配制S3：2OD末端氨基标记小干扰RNA(6nmol，80μg)溶于DEPC处理的Rnase灭活水中，-80℃保存，使用前平衡至室温。100□μl S1、100□μl S2与200□μl S3混合，稍离心，各组分于400□μl反应总体积中的终浓度分别为0.1M EDC，25mM乳糖酸，12.5□μM末端氨基标记小干扰RNA(正义链：guaugacaacagccucaagt-NH2；反义链：cuugaggcuguugucauactt)，反应体系为0.1M MES缓冲液，pH4.5。反应液于25℃反应2h。用miRNAOUT柱脱盐，重回收总小干扰RNA。半乳糖化小干扰RNA共价耦合物连接产物经脱盐处理后，行长距离20％聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。图1显示，泳道1之RNA分子量较泳道2氨基标记小干扰RNA多出约1个碱基大小，表明半乳糖化小干扰RNA共价耦合物正确合成。

相较于文献报道，本发明所合成的半乳糖化小干扰RNA耦合物采用一步法完成，得率高(>90％)，见表1。小干扰RNA正义链3′端连接半乳糖配基导致该端解链温度降低，根据Schwarz法则，其干扰活性得到提高。

表1三种糖氨耦合反应比较

注：文献1：Shinsuke S,et al.Facile preparation of DNA-tagged carbohydrates.Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters2003,13:2633-6.

文献2：Dalpathado DS,et al.Reductive amination of carbohydrates usingNaBH(OAc)3.Anal Bioanal Chem2005,381:1130-7.

实施例2Huh7肝细胞摄取半乳糖化小干扰RNA共价耦合物试验

24孔板每孔培养基总体积为不含血清和抗生素的DMEM完全培养基450μl，加入半乳糖化小干扰RNA共价耦合物适当体积，使终浓度分别为0μM、1μM、2μM和4μM。5h后，除去复合物，更换含10％胎牛血清和双抗生素的DMEM完全培养基。孵育72h后，RIPA裂解Huh7细胞，收集总蛋白用于Western Blot检测目标蛋白表达量。设立MDA非肝源细胞、脂质体转染、以及空白细胞对照。图2示，2μM和4μM的半乳糖化小干扰RNA孵育Huh7细胞GAPDH表达量相对于空白细胞分别下降了17％和39％，而MDA细胞未呈现出对半乳糖化小干扰RNA的主动摄取。

本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。