一种甲癣病原菌的分子诊断引物及试剂盒

摘要

本发明的目的在于提供一种甲癣病原菌的分子诊断引物及试剂盒，能够灵敏对甲癣进行分子诊断。在建立了灵敏、特异、稳定的甲癣病原菌检测体系的基础上，本发明针对性地设计了竞争性内参，确保阴性结果的真实可信。本发明的引物和探针，其序列分别为SEQ ID NO:1-9。同时，本发明所提供的试剂盒包含改良过的真菌细胞裂解液，能快速而有效地完成DNA提取过程，使检测更为快捷方便。

说明书

技术领域

本发明属微生物检测技术领域，具体涉及一种基于real time PCR的甲 癣病原菌的分子诊断引物及试剂盒。

背景技术

甲癣(俗称灰指甲)，主要由皮肤癣菌(dermatophytes)引起，流行病 学调查显示通常在人群中约有5％的个体感染不同程度的甲癣。皮肤癣菌主 要包括三个属：小孢子菌属(Microsporum)、毛癣菌属(Trichophyton)和 表皮癣菌属(Epidermophyton)；临床上以毛癣菌属的红色毛癣菌 (Trichophyton rubrum)最为常见。

与其他浅表真菌感染相比，甲癣以其低治愈率和高复发率而著称，通 常需要较长时间的系统性用药才能彻底治愈。由于系统抗真菌治疗不仅涉 及治疗成本的上升，而且抗真菌药物通常会有一定的不良反应，因此精准 的甲癣诊断技术就显得非常重要。目前甲癣的真菌学检查主要依赖于镜检 和培养。虽然镜检结果较灵敏，但无法有效区分不同物种的真菌，对检测 人员的微生物学检测技能要求较高，因此不能满足临床的需要(特别是缺 乏有经验的检测人员时)；真菌培养的阳性率极低，有文献指出，大约有 15‐50％的镜检阳性标本，会表现出阴性结果。因此，开发快速、灵敏、准 确、稳定的甲癣分子诊断试剂盒就显得极有意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甲癣病原菌的分子诊断引物及试剂盒，能 够快速、特异、灵敏、稳定对甲癣进行分子诊断。在建立了可靠的甲癣病 原菌检测体系的基础上，本发明针对性地设计了竞争性内参，确保阴性结 果的真实可信。同时，本发明所提供的试剂盒包含改良过的真菌细胞裂解 液，能快速而有效地完成DNA提取过程。

本发明首先提供用于检测皮肤癣菌属的引物和探针，其序列信息如下：

上游引物Pan‐DF：ATAGTCCCTCTAAGAAGCCAG(SEQ ID NO:1)、

下游引物Pan‐DR：TAGTTGGTGGAGTGATTTGTC(SEQ ID NO:2)、

探针Pan‐DP：AATTGCGATAACGAACGAGACCTT(SEQ ID NO:3)。

探针Pan‐DP的5′用FAM修饰，3′用BHQ1修饰；

本发明还提供用于检测红色毛癣菌的引物和探针，其序列信息如下：

上游引物Tr‐F：TACCTCACCCGGTTGCCTC(SEQ ID NO:4)、

下游引物Tr‐R：CTGATTGTGCTTGCTAAACGC(SEQ ID NO:5)、

探针Tr‐P：CGGCTCGAGGCTCCCAGAAGG(SEQ ID NO:6)。

探针Tr‐P的5′用FAM修饰，3′用BHQ1修饰。

另外，本发明还提供作为竞争性内参的模板和探针，其信息如下：

Pan模板：Pan‐IAC(SEQ ID NO:7)：

ATAGTCCCTCTAAGAAGCCAGagctCTCAGACAGCCTCCAGCCCCGCagatGACAAATCA CTCCACCAACTA

Tr模板：Tr‐IAC(SEQ ID NO:8)：

TACCTCACCCGGTTGCCTCagctCTCAGACAGCCTCCAGCCCCGCagatGCGTTTAGCAA GCACAATCAG

内参探针IACP(SEQ ID NO:9)：

CTCAGACAGCCTCCAGCCCCGC，探针5′用TAMRA修饰，3′用BHQ1修饰。

本发明还提供一种包含上述引物、探针的试剂盒。

本发明的引物、探针，以及试剂盒用于非疾病诊断目的的甲癣病菌的 检测

本发明还提供一种从标本中提取核酸的方法，具体如下：

1)将待检测的样品加入到真菌细胞裂解液中，以珠磨法对真菌细胞进行 裂解。其中真菌细胞裂解液的配方如下：

500mM     Tris‐HCl    pH8.8

100mM     EDTA         pH8.0

100mM     KCl

2)将裂解液离心使样品收集到离心管底部，然后在95℃水浴处理；

3)水浴结束后离心，收集上清作为检测的模板。

本发明提供了一套基于分子方法的甲癣病原体快速诊断体系，能灵敏、 特异、快速、稳定、简便地检测甲癣。由于改进了煮沸法，能快速有效地 提取临床标本中的皮肤癣菌DNA；而由于采用了竞争性内参，能有效地分 辨假阴性结果；由于对引物、探针进行了充分的优化，因此能灵敏、特异 而稳定地达到检测效果。

附图说明

图1：皮肤癣菌的18S rDNA序列保守区比对图；

图2：Pan检测引物扩增的标准曲线图；

图3：Tr检测引物扩增的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的引物及探针进行详细的描述。

一、引物和探针的设计

1、Pan检测引物探针的设计

已报道的皮肤癣菌的通用型引物主要针对的几丁质合成酶1(chitin  synthase 1 gene，CHS1)，但由于CHS1为单拷贝基因，因此，本发明选择了 在皮肤癣菌内更加保守，且为多拷贝的18S rDNA。

从NCBI下载到皮肤癣菌三个属(含毛癣菌属、小孢子球菌属、表皮癣 菌属的11个种)的18S rDNA序列，通过seqman软件比对，从中找出序列 相对稳定的区域(如图1)，用于作为检测的目标序列。利用primer select 软件进行引物的选择后，选定不存在碱基变异的区域作为扩增引物。

初步选定引物后，通过采用浓度依赖的近似法(nearest‐neighbor)的 Tm估算公式，由melitng软件完成。具体公式如下：

$T_m=\frac{\mathrm{\Delta H}}{\mathrm{\Delta S}+R\ln (C/2)}+12.5\log \left[M\right]-273.15$

通过调整引物长度和5′端碱基，使得两者Tm相近。

所得引物信息如下

Pan‐F：ATAGTCCCTCTAAGAAGCCAG(SEQ ID NO:1)，Tm值为55.92度

Pan‐R：TAGTTGGTGGAGTGATTTGTC(SEQ ID NO:2)，Tm值为55.51度

同时，从碱基稳定区域设计探针(要求无明显的二级结构和引物二聚 体，且探针的Tm需略高于引物的Tm值)，最终确定的探针的序列如下：

Pan‐P：AATTGCGATAACGAACGAGACCTT(SEQ ID NO:3)，Tm值为60.36。 探针5′用FAM修饰，3′用BHQ1修饰。

通过NBCI的primer‐blast，比对设计的引物在人类基因组和其他常见的 真菌中的扩增能力，若能扩增，则看Pan‐DP能否有效地屏蔽无关物种，保 持引物特异性。比对结果表明所设计的引物探针具有很好的特异性。

2、Tr检测引物探针的设计

从NCBI下载到红色毛癣菌的ITS序列，确定种内序列相对稳定的区域， 用于作为检测的目标序列。利用primer select软件进行引物的选择后，选定 不存在碱基变异的区域作为扩增引物的设计区域。

设计流程同Pan检测，所得引物的信息如下为：

Tr‐F：TACCTCACCCGGTTGCCTC(SEQ ID NO:4)，Tm值为59.53

Tr‐R：CTGATTGTGCTTGCTAAACGC(SEQ ID NO:5)，Tm值为58.61

Tr‐P：CGGCTCGAGGCTCCCAGAAGG(SEQ ID NO:6)，Tm值为66.83。探针5′ 用FAM修饰，3′用BHQ1修饰。

3、内参设定：

使竞争性内参(即内参引物与目标基因的引物相同)，以确保阴性结果 的可靠性，内参模板信息如下：

Pan‐IAC：

ATAGTCCCTCTAAGAAGCCAGagctCTCAGACAGCCTCCAGCCCCGCagatGACAAA TCACTCCACCAACTA(SEQ ID NO:7)

Tr‐IAC：

TACCTCACCCGGTTGCCTCagctCTCAGACAGCCTCCAGCCCCGCagatGCGTTTAGC AAGCACAATCAG(SEQ ID NO:8)

内参探针为：

IACP：CTCAGACAGCCTCCAGCCCCGC(SEQ ID NO:9)，探针5′用TAMRA修 饰，3′用BHQ1修饰。

此处所设计的内参体系，为竞争性内参，内参体系和检测体系的引物完 全相同，但探针不同。由于内参体系和检测体系使用了相同的引物，所以 不存在引物的优势扩增(这就避免了由于内参引物的扩增能力与检测引物 存在较大差别，从而抑制其中扩增能力较弱的体系)。同时，检测结果表明 即使加入高浓度的内参，本发明所提供的内参模板的加入也不会影响检测 体系的检测效果。

二、包含上述引物和探针的试剂盒

试剂盒(20人份)包含：

1、DNA提取管(20个)

提取管为2ml离心管，每管含0.5g玻璃珠(直径710-1180μm，sigma， 货号G1152)，400ul真菌DNA提取液。真菌DNA提取液配方如下：

细胞裂解液的配方如下：

500mM Tris‐HCl pH8.8

100mM EDTA      pH8.0

100mM KCl

2、PCR mixture A(2×预混液，300ul)，配方如下：

3、PCR mixture B(260ul)，配方如下：

4、PCR mixture C(260ul)，配方如下：

5、positive control(40ul)，为1ng/ul的红色毛癣菌基因组DNA。

三、试剂盒的使用方法

1、DNA提取

(1)将待检测的样品加入DNA提取管，在TissueLyser II(Qiagen公司)上 30hz震荡10min，或涡旋震荡10min。

(2)短暂离心使样品收集到离心管底部，95度水浴10min。

(3)14000rpm离心5min，取上清留用。

2、定量PCR检测

(1)皮肤癣菌检测：

取15ul的PCR mixture A和13ul的PCR mixture B混合，加入2ul上一步所 得DNA模板，混匀，上机运行即。

(2)红色毛癣菌检测：

取15ul的PCR mixture A和13ul的PCR mixture C混合，加入2ul上一步所 得DNA模板，混匀，上机运行即。

(3)PCR程序为：

95度10min

{95度15sec

54度20sec

72度30sec(采集数据)}40循环

注：本试剂盒适用于ABI7500/7500Fast/Vii7，Stratagene Mx3000P， Mx3005P，Mx4000，MJ Research Chromo4，Opticon(II)，Corbett Rotor Gene 3000等仪器。

四、试剂盒效果检测

1、标准曲线制作：

(1)Pan检测

①构建质粒标准品

a、以Pan‐F和Pan‐R扩增出单一片段(以TAKARA的Premix Taq^TM完成，货 号：R004A)后，连入pUC18DNA质粒载体(TAKARA，货号：3218)，转入 E.coli DH5α(TAKARA，货号：9057)。通过PCR检测筛选出阳性克隆，在摇 菌培养后以碱裂解法提取纯化质粒。

b、以分光光度计测到质粒浓度，计算出质粒的拷贝数，计算公式如下：

c、稀释为每微升含如下拷贝数的不同溶液，拷贝数为：10⁵、10⁴、10³、10²、 10、1。

②构建质粒标准品

以质粒构建标准品，进行检测：扩增的标准曲线如图2所示；扩增的具体 数值如表1所示。

表1、Pan扩增的质粒标准品Ct数值表

另外，以基因组扩增的情况如表2所示：

表2、Pan扩增的基因组Ct数值表

利用标准曲线对上述结果进行分析，有表3所示：

从上述的数据可以看出，Pan检测下限为2p基因组DNA和10拷贝的 质粒数。由于所检测的目标基因为多拷贝基因(每个基因组约有200个拷 贝)。所以，当有一个基因组存在时，就可以被本发明的检测体系识别。

(2)Tr检测

以Tr-F和Tr-R扩增出单一片段，构建质粒标准品，过程同Pan检测

检测数据如下：扩增的标准曲线如图3所示；扩增的具体数值如表3 所示。

表3、Tr扩增的质粒标准品Ct数值表

另外，以基因组扩增的情况如表4所示：

表4、Tr扩增的基因组Ct数值表

从上述的数据可以看出，Tr检测下限为3p基因组DNA和10拷贝的质 粒数。由于所检测的目标基因为多拷贝基因(每个基因组约有200个拷贝)。 所以，当有一个基因组存在时，就可以有效被检测体系识别。

2、稳定性检测

以同一个标本进行检测96次，其中：

(1)Pan检测，Ct值的平均值为22.775，最大值为22.957，最小值为22.340， 方差为0.102。可知，在这96次检测中，Pan检测表现得非常稳定。

(2)Tr检测，Ct值的平均值为24.790，最大值为24.962，最小值为24.223， 方差为0.091。可知，在这96次检测中，Tr检测表现得非常稳定。

3、特异性检测

以高浓度基因组(2-10ng)，对检测体系进行特异性的确认，包括： Trichophyton rubrum(红色毛癣菌)、Trichophyton interdigitaliae(趾间毛癣 菌)、Trichophyton tonsurans(断发毛癣菌)、Trichophyton violaceum(紫色 毛癣菌)、Trichophyton verrucosum(疣状毛癣菌)、Microsporum canis(犬 小孢子菌)、Microsporum gypseum(石膏小孢子菌)、Microsporum nanum(猪 小孢子菌)、Microsporum ferrugineum(铁锈色小孢子菌)、Microsporum  persicolor(桃色小孢子菌)、Epidermophyton floccosum(絮状表皮癣菌)、 念珠菌属(白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平光滑 念珠菌)、曲霉属(烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉)、马尔 尼菲青霉、新型隐球菌。其中，所用的菌株都事先经过形态学和分子方法 的鉴定。

最终确认：Pan检测能有效检测到皮肤癣菌三个属的真菌，而Tr检测 能有效检测到红色毛癣菌，而其他无关物种都扩增不出产物，表现出了极 佳的特异性。

4、内参体系验证

加入高浓度的内参模板后，检测内参是否对就目标检测有影响。取三 份明确已知的阳性临床标本，加入高浓度内参(105拷贝/体系)，结果如下：

(1)Pan检测，如表5所示

表5、内参加入对Pan检测体系的影响

在上表上，内参的Ct值稳定在24左右，证明了内参这一体系中能得较 好扩增。在这一前提下，不同浓度的标本在是否加入内参，Ct未呈现出明 显的变化。可知，内参对检测影响基本可以忽略。

(2)Tr检测，如表6所示

表6、内参加入对Tr检测体系的影响

在上表上，内参的Ct值稳定在24左右，证明了内参这一体系中能得 较好扩增。在这一前提下，不同浓度的标本在是否加入内参，Ct未呈现出 明显的变化。可知，内参对检测影响基本可以忽略。

四、临床验证

取得36份已知阳性的甲癣标本(由镜检和培养确认)和40份已知阴性 的标本(来源于健康的志愿者)，进行分子检测。使用两套方案：其一为本 发明所研制的检测体系；其二为来自文献的检测体系(文献为： Brillowska-A,Saunte DM,Arendrup MC(2007)Five-hour  diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of  Trichophyton rubrum.Journal of clinical microbiology45,1200-1204，也即是 Statens Serum Institut的Dermatophyte PCR Kit的检测体系)，结果如表7所 示：

检测结果表明，40份阴性标本的检测结果，本发明的方法与文献报道 的一致。但在36份阳性标本，本发明检测结果均为阳性；而Dermatophyte  PCR Kit检测则存在4份阴性(如表7所示)。

表7、本发明与Dermatophyte PCR Kit检测体系结果对比

本发明的灵敏度为100％，而Dermatophyte PCR Kit的灵敏度为88.89％； 两者的特异度增均为100％。本发明的阳性预测值和阴性预测值均为100％， 而Dermatophyte PCR Kit的阳性预测值和阴性预测值分别为100％和 90.91％。综上可知，本发明在在特异性方面与Dermatophyte PCR Kit检测 相同，但灵敏度则要高于Dermatophyte PCR Kit。