完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法

摘要

本发明公开了一种完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法。该方法是在正常生长的细胞培养液中加入翻译延伸抑制剂，待翻译延伸抑制剂有效作用于RNC，抑制翻译延伸的进行后，将细胞冷却至0～4℃，再用预冷至0～4℃的PBS溶液清洗细胞以及加入细胞中，液氮中快速冷冻，超低温保存，于冰上解冻，再抽提RNC。本发明通过采用翻译延伸抑制剂有效固定核糖体，使之不易解离，将细胞内的翻译状况固定下来；再通过液氮急冻方法有效地冷冻保存RNC长期储存和运输，并且解冻后所提取的RNC与新鲜细胞提取的RNC无异，因此本发明突破了时间和空间的限制，为研究RNC及开展RNC商业服务提供了便利。

说明书

技术领域

本发明属于生命科学技术领域，特别涉及一种完整冷冻保存及解冻细胞内 核糖体新生肽链复合物(Ribosome Nascent-chain Complex，RNC)的方法。

背景技术

翻译调控是生命体内的重要调控层次。在细胞中有的基因翻译多、有的基 因翻译少，有的基因根本就不被翻译。因此对细胞中的翻译状况进行研究显得 极为必要。细胞进行翻译时，核糖体结合在mRNA链上并移动，依据mRNA上 的三联密码子信息来逐步合成蛋白质多肽链(称为新生肽链，nascent-chain)。 这一复合物称为核糖体新生肽链复合物(Ribosome Nascent-chain Complex, RNC)。只有完整提取了RNC，才能对正在翻译的mRNA进行定性定量研究以 及对新生肽链进行研究。对正在翻译的mRNA的定性定量研究和对新生肽链的 研究是翻译研究的主要的两大方面。因此，完整提取得到RNC对研究和应用都 有重要的意义。对正在翻译的mRNA进行测定(翻译组测序)，可用正在翻译的 mRNA的含量推算蛋白质的含量(Wang et al.Translating mRNAs strongly  correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are  phenotype specific.Nucleic acids research 41,4743-4754,2013)，可计算翻译效率 从而表征细胞的各种表型(Wang et al.,2013，文献前面已提过，此处略，下文 中，只要是简写的，均为文献名称已在背景技术提及过)，可以发现未知蛋白 (Zhang et al.How to discover new proteins-translatome profiling.Science China  Life sciences 57,358-360，2014b)，对蛋白质组也有重要的指导意义(Chang et al. Systematic analyses of the transcriptome,translatome,and proteome provide a global  view and potential strategy for the C-HPP.Journal of proteome research 13,38-49， 2014；Liu et al.Chromosome-8-coded proteome of Chinese Chromosome Proteome  Data set(CCPD)2.0with partial immunohistochemical verifications.Journal of  proteome research 13,126-136,2014；Wang et al.Omics evidence:single nucleotide  variants transmissions on chromosome 20in liver cancer cell lines.Journal of  proteome research 13,200-211,2014；Zhang et al.Systematic analysis of missing  proteins provides clues to help define all of the protein-coding genes on human  chromosome 1.Journal of proteome research 13,114-125,2014a；Zhong et al. Resolving chromosome-centric human proteome with translating mRNA analysis:a  strategic demonstration.Journal of proteome research 13,50-59，2014)，被列为人 类蛋白质组计划的第四支柱(Zhong et al.，2014)。对新生肽链的研究，可以研 究蛋白质合成过程中的折叠状况(Zhang et al.Transient ribosomal attenuation  coordinates protein synthesis and co-translational folding.Nature structural& molecular biology 16,274-280,2009；Zhang and Ignatova.Generic algorithm to  predict the speed of translational elongation:implications for protein biogenesis.PloS  one 4,e5036，2009；Zhang and Ignatova.Folding at the birth of the nascent chain: coordinating translation with co-translational folding.Current opinion in structural  biology 21,25-31，2011)，也可为生物工程中外源表达蛋白的可溶性优化提供重 要依据(专利申请号：201310164451.4，201310164454.8)。

能高效完整提取RNC的方法是利用蔗糖密度梯度离心法，此方法能完整提 出RNC，定量保留核糖体上全长的mRNA和新生肽链以供其后的各种生化与分 子生物学研究(Wang et al.,2013；Zhang et al.,2009)。然而此法只适用于新鲜细 胞提取RNC。由于RNC非常脆弱，无法在不冷冻的情形下长期保存和运输；而 在冷冻与解冻后，核糖体会从mRNA上大量脱落，无法做到有效保存(Zhang et  al.,2009)。因此，RNC相关分析只能在少数具备全部相关实验条件的实验室完 成，无法保存和运输。这给许多实验应用以及商业服务带来了很大的困难。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种完整冷冻保存及解 冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种完整冷冻保存及解冻细胞内核糖 体新生肽链复合物的方法，包括如下步骤：首先通过翻译延伸抑制剂抑制细胞的 翻译活动，然后去除培养液，清洗细胞，再将清洗后的细胞用液氮进行快速冷冻 处理，接着将快速冷冻处理好的细胞置于不高于-80℃的环境下保存；使用时将细 胞转移至冰上解冻即可；

所述的完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法，优选包括 如下步骤：

(1)抑制细胞的翻译活动：在正常生长的细胞培养液中加入翻译延伸抑制 剂，摇匀，翻译延伸抑制剂的用量为能稳定抑制细胞翻译延伸即可；接着将细胞 置于原培养环境中培养，该培养的目的是为了使得翻译延伸抑制剂能有效作用于 RNC，抑制翻译延伸的进行；然后将细胞立即冷却至0～4℃，以使其其余代谢过 程基本停止，防止RNC被降解；

(2)去除培养液，对不同细胞的操作具体如下：

①对悬浮培养细胞进行离心，弃上清，取沉淀；

②对贴壁生长细胞而言，倒出培养液即可；

(3)清洗：使用预冷至0～4℃的PBS溶液清洗细胞，清洗完毕后弃去PBS 溶液；对不同细胞的操作具体如下：

①将PBS溶液加入悬浮培养细胞中，将悬浮培养细胞悬于PBS溶液后离心， 弃上清，取沉淀；

②将PBS溶液加入贴壁生长细胞中，再倒出PBS溶液即可；

(4)快速冷冻处理：加入预冷至0～4℃的PBS溶液，待速冻完毕后的温度 稳定在液氮温度后进行下一步；对不同细胞的操作具体如下：

①对悬浮培养细胞的操作为将细胞悬于PBS溶液后立即浸没于液氮中；

②对贴壁生长细胞的操作为将PBS溶液浸没过细胞后立即放入液氮中；

(5)超低温保存：将速冻完毕的细胞转移至超低温保存环境，该超低温保 存环境应满足温度始终不高于-80℃；在该条件下，能进行储存和运输；

(6)解冻：储存和运输后需解冻以继续提取RNC时，将细胞从超低温保存 环境迅速转移至冰上，等待解冻过程中避免震动，直至完全解冻。

本发明的操作和细胞培养过程中的操作一样，动作要轻柔；

本发明中所述的PBS溶液为能保持细胞渗透压的PBS溶液，如pH7.2～7.4、 0.01～0.1mol/L的PBS溶液；

所述的PBS溶液优选通过如下步骤制备得到：称取NaCl 8.0g、KCl 0.2g、 KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO₄·12H₂O 3.628g，再用水定容至1000ml，除菌；

当所述的水为DEPC处理水时，所述的除菌为过滤除菌或高压灭菌；高压灭 菌的条件为115～121℃灭菌15～60min；

当所述的水不是DEPC处理水时，只能高压灭菌，条件为121℃高压蒸汽灭 菌60min；

本发明中所述的离心的条件和细胞培养过程中的离心的条件相同，优选为 800～1000rpm离心10～20min；

步骤(1)中所述的翻译延伸抑制剂在所述的细胞培养液中的终浓度优选为 应为能完全抑制翻译延伸的最低浓度的2倍以上；

所述的翻译延伸抑制剂包括放线菌酮、氯霉素等；对于真核生物而言，适用 放线菌酮；对于原核生物而言，适用氯霉素；

所述的放线菌酮在所述的细胞培养液中的终浓度优选为0.1mg/ml以上；

步骤(1)中所述的将细胞置于原培养环境中培养的时间优选为10～20分钟； 更优选为15分钟；

步骤(1)中所述的将细胞立即冷却至0～4℃中的温度优选为0℃，可通过 如下操作实现：将细胞立即转移至冰上却至0℃；

步骤(5)中所述的超低温是指-80℃以下，目前常用-196～-80℃，从成本考 虑，优选为-80℃。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的方法能有效地冷冻保存RNC长期储存和运输，并且解冻 后所提取的RNC与新鲜细胞提取的RNC无异。

(2)本发明提供的方法突破了时间和空间的限制，为进一步研究RNC提供 了便利。

附图说明

图1是冷冻A549细胞翻译组测序的基因表达量与新鲜A549细胞翻译组测序 的基因表达量比较后的结果图。

图2是不同实施方式提取的RNC-RNA的琼脂糖电泳凝胶结果图；其中：泳 道1和2为对比例2中分别于室温和-20℃条件放置两天后抽提得到的RNC-RNA， 泳道3为对比例1中样品使用非急冻条件后抽提得到的RNC-RNA，泳道4为按 实施例1步骤处理样品后抽提得到的RNC-RNA。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

本发明实施例涉及的主要材料如下：

-人肺癌细胞系A549(购自美国ATCC)。

-PBS溶液：称取NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO₄·12H₂O 3.628g，再用双蒸水水定容至1000ml，pH＝7.4，121℃灭菌1小时。

-RB溶液：20mM、pH7.4的HEPES-KOH溶液、15mM MgCl₂、200mM KCl、 100μg/ml放线菌酮，2mM二硫苏糖醇，pH＝7.4。配制时使用无菌无RNase的水 和无菌器具，配制完毕后溶液需过滤除菌。

-蔗糖溶液：30％(w/v)蔗糖溶于上述RB溶液，预冷至0～4℃。

-放线菌酮(广州捷倍斯公司)水溶液储液：浓度为100mg/ml。

-细胞培养液：在Dulbecco’s modified Eagle’s medium细胞培养液(Invitrogen 公司)加入胎牛血清(PAA Australia公司)、氨苄青霉素、链霉素和环丙沙星， 其中，胎牛血清的终浓度为体积百分比10％、氨苄青霉素和链霉素的终浓度分别 为质量体积比1％，环丙沙星的终浓度为10μg/ml(杀灭可能的支原体污染)。

-细胞裂解液：Triton X-100溶于上述RB溶液中，Triton X-100的终浓度为 体积百分比1％。

实施例1

(1)用细胞培养液于37℃、0.5％CO₂环境中培养人肺癌细胞系A549。

(2)接着加入放线菌酮水溶液储液，摇匀，放线菌酮的终浓度为0.1mg/ml。

(3)在原培养环境(即37℃、0.5％CO₂环境)继续培养15分钟。

(4)小心倒出培养液，再加入预冷至0℃的PBS溶液，PBS溶液的作用是 清洗细胞。

(5)小心倒出PBS溶液，再加入预冷至0℃的PBS溶液，此时PBS溶液必 须要浸没过A549细胞。

(6)由于A549细胞是贴壁生长的，将细胞培养瓶的细胞贴壁面迅速放入液 氮中，直至温度稳定在液氮温度(-196℃)。

(7)将已速冻好的细胞培养瓶迅速转移至-80℃超低温冰箱，保存。

(8)需继续提取RNC时，从超低温冰箱中取出细胞培养瓶，埋入事先准备 好的冰盒中，在0℃下静置解冻。

(9)解冻完毕，立刻继续进行提取RNC的步骤。该步骤见文献“Wang et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their  translation ratios are phenotype specific.Nucleic acids research 41,4743-4754, 2013”，具体如下：

①加入1ml细胞裂解液，静置于冰上30分钟。

②用细胞刮轻轻将细胞刮下，转移至预冷至0℃的1.5ml离心管中。

③在微量冷冻台式离心机中离心，条件为16200×g、10分钟，除去细胞碎 片(沉淀)。

④上清液小心转移至事先准备好的在超速离心管中2ml蔗糖溶液表层。

⑤4℃、50000×g超速离心3小时。

⑥弃上清，将沉淀溶于RB溶液中，得到冷冻A549细胞的RNC。

(10)使用RNA提取试剂(Invitrogen公司)，按其说明手册方法操 作，从RNC中提取RNA。

(11)使用NEBNext mRNA library construction kit for Illumina(New England  Biolabs公司)对RNC-RNA中的mRNA进行测序建库，Illumina HiSeq-2000测序 仪进行二代测序，获得冷冻A549细胞的翻译组测序信息(正在翻译的mRNA的 定量信息)。

为检验本发明方法对RNC的定量保存效果，将上述结果与未经冷冻的A549 细胞新鲜提取的RNC-RNA测序结果(具体方法见Wang et al.,2013)进行比较。

图1是比较冷冻2天后的A549细胞翻译组测序的基因表达量(LN)与新鲜 A549细胞翻译组测序的基因表达量(N)的结果图。基因表达量采用rpkM法计 算(Mortazavi et al.Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature methods 5,621-628,2008)。由图中可知，冷冻提取RNC与新鲜提取RNC 中，正在翻译中的mRNA表达量高度一致，Pearson相关系数高达R＝0.99。进一 步使用edgeR软件(Robinson et al.edgeR:a Bioconductor package for differential  expression analysis of digital gene expression data.Bioinformatics 26,139-140,2010) 分析两种方法的差异基因，在14226个定量检测到的基因中，有统计显著差别 (p<0.01)的基因仅有11个(仅占0.077％)，完全可认为是实验误差导致。这些 结果说明本发明方法从冷冻细胞中提取的RNC与新鲜提取RNC无明显的定量差 别。

对比例1

(1)同实施例1步骤(1)。

(2)同实施例1步骤(2)。

(3)同实施例1步骤(3)。

(4)同实施例1步骤(4)。

(5)同实施例1步骤(5)。

(6)接着置于-80℃冰箱缓慢冷冻细胞样品。

(7)解冻及提取RNC，同实施例1步骤(8)～(10)。

(8)检测：使用2％琼脂糖凝胶电泳检测，SYBR Green II染料染色，紫外 凝胶成像系统拍摄。使用Nanodrop 2000型微量分光光度计进行RNA定量测定。

按实施例1方法提出的RNC-RNA经过浓度测定及计算，实施例1明显多于 对比例1提供的方法：正常提取浓度(实施例1)为202ng/μl，对比例1提取样 品浓度为97.7ng/μl，比正常提取方法少2倍多。取等体积上样跑胶，对比例1所 得RNA条带(图2，泳道3)亮度比实施例1中所得RNA条带(图2，泳道4) 亮度明显低。可见，在液氮中速冻后RNC能最大程度保存，而慢速冷冻会造成 核糖体大量脱落，提取量低。

对比例2

(1)同实施例1步骤(1)。

(2)同实施例1步骤(2)。

(3)同实施例1步骤(3)。

(4)同实施例1步骤(4)。

(5)同实施例1步骤(5)。

(6)不进行冷冻，而是在室温下或-20℃下放置2天。

(7)提取RNC，同实施例1步骤(9)和(10)。

(8)检测：使用2％琼脂糖凝胶电泳检测，SYBR Green II染料染色，紫外 凝胶成像系统拍摄。

从电泳结果可看出，所提取得到的RNC-RNA均有严重的降解(图2，泳道 1为室温，泳道2为-20℃)，无法用于后续实验。这说明如果不采用超低温冷冻 的方法，RNC是不稳定的，将无法长期保存运输RNC。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。