基于AAV-ITR的基因表达微载体及其构建方法和应用

摘要

一种基于AAV-ITR的基因表达微载体及其构建方法和应用。该微载体包括用于表达外源基因的基因表达框，所述基因表达框两端分别连接有AAV基因组的ITR序列。其中，所述基因表达框优选采用线性表达框，包含在两段ITR序列之间依次分布的CMV增强子、Chickenβ-actin启动子、多克隆位点和SV40-Ploy(A)。尤为优选的，所述AAV基因组的ITR序列中不包含D序列。该微载体的构建方法包括：依次构建含有基因表达微载体序列的质粒pUC57-minivector、微载体扩增质粒pUC57-minivector-EGFP等，经酶切、热变性和冷却处理，获得目标产物。本发明的微载体可以在宿主细胞中高效、稳定持久的表达外源基因，且无副作用，安全性高，同时，其构建方法简单，成本低廉，易于规模化实施，有望在基因治疗或基因工程等领域广泛应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因表达微载体，特别涉及一种新型的、基于腺相关病毒（AAV）倒置末端重复序列（ITR）的基因表达微载体（AAV-ITR Mini Vector）以及该基因表达微载体的构建方法和应用。

背景技术

基因治疗(gene therapy)是指通过基因工程技术将外源正常基因导入靶细胞，替代异常基因、封闭或祛除致病基因、修复受损基因或重建调控系统等，以纠正或补偿由于基因缺陷和异常所引起的疾病，从而到达治疗疾病的目的。基因治疗已被广泛用于治疗遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等，到2013年2月底为止，世界上已有1902种基因治疗药物进入临床试验中。基因治疗的关键技术是选用合适的载体将外源基因有效导入受体靶细胞，并有效地进行外源基因表达。而基因治疗的难点是载体的转染、表达效率低以及存在安全隐患，因此研发能够稳定转染并且安全有效的基因治疗载体是现今基因治疗研究领域的重点。传统的基因治疗表达载体有病毒表达载体及质粒表达载体。尽管病毒载体具有转染效率高、靶向性强的优点，但其潜在的致癌性、致毒风险、自身免疫原性和造成细胞病理改变等缺点在一定程度上限制了其在基因治疗中的广泛应用。质粒载体中含有细菌复制序列、抗性基因、未甲基化的CpG序列和一些可能隐藏的表达信号，这些序列在质粒复制时是必需的，但在基因治疗过程中可能引发严重的安全性问题。所以研究开发具有稳定性、安全性和靶向性的非病毒载体日益受到重视。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种基于AAV-ITR的基因表达微载体，其在应用时能够实现外源基因在宿主细胞内的高效、稳定、安全的表达，从而克服了现有技术中的不足。

本发明的目的之二在于提供一种构建前述基于AAV-ITR的基因表达微载体的方法。

本发明的目的之三在于提供前述基于AAV-ITR的基因表达微载体在表达外源基因中的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

一种基于AAV-ITR的基因表达微载体，包括用于表达外源基因的基因表达框，所述基因表达框两端分别连接有AAV基因组的ITR序列。

进一步的，所述基因表达框包括线性表达框。

作为较为优选的实施方案之一，所述基因表达框包含在两段AAV基因组的ITR序列之间依次分布的CMV 增强子、Chicken β-actin 启动子、多克隆位点和SV40-Ploy(A)。

作为较为优选的实施方案之一，所述AAV基因组的ITR序列中不包含D序列。

一种基因表达载体质粒，其特征在于，包括如上任一项所述的基因表达微载体。

如上任一项所述基因表达微载体和所述基因表达载体质粒在宿主细胞内稳定表达外源基因的用途。

一种基于AAV-ITR的基因表达微载体的构建方法，包括：

（1）提供AAV-ITR表达框，并克隆在pUC57质粒的多克隆位点，获得含有所述基因表达微载体序列的质粒pUC57-minivector，其中，所述基因表达微载体包括两组AAV基因组的ITR序列，该两组ITR序列之间分布有用于表达外源基因的基因表达框；

（2）将EGFP序列克隆至载体质粒pUC57-minivector，获得微载体扩增质粒pUC57-minivector-EGFP；

（3）NotI 酶切微载体扩增质粒pUC57-minivector-EGFP，并回收目的片段ds-minivector-EGFP，而后依次进行热变性和冷却处理，获得所述基因表达微载体。

作为较为优选的实施方案之一，该方法还可包括：

（2X）以pUC57-minivector-EGFP为模板，PCR扩增该两组ITR序列中的两组D序列之间的DNA片段，获得微载体扩增质粒pUC57-minivector-ΔD –EGFP；以及，

（3X）参照步骤（3）的操作处理微载体扩增质粒pUC57-minivector-ΔD –EGFP，获得不含D序列的所述基因表达微载体。

具体的，该方法包括：

（1）提供AAV-ITR表达框，并克隆在pUC57质粒的多克隆位点，获得含有所述基因表达微载体序列的质粒pUC57-minivector；

（2）以含有EGFP的质粒pds-AAV-CB-EGFP为模板，通过PCR扩增得到EGFP序列，再将EGFP序列克隆至载体质粒pUC57-minivector，获得微载体扩增质粒pUC57-minivector-EGFP；

（3）NotI 酶切微载体扩增质粒pUC57-minivector-EGFP，并以凝胶回收试剂盒回收目的片段ds-minivector-EGFP，回收的双链DNA进行沸水浴处理至完全变性，然后将热变性的DNA迅速置于冰上冷却，获得所述基因表达微载体。

所述基因表达框包含在两段AAV基因组的ITR序列之间依次分布的CMV 增强子、Chicken β-actin 启动子、多克隆位点和SV40-Ploy(A)。

与现有技术相比，本发明至少具有如下优点：该基于AAV-ITR的基因表达微载体可以在宿主细胞中高效、稳定持久的表达外源基因，而且，该基因表达载体只包含外源基因表达必需元件，而不含有质粒的细菌复制子序列、抗性基因序列等非宿主细胞DNA序列，特别是细菌的CpG序列，从而可以降低免疫反应、细胞炎症反应以及细胞毒性等不良副作用，安全性更高，同时，该基因表达载体的构建方法简单，成本低廉，易于规模化实施。本发明有望在基因治疗或基因工程等领域广泛应用。

附图说明

图1 是AAV-ITR的二级结构图；

图2是AAV的ITR 中D序列的结构示意图；

图3是本发明的一种基因表达微载体的结构示意图；

图4是 质粒pUC57-minivector的结构示意图；

图5是 质粒pUC57-minivector-EGFP r的结构示意图；

图6是pUC57-minivector-ΔD –EGFP的构建流程图；

图7是本发明的一种基因表达微载体的制备工艺流程图；

图8是本发明一较佳实施例中S1核酸酶处理AAV-ITR微载体的电泳图，其中，1-3分别为未经S1核酸酶处理的质粒、ds- DNA 和AAV-ITR微载体；4-6分别为经S1核酸酶处理的质粒、ds- DNA 和AAV-ITR微载体。从图中可以看出质粒和双链DNA不能被S1核酸酶降解，而AAV-ITR微载体能被S1核酸酶完全降解；

图9是本发明一较佳实施例中相同浓度的ds-DNA热变性后复性的电泳图，其中，1、3、5道是1600bp、2700bp、1900bp的双链DNA；2、4、6道是1600bp、2700bp、1900bp的单链DNA。电泳结果显示含有ITR序列的双链DNA能完全变性，且没有复性；而不含ITR序列的双链DNA有一部分DNA发生了复性。

图10是本发明一较佳实施例中不同浓度的ds-DNA热变性后复性的电泳图，其中1-6道为不包含ITR双链，1，未经处理，2-6道分别为浓度100ng/15uL、150ng/15uL、200ng/15uL、250ng/15uL、300ng/15uL的双链热变性处理；7-12道为包含ITR的双链，7，未处理，8-12道分别为浓度150ng/15uL、200ng/15uL、250ng/15uL、300ng/15uL、350ng/15uL的双链热变性处理。从图中可以看出不含ITR序列的双链DNA在浓度为100ng/15uL时已经发生复性，在300ng/15ul时，复性程度很高，而含有ITR序列的双链DNA在浓度达到300ng/15ul时，仍能完全变性，在浓度为350ng/15ul时，有少部分复性；

图11是以流式细胞仪所测等摩尔的质粒、双链DNA、AAV-ITR微载体、AAV-ITR-ΔD微载体在293T细胞的表达效率图谱。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本发明旨在提供一种基因表达微载体（AAV-ITR Mini Vector，或称AAV-ITR微载体），更具体的讲，本发明提供了一种新型的、基于腺相关病毒（AAV）倒置末端重复序列（ITR）的基因表达微载体（AAV-ITR Mini Vector），同时还提供了该表达微载体的构建方法和应用。

该基因表达微载体的分子结构类似于AAV基因组，即：含有一个单链基因表达框，单链DNA两端为AAV基因组的ITR序列。

其中，ITR序列在细胞中能行成一个自我互补的T型发夹结构，使得微载体在细胞中能形成稳定的环状多聚体和类染色质结构，从而能在细胞中长期稳定存在，外源基因也就能持续稳定表达。

而线性基因表达框则仅含有启动子、增强子、目的基因和poly（A）加尾序列，较小的分子量有利于其转染细胞和基因表达，此外几乎不含细菌或病毒的DNA序列，还能使得免疫反应、细胞炎症、细胞毒性、基因表达沉默化降到最低。

作为其中的一个较为优选的实施方案，该基因表达微载体的基因表达框（AAV-ITR Expression cassette）可以采用如下设计：两端为AAV的ITR序列，左右ITR序列之间为一个可表达外源基因的线性表达框，依次为CMV 增强子、Chicken β-actin 启动子、多克隆位点(MCS)及SV40-Ploy(A)，共1239bp。

对于前述的ITR ，其结构可参阅图1。具体而言，ITR 系为AAV（Adeno-associated virus，腺相关病毒）基因组两端的倒置末端重复序列（inverted terminal repeats），其分别由145个碱基构成，其中前125nts（1～125nt）序列依次可分为A、B、B’、C、 C’、 A’等不同的区段，形成3段回文结构，B与B’、C与C’反向互补可形成T形发夹结构的顶端，A与A’构成T的长臂，另外，ITR上还有一个末端解链位点（Terminal resolution site , Trs）和一个D序列，该D序列特指ITR序列的后20个碱基，左、右两端的分别称为D(-)序列（CTCCATCACTAGGGGTTCC）和D(+)序列（AGGAACCCCT AGTGATGGAG）（参阅图2）。D序列是ITR序列中唯一的非回文序列，包含了末端解链位点（trs）和包装信号。

在本发明中，对于前述基因表达微载体，当去除ITR序列的D序列后，还可使基因表达效率高于质粒。

以下结合一较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

一、AAV-ITR 微载体序列的设计

根据AAV的基因结构特征设计AAV-ITR Expression cassette：两端为AAV的ITR序列，左右ITR序列之间为一个可表达外源基因的线性表达框，表达元件依次为CMV enhancer、Chicken β-actin promoter、Multiple cloning site、SV40-Ploy(A)，共1239bp（参阅图3）。

二、AAV-ITR微载体扩增质粒的构建

AAV-ITR Expression cassette序列由苏州金维智公司合成，将其置于pUC57质粒的多克隆位点，两端为NotI酶切位点，便于微载体的扩增和制备，该重组质粒即为pUC57-minivector（参阅图4）， AAV-ITR Expression cassette可通过NotI 酶切鉴定。

利用primer premier 5.0软件设计引物，上游引物UP1：5’- CCCATCGATGCCGCCATG GTGAGCAAGGGC；下游引物LP2：5’-CCCATCGATTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’，两条引物设计含有ClaI酶切位点。PCR反应体系为50μL，包含50ng 模板质粒pds-AAV-CB-EGFP、上、下游引物各0.3μM、dNTP 0.2mM、MgSO4 1.5mM、1×PCR缓冲液和1U KOD-Plus-Neo（东洋纺生物科技有限公司，上海）。PCR扩增过程采用三步法：95°C预变性5 min，95°C变性50sec，57°C退火50 sec，72°C延伸90 sec，共30个循环，72°C终延伸7 min。载体pUC57-minivector质粒用ClaI酶切，同时去磷酸化处理防止载体片段的自连，反应体系为20μL，包含16μL pUC57-minivector质粒、2μL 10×Buffer、1μL Cla I和1μL Fast AP，反应条件为37℃水浴作用30min；PCR产物EGFP序列用ClaI酶切，反应体系为50μL，包含23μL PCR目的片段、5μL 10×Buffer、1μL Cla I，37℃水浴作用30min。然后用Cycle pure kit试剂盒（Omega公司）快速回收酶切产物。（文中提到的所有限制性内切酶均为Fermentas公司产品）。载体酶切片段和目的基因酶切片段在T4连接酶（NEB公司）的作用下，22℃下连接反应30min。反应体系为20μL，包含2μL pUC57-minivector质粒酶切产物、5.5μL 目的片段酶切产物、2μL 10×Buffer、1μL T4连接酶。连接产物转化感受态细胞（sure cell），37℃过夜培养，12 h后氨苄抗性平板上有单菌落出现，挑取实验组平板上单菌落，在含氨苄的LB中培养16h，提取重组质粒质粒pUC57-minivector-EGFP，通过酶切和转染体外细胞来鉴定该重组质粒。

设计引物上游UP3：5’-GCG TCTAGAGGTACCCTAGTTATTATTAGTAATC；下游引物LP4：5’-GCG TCT AGA TAA AAAACCTCCCACACCTCCC，均带有XbaI酶切位点。以pUC57-minivector-EGFP质粒为模板扩增左、右D序列之间的DNA片段，以此替代包含D序列的微载体序列，得到另外一个微载体扩增质粒pUC57-minivector-ΔD –EGFP，具体操作方法同上。

三、AAV-ITR微载体的制备

用NotI 酶切扩增质粒pUC57-minivector-EGFP，凝胶回收试剂盒回收目的片段ds-minivector-EGFP（约2000bp）。回收的双链DNA沸水浴5min，使其完全变性，而后迅速置于冰上冷却2min，即得到 AAV-ITR微载体（参阅图7）。

四、微载体的结构鉴定

（1）单链的鉴定

S1核酸酶是一种高度单链特异的核酸内切酶，在最适的反应条件下，能够降解单链DNA或RNA。用S1核酸酶分别处理AAV-ITR微载体、质粒和双链DNA，反应体系为30μL，包含4.4μL DNA样本、5.5μL 目的片段酶切产物、6μL 5×Buffer、0.1μL S1核酸酶。反应条件为：25℃，30min。电泳结果显示质粒和双链DNA不能被S1核酸酶降解，而AAV-ITR微载体能被S1核酸酶完全降解，证明确实形成单链（参阅图8）。

（2）ITR结构的鉴定

分别用XbaI、NotI酶切处理质粒pUC57-minivector-EGFP，分别胶回收得到长度为1600bp和2700bp的不含ITR序列的双链片段、同时与ds-minivector-EGFP片段（含有ITR序列，1900bp）进行热变性处理（沸水浴5min后迅速冰浴2min），然后进行Goldview染色电泳，实验结果显示含有ITR序列的双链DNA能完全变性，且没有复性；而不含ITR序列的双链DNA在电泳过程中有一部分DNA发生了复性（参阅图9）。

此外，将不同浓度的不含ITR序列的双链片段（1600bp）与不同浓度的ds-minivector-EGFP片段进行热变性处理，处理方法同上，电泳检测，比较二者的差异。电泳结果显示，含有ITR序列的双链DNA在浓度达到300ng/15ul时，仍能完全变性，在浓度为350ng/15ul时，有少部分复性；而不含ITR序列的双链DNA在浓度为300ng/15ul时，复性程度很高，在浓度为100ng/15ul时，仍有DNA复性（参阅图10）。通过上述结果证明得到的微载体包含ITR结构。

五、AAV-ITR微载体在体外细胞中的表达

取对数生长期人胚胎肾细胞系293T细胞接种于24孔板，每孔500ul，密度为2×10⁵/mL，培养在含10%小牛血清，青霉素，链霉素各100U/L的DMEM培养基中，置于37℃，5% CO₂的饱和湿度培养箱中培养。待细胞密度约为60%（一般为18-24h），即可进行DNA的转染。将热变性处理得到的微载体AAV-ITR-ΔD- EGFP 、原始微载体AAV-ITR- EGFP、扩增质粒和未变性双链DNA分别进行细胞转染，1μg加HBS至50 μL，混匀后静置10min；PEI（50mM，0.9μL）加HBS至50μL，混匀后静置10min；二者混合（100μL）、混匀后静置10min，将该PEI-DNA混合液加入至用PBS 溶液清洗过的293T细胞表面，再加入适量培养基，置于37℃，5% CO₂的饱和湿度培养箱中培养，分别于转染后24h、48h、60h、72h，利用荧光显微镜观察GFP的表达情况。第72h时，用0.25%胰酶进行消化，1000r/min，5min离心收集细胞，再用1mL PBS溶液重悬细胞，通过流式细胞仪检测GFP的表达情况。结果发现，原始微载体AAV-ITR- EGFP的荧光表达效率低于扩增质粒和未变性双链DNA；而去掉D序列后的微载体AAV-ITR-ΔD- EGFP的荧光表达效率显著提高，甚至超过扩增质粒和未变性双链DNA（参阅图11）。

需要指出的是，以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。