生物转化合成普拉特霉素A1的纯化方法

摘要

本发明公开了一种生物转化合成普拉特霉素A1的方法，本发明技术方案如下：在ST-1作用下，以麦迪霉素为底物，通过生物转化的方法合成普拉特霉素A1，以及从转化后的发酵液中提取、分离、纯化，得到高纯度普拉特霉素A1。用此方法生产普拉特霉素A1的技术先进，工艺简单，适用于工业化生产。另外后提取技术摒弃了传统意义上的有机溶媒萃取法，减少环境污染，简化提纯步骤，降低生产成本，更适用于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明公开了一种以麦迪霉素为底物，利用耐热链霉菌突变株，生物转化合成普拉特霉素A1的方法。 

背景技术

大环内酯类抗生素能有效抗革兰氏阳性细菌、支原体、衣原体等，并且由于其可以口服施用以及毒性较低被划分为临床上重要的抗菌剂。麦迪霉素属于16-元环大环内酯类抗生素，是由生米卡链霉菌streptomyces mycarofaciens(ATCC21454)以及放线菌的类似种产生的。麦迪霉素通过作用于细菌核糖体的50S亚基，阻碍细菌蛋白质的合成而发挥作用。抗菌性能与红霉素相似，对革兰阳性菌和支原体显示很强的抗菌作用。 

普拉特霉素A1(platenomycin A1)最早是Ａkio Kinumaki等从普特拉链霉菌streptomyces platensis subsp.Malvinus MCRL0388中分离出来，当初被命名为YL704A1，经过了发酵液的浓缩、分离，制备出了相应的盐，并进行了结构确证和抑菌试验，发现该抗生素是一种新的、能够有效抑制革兰氏阳性菌的大环内酯类抗生素(Akio Kinumaki，Isao Takamori.J Antibiot(Tokyo)1974Feb；27(2):102-6.)，而且其毒性很低。普拉特霉素A1与麦迪霉素主体结构基本相同，不同之处在于麦迪霉素各组分的碳霉糖环4’’位上为丙酰基或丁酰基，而普拉特霉素A1的4’’位上为异戊酰基。后来我国姜威等人在研究螺旋霉素酰基化过程中，也发现了中间体普拉特霉素A1(又命名为生技霉素A0)，文中报道了这一化合物的分离，性质及结构(姜威孙承航金文藻中国抗生素杂志2002年第07期)，但至今为止对于普拉特霉素A1的生产方法没有后续研究。 

耐热链霉菌Streptomyces thermophilus是一种具有重要工业价值的链霉菌，它能够生物转化泰乐菌素生产乙酰异戊酰泰乐菌素(AIV)。已有的研究表明分别负责乙酰基化和异戊酰基化功能的基因为acyA基因和acyB1基因，以及acyB1的正调节基因acyB2。本实验室对原有的耐热链霉菌进 行了紫外诱变，筛选出了能够转化麦迪霉素为普拉特霉素A1的诱变菌株，并命名为ST-1。该菌株已经于2010年7月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.4040，拉丁名为Streptomyces thermotolerans。 

本发明建立一种以麦迪霉素为底物，利用耐热链霉菌的突变株ST-1，生物转化合成普拉特霉素A1的新生产方法；并且提供了一种新的从转化后的发酵液中提取、纯化普拉特霉素A1的方法，该方法摒弃了传统的溶媒萃取法，在减少环境污染，简化萃取步骤的同时，获得了较纯的普拉特霉素A1固体。 

发明内容

本研究的主要目的是提供一种生物转化合成普拉特霉素A1的方法，即以麦迪霉素为底物，利用ST-1，生物转化合成普拉特霉素A1。 

本研究的另一目的是提供最适的转化合成普拉特霉素A1的发酵条件，其具体条件如下： 

1培养基条件 

该菌的种子培养基组分为：大豆粉，玉米淀粉，酵母提取物，K₂HPO₄，MgSO₄·7H₂O。 

发酵转化过程中使用培养基组分为:玉米淀粉，大豆粉，酵母提取物，MgSO₄·7H₂O，K₂HPO₄，KH₂PO₄。发酵过程中，因为泡沫的产生，需要在培养基中加入消泡剂，如硅油、植物油或表面活性剂。 

2培养条件：温度、pH及培养时间 

种子培养过程中的温度和pH：ST-1是好氧菌，在pH6.0-8.0范围内，培养温度为25℃-35℃条件下，生长良好。种子培养时间为24-48小时，其中最优生长条件为pH7.0，温度为34℃，培养时间为30小时。 

发酵转化过程中的温度和pH：发酵培养基在pH6.0-8.0范围内，温度为25℃-35℃条件下能够进行生物转化，最优发酵条件为pH7.0，温度为30℃。 

3发酵过程分为摇瓶和发酵罐两种水平，培养基的碳源、氮源和无机盐组成成分和含量是具有较大差异的，发酵罐培养基的碳源需要在发酵过程中流加葡萄糖。种子培养液接种到发酵培养基中的接种量为2％-10％，摇瓶的最优接种量为6％，发酵罐的最优接种量为3％。 

摇瓶转化时，当种子在发酵培养基中生长约30-40小时后，一次性补入底物，底物麦迪霉素的配制，是利用磷酸调pH至酸性，使麦迪霉素完全溶解转变成盐溶液后，补入培养液中，继续转化48-60小时；发酵罐转化时，当种子在发酵罐中培养30-40小时后，通过蠕动泵流加补麦迪霉素底物盐溶液，补48hr，停止补料后，继续培养12-20小时，当普拉特霉素A1的转化量达到最高值下罐。 

4液相检测普拉特霉素A1：生物转化过程中，取10-30ml发酵液，加入同等体积的50％甲醇，超声波处理30min-1hr，再经过0.45um滤膜过滤发酵液，处理过的样品进行高效液相检测，检测麦迪霉素转化成普拉特霉素A1的转化率。 

本发明的另一目的是提供一种普拉特霉素A1的提取、纯化工艺，采用了酸提取、碱沉淀的技术方案。具体步骤如下： 

1一次酸溶：发酵液中的麦迪霉素被大部分转化成普拉特霉素A1，用无机酸或有机酸溶液调节发酵液成酸性，pH达2-6，优选pH3-4使发酵液中的普拉特霉素A1溶解出来，搅拌，离心或膜过滤，得到“普拉特霉素A1一次酸溶液”。 

2碱沉淀除杂质：上述“普拉特霉素A1一次酸溶液”加入碱性溶液调pH7.0-8.0，优选pH为7.0-7.5，发酵液离心或过滤，去除一部分沉淀杂质，保留发酵液滤液。 

3上述发酵液滤液继续加入碱性溶液调pH9.0-11.0，优选9.0-10.0，发酵液离心或过滤，得到“普拉特霉素A1一次碱沉淀”。 

4“普拉特霉素A1一次碱沉淀”中加入酸性溶液调pH2-6，优选pH3-4，溶解该沉淀，得到“普拉特霉素A1盐溶液”。 

5“普拉特霉素A1盐溶液”中加入碱性溶液调pH9.0-11，优选9.0-10.0，发酵液离心或过滤，得到“普拉特霉素A1二次碱沉淀”，对该沉淀物进行常规精制、干燥处理，得到较纯的“普拉特霉素A1碱固体物”成品。 

6“普拉特霉素A1碱固体物”继续用ODS或三硅酸镁层析柱进行层析分离，分段收集，结合高效液相色谱检测，收到纯度较高的“普拉特霉素A1甲醇溶液”，蒸干浓缩得到高纯度的普拉特霉素A1固体。 

本发明普拉特霉素A1的提纯方法，所述的碱性溶液包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水中的一种；所述的酸性溶液包括硫酸、盐酸、磷酸、酒石酸、柠檬酸中的一种。 

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明原理和实施方案，其中： 

图1ST-1摇瓶水平转化麦迪霉素发酵液的高效液相图 

图2普拉特霉素A1的结构图 

图3ST-1发酵罐水平转化麦迪霉素发酵液的高效液相图 

图4提取纯化后的高纯度普拉特霉素A1高效液相图 

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明中，除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的培养剂组分、含量、培养条件、分离提取条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。 

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。 

实施例1：以麦迪霉素为底物，摇瓶水平生物转化合成普拉特霉素A1。 

1种子培养方法 

从改良高氏一号培养基上挑取ST-1单菌落，接入种子摇瓶培养基中，种子摇瓶培养基装量为50ml/500ml摇瓶，34℃摇床，200RPM培养30hr。 

2发酵转化方法 

取3ml种子培养液接种于发酵摇瓶培养基中，发酵摇瓶培养基装量为50ml/500ml摇瓶，30℃发酵35hr后，向培养液中加入麦迪霉素底物，继续转化50hr后，下摇床。 

3液相检测麦迪霉素和普拉特霉素A1 

取发酵液10ml，加入50％甲醇10ml，超声波处理30min，0.45μm滤膜过滤发酵液，处理过的样品进行LC-MS，检测到分子量为842的峰。高效液相结果如图1所示，保留时间5.9min的峰为麦迪霉素，保留时间10.0min的峰为普拉特霉素A1，表明麦迪霉素被转化成普拉特霉素A1，普拉特霉素A1的结构图如图2。 

以下是该实例中应用到的一些培养基成分(包含一些单项的制备方法) 

ST-1种子摇瓶培养基 

大豆粉15g，玉米淀粉30g，酵母提取物2g，K₂HPO₄0.5g,MgSO₄·7H₂O0.5g，自来水1000ml，pH7.0。 

发酵摇瓶培养基 

玉米淀粉30g，大豆粉30g，酵母提取物2g，MgSO₄·7H₂O5g，K₂HPO₄100g，KH₂PO₄60g，消泡剂0.2ml，自来水1000ml，PH7.0。 

底物配制及补料方法 

将10g麦迪霉素放入100ml蒸馏水中，利用磷酸调整pH值至3.0，使麦迪霉素完全溶解，用0.22微米无菌过滤器过滤除菌，制得麦迪霉素补料液，取2ml麦迪霉素加入50ml发酵液中。 

检测效价用流动相的配制 

乙腈：甲酸铵＝55:45，甲酸铵溶液浓度为0.1M，检测波长为232nm。 

实施例2：以麦迪霉素为底物，发酵罐水平生物转化合成普拉特霉素A1。 

1种子培养方法：从改良高氏一号培养基上挑取ST-1单菌落，接入种子摇瓶培养基中，种子摇瓶培养基装量为50ml/500ml摇瓶，34℃摇床，200RPM培养30hr。 

250L发酵罐放大实验 

本发酵过程分为两个发酵阶段： 

(1)菌体培养阶段，将900ml种子液接种到发酵液中，50L发酵罐中的发酵液装量为30L，在培养温度为30℃，发酵罐转速为200rpm，通气量为20vvm的条件下培养35hr；在该阶段进行过程中，菌体大量生长，为下一步的生物转化提供足够的转化细胞。 

(2)生物转化阶段，35hr以后，通过蠕动泵流加补料液，补料液分别为10％麦迪霉素溶液和60％葡萄糖溶液，流加速度分别为40ml/hr和13ml/hr，补料时间为48小时，停止补料后，继续培养12hr(培养条件如菌体培养阶段)后，普拉特霉素A1的转化量达到最高值，下罐。生物转化过程中每8hr取10ml发酵液经过处理后，进行LC-MS检测，得到普拉特霉素A1，高效液相结果如图3，保留时间5.9min的峰为麦迪霉素，保留时间10.1min的峰为普拉特霉素A1，表明麦迪霉素被转化成普拉特霉素 A1。 

以下是该实例中应用到的一些培养基成分(包含一些单项的制备方法) 

发酵罐中的发酵培养基 

玉米淀粉30g，大豆粉30g，酵母提取物4g，MgSO₄··7H₂O5g，K₂HPO₄100g，KH₂PO₄60g，消泡剂0.2ml，自来水1000ml，pH7.0-7.2。 

底物配制 

将90g麦迪霉素放入900ml蒸馏水中，利用磷酸调整pH值至3.0，使麦迪霉素完全溶解，使用0.22微米无菌过滤器过滤除菌，制得麦迪霉素补料液 

将390g葡萄糖溶于蒸馏水，定容至650L，制得葡萄糖补料液。 

实施例3：普拉特霉素A1提取、纯化过程 

1得到ST-1转化麦迪霉素的发酵液30L，用40％磷酸调节发酵液pH达4.0，溶解发酵液中的普拉特霉素A1，搅拌1hr，用5％的硅藻土作为助滤剂，4000rpm，离心30min，得到含有“普拉特霉素A1一次酸溶液”。 

2上述“普拉特霉素A1一次酸溶液”中加入40％氢氧化钠溶液调pH到7.0，搅拌1hr，4000rpm，离心30min，弃沉淀，这一步骤去除掉大部分发酵液中的杂蛋白，保留上清。 

3上一步发酵液上清中继续加入40％氢氧化钠调pH9.0，搅拌1hr，4000rpm，离心30min，得到沉淀为“普拉特霉素A1一次碱沉淀”。 

4“普拉特霉素A1一次碱沉淀”中加入40％磷酸调pH4.0，搅拌30min，溶解该沉淀，4000rpm离心30min，保留上清。进一步去除了部分杂质，得到“普拉特霉素A1磷酸盐溶液”。 

5“普拉特霉素A1磷酸盐溶液”中加入40％氢氧化钠溶液调pH9.5，搅拌1hr，4000rpm离心30min，得到沉淀为“普拉特霉素A1二次碱沉淀”，该碱沉淀于40℃烘干，用纯甲醇溶解，离心，去除沉淀，该沉淀大部分为不溶于甲醇的盐类杂质，取上清液浓缩蒸干，得到“普拉特霉素A1固体粗品”20g，用高效液相的方法测得，该粗品的纯度大约为60％。 

6“普拉特霉素A1固体粗品”2g用ODS层析柱进行分离，采用直径5cm,高为60cm的ODS柱，样品用50％甲醇水溶解，甲醇水的梯度从50％-80％逐渐提高，分段收集，结合高效液相色谱检测，最后80％甲醇水洗脱出普 拉特霉素A1，“普拉特霉素A1甲醇溶液”蒸干浓缩，得到普拉特霉素A1固体1g，进行高效液相检测，如图4，保留时间9.5min的峰为普拉特霉素A1，其纯度大于90％。