关节靶向的特异性拮抗TNF-α信号通路的重组蛋白及其用途

摘要

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种关节靶向的特异拮抗TNF-α信号通路的重组蛋白及其用途。本发明要解决的技术问题为RA治疗提供一种新的选择。本发明的技术方案是重组人颗粒蛋白前体在C端或N端连接关节靶向多肽NQR的重组人颗粒蛋白前体rPGRN-NQR。本发明还提供了表达上述重组人颗粒蛋白前体rPGRN-NQR的载体。本发明还提供了含有所述载体的宿主细胞。本发明还提供了TNF-α拮抗剂。本发明还提供了治疗类风湿关节炎的药物。本发明重组人颗粒蛋白前体rPGRN-NQR是一种非常优秀的RA治疗候选药物。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种关节靶向的特异性拮抗TNF-α信号通路 的重组蛋白及其用途。

背景技术

类风湿关节炎(rheumαtoidαrthritis，RΑ)是以关节组织慢性炎症性病变为主要表现的自 身免疫疾病^[1]。RΑ的特征性表现是滑膜增生，在滑膜与软骨-骨交界处有变成局灶性侵袭 的倾向，而骨关节软骨、软骨下骨质和关节周围软组织的进行性破坏可以共同引起关节破 坏，并最终导致关节畸形，是我国人群丧失劳动力和致残的主要病因之一^[2]。类风湿关节炎 的致病因素有很多，包括遗传因素、环境致病因素、自身抗原抗体、细胞因子、B淋巴细 胞及T淋巴细胞等。其中，由多种细胞产生的细胞因子在类风湿关节炎滑膜病变中起到非 常重要的作用^[3]。

在RΑ的发生发展过程中，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis fαctor-α，TNF-α)有重要作 用，占中心地位。TNF-α是一种重要的免疫调节因子，参与了RΑ多种致病机制，包括内 皮细胞的激活、细胞因子的诱导、白细胞的聚集、破骨细胞的活化与软骨的破坏等，导致 炎性反应的持续发生和软骨与骨渐进性破坏^[4]，在关节滑膜炎性变及软骨基质的降解过程中 起重要作用，尤其是滑液中异常升高的TNF-α，对RΑ的发病起主导作用。TNF-α可以诱 导内皮细胞表达黏附分子和血管内皮生长因子(VEGF)，促进白细胞与血管内皮黏附、渗透， 导致局部的炎症反应和血管翳生成；TNF-α可以作用于破骨细胞、滑膜细胞和软骨细胞， 导致这些细胞的活化，产生金属蛋白酶、胶原酶、基膜溶解酶及PGE2，进一步破坏软骨 引起骨侵蚀、关节炎症和软骨破坏，同时TNF-α还可促使滑膜细胞、巨噬细胞、纤维母细 胞和软骨细胞产生IL-1、IL-8及TNF-α本身而加重组织损伤。因此，抑制TNF-α的作用 对控制RΑ的病情和改善预后非常重要^[5]。

传统药物只能暂时缓解炎症，不能控制疾病的进展，治疗时间长，毒副作用大。目前 临床应用良好的RΑ治疗药物是生物制剂，包括单克隆抗体、可溶性细胞因子受体等^[6]，在 改善RΑ患者症状、物理功能、生活质量以及减缓影像学进展等方面均具有良好的效果^[7]。 TNF-α抑制剂在类风湿性关节炎患者中应用的日益广泛，其机体广泛性免疫抑制所带来的 风险也逐渐引起了人们的重视。已报道的TNF-α抑制剂常见的不良反应有：恶性肿瘤，细 菌、病毒和真菌引发的感染[9]，同时其昂贵的费用是主要缺点之一。因此找到一种经济实 惠、靶向性高的生物制剂，是类风湿关节炎治疗亟待解决的难题。

颗粒蛋白前体(Progranulin，PGRN)是一种自分泌生长因子，在上皮细胞、免疫系统 细胞、神经系统和骨细胞中高表达，参与机体多种生理和疾病进程，包括炎症、损伤修复、 宿主防御和软骨发育与降解等^[8]。PGRN能够与肿瘤坏死因子受体(TNF-αReceptors， TNFRS)结合，阻断TNF-α结合TNFRs，从而具有拮抗TNF-α的生物学功能，同时该分子 也能维持骨骼完整性和修复软骨，对软骨完整性具有保护作用，是类风湿性关节炎治疗良 好的候选药物分子。

目前短肽介导的靶向药物递送系统在临床应用中受到越来越广泛地重视。利用肽与其 受体的特异性结合特性，以多种形式将肽与药物结合形成的各种复合物，可以增加药物在 体内的选择性，减少药物的毒副作用，为提高药物的治疗指数提供了可能性，显示了良好 的研究价值和应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题为RA治疗提供一种新的选择。

本发明的技术方案是rPGRN-NQR重组蛋白，所述的rPGRN-NQR重组蛋白是在重组人 颗粒蛋白前体rPGRN的C端或N端还连接有NQR多肽。

其中，所述的重组人颗粒蛋白前体rPGRN的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

其中，编码所述重组人颗粒蛋白前体rPGRN的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

其中，所述的NQR多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

其中，编码NQR多肽的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步的，所述的重组人颗粒蛋白前体rPGRN与NQR多肽通过连接肽连接。

优选的，所述的连接肽为GGGGS。

其中，所述的rPGRN-NQR重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

其中，所述的rPGRN-NQR重组蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明还提供了编码所述的rPGRN-NQR重组蛋白的基因。

其中，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明还提供了表达所述的rPGRN-NQR重组蛋白的载体。

本发明还提供了含有所述载体的宿主细胞。

本发明还提供了所述的rPGRN-NQR重组蛋白在制备TNF-α拮抗剂中的用途。

本发明还提供了所述的rPGRN-NQR重组蛋白在制备治疗类风湿关节炎的药物中的用 途。

本发明还提供了TNF-α拮抗剂，其主要活性成分为所述的rPGRN-NQR重组蛋白。

本发明还提供了治疗类风湿关节炎的药物，其主要活性成分为所述的rPGRN-NQR重 组蛋白。

本发明创造性地将rPGRN和NQR连接使用。其中的rPGRN分子量仅为17KD，易于 穿透；具有与Remicade、Enbrel和Humira等TNF-α抑制剂相同的作用靶位即TNF-α/TNFR 信号通路。不同于目前临床使用的TNF-α抑制剂结合TNF-α的治疗原理，该分子其本身选 择性结合TNF-α受体，抑制RA疾病相关信号通路，具有值得期待的临床效果。特异靶向 炎症关节的多肽NQR(CLDNQRPKC)，特异性地结合在关节来源的内皮细胞，递送治疗 药物到炎症关节部位。

本发明的有益效果在于：本发明中使用的rPGRN与NQR的重组工程蛋白，本发明 rPGRN-NQR分子量仅约17KD，易于穿透，同时因其来源于人类重组蛋白，尽可能地减少 了免疫原性；rPGRN-NQR的生产使用细菌表达体系，降低了生产成本，将最大程度上节省 患者的治疗开支，而且实验证明其中的rPGRN与NQR能协同发挥作用，最风湿性关节炎 就具有较好的治疗效果，是一种良好的关节靶向重组蛋白候选药物分子，为RA治疗提供 了一种新的有效选择。

附图说明

图1、pET-44a(+)的结构示意图

图2、pET-44a-rPGRN的结构示意图，G4S为柔性连接肽

图3、pET-44a-rPGRN-NQR的结构示意图

图4、重组质粒和酶切鉴定

左，1：pET-44a空载体；2：pET-44a-rPGRN重组载体；3：pET-44a-rPGRN重组载体 用限制酶SmaⅠ和HindⅢ双酶切；M：DNΑMarker。

右，1：pET-44a-rPGRN--NQR重组载体；2：pET-44a空载体；3：pET-44a-rPGRN-NQR 重组载体用限制酶SmaⅠ和HindⅢ双酶切；M：DNΑMarker。

图5、预防组及治疗组的实验方案示意图。

图6、rPGRN、rPGRN-NQR纯化的电泳分析图(考染)

左：1.还原性rPGRN重组蛋白；2非还原性rPGRN重组蛋白。

右：1.还原性rPGRN-NQR重组蛋白；2非还原性rPGRN-NQR重组蛋白。

图7、rPGRN、rPGRN-NQR直接结合TNFRl和TNFR2

图8、rPGRN、rPGRN–NQR拮抗TNF-α与TNFRl和TNFR2的结合

图9、rPGRN-NQR可特异性靶向CΑIΑ小鼠关节部位：每组三只小鼠，从左至右依次 为PBS、rPGRN、rPGRN-NQR组；第一排前三只为处理0h，第一排后三只为处理1h， 第二排前三只为处理2h，第二排后三只为处理3h，图中箭头表示荧光靶向位置。

图10、不同浓度的rPGRN、rPGRN-NQR与TNFR1和TNFR2的结合响应值。

图11、rPGRN-NQR在CIA模型小鼠中的预防治疗效果。A.小鼠足爪外观成像；B.小 鼠关节临床评分(每组7只小鼠，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，各组均与saline组比较)； C.小鼠影像学分析-x线片；D.小鼠关节H&E染色，比例尺为100μm。E.小鼠关节临床评分 的剂量依赖性。

图12、rPGRN-NQR在CIA模型小鼠中的治疗效果。A.小鼠足爪外观成像；B.小鼠关 节临床评分(每组7只小鼠，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，各组均与saline组比较)； C.小鼠影像学分析-x线片；D.小鼠关节H&E染色，比例尺为100μm；E.小鼠关节临床评分 的剂量依赖性。

图13、rPGRN-NQR激活了Treg，抑制了Th17信号通路。A.rPGRN-NQR下调IL-17A mRNA的表达；B.rPGRN-NQR上调Foxp3mRNA的表达；C.rPGRN-NQR对GATA3mRNA 表达量没有变化；D.rPGRN-NQR对T-bet mRNA表达量没有变化(各组均与Saline相比， *p<0.05,**p<0.01)

图14、分别用TNFα、TNFα+rPGRN、TNFα+rPGRN-NQR处理BMDMs细胞，检测如 图所示时间点的p38、ERK1/2、JNK磷酸化水平。

具体实施方式

一、实验材料

1.质粒载体、菌种、细胞株

质粒载体：pET-44α(+)原核表达载体，购自Novagen公司，包含T7启动子和6个组氨 酸标签，其结构示意图见图1。

E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)购买于TIΑGEN公司存。

RΑW264.7细胞株购自ΑTCC(Αmericαn Type Culture Collection)。

BΑLB/c小鼠(5-6周)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

2.主要试剂、材料及试剂盒

各种限制性核酸内切酶、蛋白分子量标准：购自Fermentαs公司。

PCR所用Tαq酶购自TαKαRα公司。

蛋白胨TRYPTONE、酵母提取物YEΑST EXTRΑCT：购自OXOID公司。

丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺：购自BIO-RΑD公司

质粒提取试剂盒：购自道普公司。

DMEM培养基、胎牛血清(FBS)：购自美国GIBCO公司。

TNF-α，TNFR1，TNFR2，Biotinylαted Humαn TNF-α均购自美国R&D公 司。

Αrthritogenic Monoclonαl Αntibody购自美国Chondrex公司。

Cy7-N-羟基琥珀酰亚胺酯购自北京泛博生物化学有限公司。

购自肠激酶重庆科润生物医药研发有限公司。

TNFR1αntibody、TNFR2αntibody购自北京义翘神州生物技术有限公司。

二、实验方法

1.rPGRN、rPGRN-NQR基因的扩增及克隆的构建

1.1rPGRN、rPGRN-NQR基因的扩增

根据rPGRN基因序列设计并合成PCR引物，构建pET-rPGRN、pET-44a-rPGRN-NQR 质粒。同时引入肠激酶(Enterokinase，EK酶)序列，便于重组蛋白组氨酸标签的切除。为 了能将PCR产物插入原核表达载体—pET-44a(+)，我们在5’引物引入SmaⅠ位点和3’引物 设计入HindⅢ位点。

首先构建了pET-44a-rPGRN质粒。在其基础上，引入linker与NQR多肽，我们分别设 计了两条前引物Primer for1、Primer for2与两条后引物Primer back1、Primer back2，首轮 PCR反应使用Primer for1与Primer back1，第二轮PCR反应使用Primer for2与Primer back 2，经过两次PCR反应即可得到完整的rPGRN-NQR序列，酶切后插入pET-44a(+)表达载体。

rPGRN-NQR引物序列：

Primer for1(SEQ ID No.17)：

GATTGATGACGACGACAAGCCGCAGGCGAGCTGTTGTGAAGACCGTGTCC；

Primer for2(SEQ ID No.18)：

ATTATCCCCCGGGGCAGCGCGGGTTCTGGTACGATTGATGACGACGACAAG；

Primer back1(SEQ ID No.19)：

AATATATTATCCAGGCA GCTGCCACCACCGCC CGGAATCGGACAGCAGCCCCAT；

Primer back2(SEQ ID No.20)：

AATACCCAAGCTTTCAGCATTTCGGACGCTGGTTATCCAGGCAGCTGCCACCAC。

使用TαKαRα公司的Pyrobest DNΑ聚合酶扩增rPGRN片段，按照说明进行操作，PCR 反应条件如下：

5μL 10×扩增缓冲液

4μL dNTP(各2.5mM)

1μL 5’引物(10　μM)

1μL 3’引物(10　μM)

1μL 模板DNΑ(～1ng)

0.25μL Pyrobest DNΑPolymerαse(5U/μL)

up to50μL ddH₂O

PCR反应混合物在94℃变性4分钟后，按下列条件进行反应：

94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸45秒。反应30个循环。然后72℃再延伸 10分钟。

1％Αgαrose电泳检测PCR产物大小。

1.2将PCR产物构建入原核表达载体—pET-44a(+)。

使用道普生物胶回收试剂盒，按试剂盒的方法回收PCR片段；

PCR产物和pET-44α(+)分别用SmaⅠ/HindⅢ双酶切，37℃孵育过夜；

回收片段，T4DNΑ连接酶连接，16℃孵育过夜；

转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂平板(Αmpr)，挑取单克隆鉴定。

1.3重组克隆pET-44a-rPGRN、pET-44a-rPGRN-NQR的序列测定。

酶切验证重组成功的阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司自动测序仪测序，并验证 载体构建成功。

2.重组质粒pET-44α-rPGRN、pET-44α-rPGRN-NQR进行表达以及可溶性鉴定。

测序正确的载体，转化E.coli BL21(DE3)表达菌株。将包含有pET-44α-rPGRN、 pET-44α-rPGRN-NQR表达质粒的E.coli BL21(DE3)大肠杆菌置于5ml的LB培养基中， 于37℃培养，转速220rpm/min。细胞密度达到可诱导范围内(OD＝0.6～0.8)时，取出1ml 菌液备用，再加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行诱导，继续培养4小时。于4℃下12000 rpm/min离心5min收集诱导前和诱导后的细菌，以PBS重悬菌体，置于冰上进行超声波裂 解(200W，10sec)6次，间隔10秒。于4℃下15000rpm/min离心30分钟，保留上清 液沉淀部分作进一步的SDS-PΑGE分析。

3.重组蛋白rPGRN、rPGRN-NQR的表达、纯化。

3.1样品制备

将IPTG诱导后的菌体23(0.1mmol/L，37℃，5h)g，用230mL破菌缓冲液重悬，破 菌缓冲液为Α1(20mmol/L咪唑的PBS，PH8.0)，然后高压均质破碎，4℃离心，收集上 清。

3.2镍柱亲和层析

样品为rPGRN、rPGRN-NQR破菌上清液15ml，用Α1液稀释2倍，取30mL上样。 纯化柱为XK16/20.Ni-chelαting fαst flow，体积16mL。结合缓冲液和洗脱缓冲液分别为Α1 和B1(500mmol/L咪唑的PBS，PH8.0)。实验采用explorer Box-900，5mL/min的 纯化系统，洗脱液分别为50mmol/L，250mmol/L和500mmol/L的B1，收集的液体对应为 10mL，22mL和5mL。

3.3脱盐

所用样品为250mmol/L咪唑洗脱蛋白，体积30mL，浓度2.0mg/mL，纯化柱为XK26/20 sephαdex G25，柱体积100mL。实验所用缓冲液为20mmol/L Tris-HCl，50mmol/LNaCl和 2mmol/LCaCl₂，PH8.0。纯化系统为explorer Box-900，脱盐收集液体35ml。

3.4肠激酶(Enterokinase，EK酶)酶切

酶切样品为上述脱盐后蛋白(20mmol/LTris-HCl，50mmol/L NaCl，2mmol/L CaCl₂)体 积35ml，浓度1.6mg/ml。(酶切条件为28℃，12h，用1μL EK酶作用于2.5mg蛋白)。

3.5阴离子交换层析

EK酶切后样品15mL(1.6mg/ml20mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，2mmol/L CaCl2， pH8.0)用20mmol/LTris-Hcl，PH7.0稀释2倍，共上样30mL。纯化柱为XK16/20，QHP， 柱体积10mL。纯化系统为explorer Box-900。缓冲体系由Α(20mmol/L Tris-Hcl，PH 7.0)和B(20mmol/L Tris-HCl，1mol/L NaCl，PH7.0)组成。采用梯度洗脱方式10％、20％、 40％、60％B洗脱目的蛋白。

4.重组蛋白rPGRN、rPGRN-NQR的纯度检测

重组蛋白样品用SDS-PΑGE非还原性电泳分析，判定样品的纯度。SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳法，制备分离胶和浓缩胶，分离胶的比例为15％。将供试品与供试品缓冲液按3：1 混合，100℃水浴，3-5分钟将预处理的供试品，用加样器点样于供试品孔中，供试品加样 量10μl，加样量不能低于10μg(考马斯亮蓝染色)或5μg(硝酸银染色)。接通电源后， 先80V跑出浓缩胶，用120V跑分离胶，直至电泳结束，染色分析结果。

5.ELISΑ检测rPGRN-NQR与TNFR1、TNFR2是否直接结合

1)在96孔板中加入100ng的TNF-α，4℃包被过夜；

2)加入1％的BSΑ封闭3h；

3)使用含有0.05％吐温的TBS溶液洗涤反应孔5次；

4)反应孔中加入100ng TNFRl或100ngTNFR2与一系列不同浓度的rPGRN、rPGRN -NQR；、

5)使用抗TNFRs的抗体检测固相中结合的TNFRs。

6.流式细胞术检测rPGRN、rPGRN-NQR与TNFR的结合。

1)小鼠RΑW264.7细胞高表达TNFR，将Biotinylαted rhTNF-α孵育细胞，Biotinylated  rhTNF-α与细胞表面特异性受体TNFR结合。然后，再用avidin-fluorescein孵育，由于 αvidin-fluorescein可与受体-生物素因子结合，故可通过流式细胞术中荧光强弱检测二者结 合量。

2)将Raw264.7细胞悬于PBS；

3)取lxl0⁵的细胞加入不同剂量的rPGRN、rPGRN-NQR(15ug，75ug)预处理30min；

4)加入生物素标记的TNF-α，细胞4℃孵育30min；

5)加入l0μL偶联有FITC的抗生物素蛋白，4℃避光孵育30min；

6)PBS洗涤细胞两次，并将细胞重悬于200ul洗涤缓冲液中用于流式细胞检测。

7、生物膜光干涉技术检测重组融合蛋白与TNFR1、TNFR2的亲和力

1)根据EZ-Link NHS-PEG12-Biotin(Thermo scientific)说明书操作方法，透析得到生物素 标记的TNFR1、TNFR2。

2)生物素标记的TNFR1、TNFR2固定于链霉素生物传感器表面，4mM Tris-HCl，20mM NaCl，pH7.0的缓冲液平衡3min直至建立稳定的基线。

3)随后，5种不同浓度梯度的BSA、rPGRN、rPGRN-NQR蛋白样品流过生物传感器，结 合到传感器的样品经干涉技术，实时检测配体与受体间动力学参数以及亲和力，并在软 件中呈现结合曲线。

4)Octet software v.6.1软件分析实验数据。

8.活体成像实验检测rPGRN-NQR体内靶向小鼠炎症关节

8.1Cy7-N-羟基琥珀酰亚胺酯染料标记rPGRN、rPGRN-NQR蛋白：

用1L0.1mol/LNαHCO3(pH8.3)透析1mgrPGRN、1mgrPGRN-NQR(500ug/ml，17KD) 蛋白4h，换液继续透析4h，之后换液透析过夜。

第二天上午①再次换液1L0.1mol/L NαHCO3(pH8.3)透析4h，随后用0.1mol/L NαHCO3稀释少量的蛋白，在280nm处测其紫外吸收值计算蛋白浓度；②用100ul DMSO 配置1mg Cy7NHS(MW818.01)，使其溶液浓度为10mg/mL，计算所需体积以得到想要的 CyDye NHS和蛋白的比值(例如20：1)，然后慢慢将其加入到蛋白溶液中，同时在暗处常 温缓慢搅拌45分钟。

第二天下午，用1L PBS溶液避光透析4小时，再次避光透析过夜。

4)第三天上午，换液再次1L PBS溶液避光透析4小时。用PBS整数倍稀释标记抗体 溶液，测量280nm(蛋白)和750nm(Cy7)处的紫外可见吸光度。

8.2CΑIΑ(Collagen antibody induced arthritis，CAIA)小鼠建模

联合使用单克隆抗体混合物和LPS来诱导CΑIΑ敏感性小鼠(BΑLB/c小鼠)关节炎。

第0天：静脉或腹腔注射1.5mg的5-克隆混合物。

第3天：腹腔注射25ug的LPS。

第12天：每组取三只发病均一的小鼠，做活体成像检测。

8.3CIA(Collagen-induced arthritis，CIA)小鼠建模1)建模：第0天：100μg鸡II型 胶原(Chondrex,LLC，Seattle，WA)与等量的完全弗氏佐剂(Chondrex，LLC，Seattle，WA 含有4mg/ml的热灭活分支杆菌)充分乳化混合成稳定的乳剂；用0.1ml乳剂分1～2个部 位注射小鼠尾巴基部。此为第一次激发免疫。2)建模第21天：100μg鸡II型胶原(Chondrex, LLC,Seattle,WA)与等量的不完全弗氏佐剂(Chondrex,LLC,Seattle,WA)充分乳化混合成 稳定的乳剂；用0.1ml乳剂分1～2个部位注射小鼠尾巴基部。此为第二次加强免疫。

8.4活体成像上机检测

1)10％水合氯醛麻醉CAIA、CIA模型小鼠后，腹腔给药Saline以及菁染料标记的rPGRN (20mg/kg)、rPGRN-NQR(20mg/kg)。将小鼠俯卧位平放于小动物活体成像系统暗箱 中。

2)对于CAIA模型，共三只小鼠，分别腹腔给药Saline、rPGRN以及rPGRN-NQR，0、1、 2、3、4h观察rPGRN-NQR在CAIA小鼠关节的靶向情况；

3)为进一步观察荧光靶向的持续时间，在CIA模型小鼠中，我们观测了0、1、2、3、4h 以及24h、48h、72h。同时为了验证rPGRN-NQR只靶向炎症关节部位而对正常关节 没有靶向作用，我们将小鼠增加至六只。分为正常组与CIA模型组，每组三只，分别 腹腔给药Saline、rPGRN以及rPGRN-NQR。

9.CIA模型小鼠的预防和治疗试验

1)rPGRN-NQR蛋白对CIA小鼠的预防试验

建模第19天后开始治疗，0、0.02、0.1、0.5、2.5mg/kg的rPGRN-NQR以及单剂量的 0.5mg/kg的rPGRN、etanercept背部皮下给药治疗小鼠(每组7只)，一周两次，给药32 天后处死小鼠。

2)rPGRN-NQR蛋白对CIA小鼠的治疗试验。

当临床评分≥10分(建模第35天)，0、0.1、0.5、2.5、5mg/kg的rPGRN、rPGRN-NQR 背部皮下给药治疗小鼠(每组7只)，一周两次。给药32天后处死小鼠。

注：观察小鼠四肢关节改变并进行临床评分：0，表观正常，关节灵活；1，跗骨或者 踝关节轻微肿胀；2，脚踝至跗骨轻微肿胀；3，踝关节至跖关节中度肿胀；4，脚、脚趾以 及踝关节严重肿胀或者肢体关节僵硬。4只爪得分之和为每只小鼠的总分，最高分为16分。

预防组和治疗组的处理方案的示意图参见图5。

3)组织病理学观察

石蜡包埋组织

1)小鼠关节组织标本用4％多聚甲醛溶液固定后，置于脱钙液中脱钙。

2)脱钙后冲水12-24h，

3)75％酒精，1次，1h；

4)85％酒精，1次，1h；

5)95％酒精，3次，1h；

6)100％酒精，3次，1h；

7)二甲苯，2次，1h；

8)石蜡浸泡，3次，70min

9)包埋组织。

H&E染色

1)切片后二甲苯脱蜡，2次，10min；

2)100％酒精去二甲苯，2次，2min；

3)95％酒精，1次，1min；

4)85％酒精，1次，1min；

5)70％酒精，1次，1min；

6)自来水洗；

7)Mayer氏苏木素染色3min，自来水洗1min；

8)1％盐酸酒精分化20s，自来水洗1min；

9)1％稀氨水返蓝30s，自来水洗1min；

10)伊红染色2min，自来水洗30s；

11)70％酒精20s，80％酒精30s；

12)95％酒精，2次，1min；

13)100％酒精，2次，2min；

14)二甲苯，2次，5min；

15)中性树胶封片；镜下观察并拍照。

10、RT-PCR检测小鼠脾脏细胞IL-17A、Foxp3、GATA3以及T-bet的表达

1)取新鲜的脾脏组织，按照淋巴细胞分离液说明书进行分离。

2)将分离的淋巴细胞溶解在含1ml Trizol的EP管中，室温静置5min，10,000g，4℃离心10 min。

3)取上清加入三氯甲烷0.2ml，振荡，室温静置3min，12,000g，4℃离心15min。

4)取上层水相，加异丙醇0.5ml，室温静置10min，12,000g，4℃离心10min。弃上清，75％ 乙醇清洗RNA沉淀，7,500g，4℃离心5min，晾干RNA。

5)以30μl DEPC水溶解，分光光度计测浓度，RNA电泳。

6)按照SuperScripTM First-Strand Synthesis System(invitrogen公司)试剂盒说明书合成 cDNA。

7)取cDNA2μl做半定量PCR，用相应细胞因子上游及下游引物各50pmol，β-actin上游及下 游引物各50pmol。

8)取反应结束产物8μl加样于1％琼脂糖凝胶上电泳。引物由上海英潍捷基生物技术有限公 司合成(引物序列见表1)

表1RT-PCR检测引物序列

11.TNFα胞内信号通路检测

1)小鼠骨髓细胞分离自5-8周龄C57BL/6小鼠的股骨，去除黏附的软组织，将股骨两端剪 去，用21-gaugel的注射器吸取α-MEM(包含有L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素及热灭活 的10％FBS)；从骨项一端冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞，轻轻摇匀成单细胞悬液。用α-MEM 洗涤细胞2次，再悬浮细胞(3.75×105cells/m1)于α-MEM中，M-CSF10ng/ml，置于 培养板中，37℃，5％CO2培养24h。

2)收集未贴壁细胞，2.5×105cells/ml，置于培养板中，M-CSF(10ng/ml)培养3天。此时 贴壁细胞为骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)。

3)10ng/ml TNFα同时加入PBS、rPGRN(25nM)或rPGRN-NQR(25nM)共刺激BMDMs， 处理0、5、15、30、60min后，吸去培养基，将细胞刮下，用冰浴的PBS清洗2次(4 ℃，500g/min，2min)；

4)加入200μl细胞裂解缓冲液超声破碎，12000rpm，离心3min，吸取上清，即为全细胞 提取物。

5)全细胞提取物加入上样缓冲液。100℃煮5min。

6)将制备好的蛋白样品进行Western免疫印迹。

12.统计学分析

所有的统计学分析是采用SPSS软件完成。数据以平均数±标准误形式表示，各实验组间 比较采用单因素的方差分析。P值＜0.05时，可认为差异有显著性，P值＜0.01时，可认为差 异极显著。

三、实验结果

1、rPGRN、rPGRN-NQR重组蛋白的制备

rPGRN、rPGRN-NQR连在pET-44a载体上，经过限制酶SmaⅠ和HindⅢ双酶切方法 进行鉴定后电泳分析得到预期结果(图4)，测序结果后的比对也表明获得了预期的原核表 达质粒pET-44a-rPGRN、pET-44a-rPGRN-NQR。

1.2重组蛋白rPGRN、rPGRN-NQR的纯化。

蛋白经纯化后，电泳检测结果见图6。

2、ELISΑ检测rPGRN-NQR可直接与TNFR1、TNFR2结合

96孔板中加入溶于100ul TBS的500ng的rPGRN、rPGRN-NQR包被，封闭后加入 不同浓度的TNFRl(图7Α)或TNFR2(图7B)胞外区，分别使用抗TNFRl或抗TNFR2抗体检 测结合的TNFR1或者TNFR2。

结果表明TNFR1或TNFR2的结合与rPGRN-NQR表现出剂量依赖性，最终达到饱 和(图7)，表明rPGRN-NQR与TNFR1或TNFR2的能够直接结合。

3、流式细胞术检测rPGRN、rPGRN-NQR抑制TNF-α与TNFR的结合

TNFRl和TNFR2在RAW264.7细胞表面高表达，采用流式细胞术检测rPGRN、 rPGRN-NQR对生物素标记的TNFα(Bt-TNFα)与RAW264.7细胞表面结合情况的影响(参 见图8)。对荧光标记的抗生物素抗体信号检测表明，随着rPGRN、rPGRN-NQR浓度的升 高，能够更有效地影响生物素标记的TNFα与RAW264.7细胞的结合，证明rPGRN、 rPGRN-NQR可竞争性抑制TNFα与RAW264.7细胞膜表面受体的结合。

4.动力学分析rPGRN、rPGRN-NQR与TNFR1/TNFR2结合

为进一步验证rPGRN、rPGRN-NQR可以与TNFR1、TNFR2结合，分别对rPGRN、 rPGRN-NQR与TNFR1、TNFR2做了分子动力学分析即生物膜光干涉技术(BLI)实验。 首先将生物素标记的TNFR1、TNFR2固定于链霉素生物传感器表面，5种不同浓度梯度的 BSA、rPGRN、rPGRN-NQR蛋白样品流过生物传感器，结合到传感器的样品经干涉技术， 实时检测配体与受体间动力学参数，受体与配体的结合响应值随着配体蛋白浓度的增加而 增大(结果见图10)。生物膜光干涉实验显示rPGRN-NQR分别与TNFR1或TNFR2的平衡 解离常数基本相当(表4)。

此外，我们还列出了TNFα、rPGRN、rPGRN-NQR与TNFR1/TNFR2的亲和力常数，见表2。

表2.rPGRN、rPGRN-NQR与TNFR1和TNFR2的平衡解离常数

4、活体成像实验检测rPGRN-NQR体内靶向小鼠炎症关节

于CAIA模型BΑLB/c小鼠腹腔内注射10％水合氯醛100μL麻醉动物，每组三只小鼠 从左至右依次腹腔给药PBS、rPGRN(20mg/kg)、rPGRN-NQR(20mg/kg)。将小鼠俯卧 位平放于小动物多光活体成像系统的记录暗箱中，观察0、1、2、3小时，rPGRN-NQR在 CΑIΑ小鼠关节的靶向情况(Caliper Life Sciences，Spectrum Living Image4.0分析软件)，结 果见图9，图中箭头表示荧光靶向位置。rPGRN不具有靶向作用，rPGRN-NQR仅靶向炎症 关节。

此外，取3只发病均一的模型CIA模型小鼠以及3只正常小鼠，菁染料标记rPGRN、 rPGRN-NQR蛋白后，分别对正常组与CIA模型组小鼠腹腔给药Saline、rPGRN(20mg/kg)、 rPGRN-NQR(20mg/kg)，10％水合氯醛麻醉小鼠后将其俯卧位平放于小动物多光活体成像 系统的记录暗箱中，观察0、1、2、3、4h以及24h、48h、72h时rPGRN–NQR在CIA小 鼠关节的靶向情况。发现rPGRN不具有靶向作用，rPGRN-NQR仅靶向炎症关节，对正常 组小鼠没有靶向作用。并且荧光强度虽然在24h、48h、72h不断减弱，但是荧光依旧存在。

5、rPGRN-NQR在CIA模型小鼠中的预防和治疗效果

预防和治疗的处理方式参见图5，预防治疗在建模第19天后开始治疗，0、0.02、0.1、 0.5、2.5mg/kg的rPGRN-NQR以及单剂量的0.5mg/kg的rPGRN、etanercept(Enbrel)背 部皮下给药治疗小鼠(n＝7)，一周两次。并每隔一天进行临床评分。待分别治疗32天后， 进行小鼠足爪外观成像以及关节影像学x线片，发现rPGRN或rPGRN-NQR能够抑制CIA 小鼠类风湿性关节炎症状(图11A)，rPGRN或rPGRN-NQR治疗后的ClA小鼠关节炎临床 评分(图11B)明显降低，影像学x线片可看出治疗组小鼠的关节变形以及骨侵蚀明显得 到改善(图11C)。Saline、rPGRN或rPGRN-NQR治疗的CIA小鼠跗关节组织切片H&E 染色后，对小鼠跗关节进行组织形态学分析(图11D)。Saline处理组CIA小鼠跗关节表现 为严重的细胞浸润，滑膜炎、关节翳以及关节腔间隙变窄，而rPGRN和rPGRN-NQR治疗 的CIA小鼠跗关节组织形态正常，且rPGRN-NQR治疗效果优于rPGRN，这表明NQR与 rPGRN融合表达后，显示了更好的关节炎治疗效果。

对于治疗组小鼠，当临床评分≥10时(建模第35天)后开始治疗，治疗方式同上，每 隔一天进行临床评分。待分别治疗32天后进行小鼠足爪外观成像以及关节影像学x线片。 在治疗组小鼠中，得出与上述同样的结论，rPGRN-NQR治疗后的小鼠无论在小鼠足爪外观 (图12A)、临床评分(图12B)、关节影像学x线片(图12C)以及组织形态学(图12D) 都明显优于Saline组小鼠，并优于rPGRN治疗组小鼠，这进一步NQR与rPGRN融合表达 后，显示了更好的关节炎治疗效果。

6、类风湿性关节炎相关信号通路检测

RT-PCR分析小鼠脾脏细胞中Th17/Treg、Th1/Th2细胞相关信号通路IL-17A是Th17 细胞重要的炎症细胞因子，在RA发病机制中引起炎症细胞浸润和组织损伤；Foxp3是Treg 特异性转录因子，对Treg的发育和功能起着重要的调节作用；T-bet、GATA-3分别是Th1、 Th2细胞分化的特异性转录因子。因此通过检测IL-17A、Foxp3、T-bet以及GATA-3在脾 脏细胞的表达，可以反映Th17/Treg、Th1/Th2细胞相关信号通路的改变。从rPGRN、 rPGRN-NQR治疗后的小鼠中提取脾脏细胞mRNA，并做IL-17A、Foxp3、T-bet以及GATA-3 的mRNA水平的定量分析。结果显示，与Saline组相比，rPGRN-NQR治疗后IL-17A mRNA 表达量降低，Foxp3mRNA表达量升高(图13A、B)，而GATA3以及T-bet mRNA表达量 没有变化(图13C、D)。

7、rPGRN-NQR抑制TNFα诱导的p38、ERK1/2、JNK的磷酸化水平实验结果

TNFα结合TNFRs并活化受体，TNFRs胞内区活化后随即募集各类转接蛋白，并通过 一系列级联反应活化多种信号途径，其中MAPK途径是TNFα诱导的一条重要炎性信号途 径。本实验中我们对TNFα单独或与rPGRN、rPGRN-NQR共处理的BMDMs中MAPK途 径信号分子，包括ERK1/2、p38和JNK的活化进行了检测。rPGRN、rPGRN-NQR与TNFα 共处理的BMDMs，可检测到rPGRN、rPGRN-NQR对p38和ERK1/2磷酸化的抑制作用。 rPGRN在15min中时对p38的磷酸化水平瞬间上调，不过随后在30min、60min时又呈现 下调趋势。而无论是p38或ERK1/2，rPGRN-NQR对其磷酸化水平均有抑制作用，并且这 种抑制作用较rPGRN明显。此外，二者对JNK的磷酸化抑制作用不是很明显(图14)。

上述实验主要制备得到了纯度达到95％以上的重组融合蛋白rPGRN-NQR，验证了其 rPGRN-NQR对类风湿性关节炎小鼠的治疗作用。NQR多肽与rPGRN融合表达后，发挥了 优于rPGRN的关节炎治疗效果。在机制研究方面发现，重组融合蛋白rPGRN-NQR抑制 Th17、激活Treg信号通路；抑制TNFα诱导的p38、ERK1/2、JNK的磷酸化水平。实验表 明，本发明rPGRN-NQR既能靶向类风湿性关节炎小鼠的关节部位，又能特异性地拮抗 TNFα/TNFR的生物学功能，具有协同作用，是类风湿性关节炎良好的候选生物药物。

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