巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记及其应用

摘要

本发明巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记及其应用,属于分子生物学技术领域，所述巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；本发明提供了巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记的特异性正反向引物，还提供了优化的PCR体系和扩增程序，通过对巴氏新小绥螨待测样本的该分子标记的分析，即可得知待测样本是对甲氰菊酯的敏感品系还是抗性品系。该方法操作简便快捷，检测特异性强、灵敏度高，可以随时监测捕食螨的抗药性，有利于“以虫杀虫”的生物防治策略，对于减少化学农药的使用、环境保护、果园可持续发展有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种分子标记，尤其涉及一种巴氏新小绥螨对甲 氰菊酯抗性的分子标记及其应用。

背景技术

巴氏新小绥螨属蜱螨亚纲，寄螨目，革螨亚目、植绥螨科，小新绥螨属，因其发育历期 短、死亡率低、产卵率高、扩散力强的优点被认为是最好的生物防治天敌之一。巴氏新小绥 螨是多食性捕食螨，除了捕食叶螨和蓟马外，还可以捕食蚜虫、木虱、粉虱、介壳虫、跳虫、 跗线螨、丝状菌和蚊蝇类的幼虫等。

以甲氰菊酯为代表的菊酯类农药是目前果园使用较为广泛的杀虫杀螨剂，已有研究表明， 菊酯类农药对植绥螨的毒力较大，在使用过程中容易造成植绥螨的大量死亡，导致害螨的大 爆发。因此我们室内筛选获得抗药性巴氏新小绥螨，释放到果园后可以有效应对农药胁迫， 这对于该螨的田间释放与长期应用有很高的实用价值。然而从形态上很难鉴别巴氏新小绥螨 对甲氰菊酯的敏感品系和抗性品系。

随着分子生物技术的发展及其广泛应用，分子标记被用来解决种类鉴定这个问题。找到 巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记，对于区分巴氏新小绥螨对甲氰菊酯的敏感品系和 抗性品系具有重要意义。目前螨类对菊酯类杀虫剂的抗性产生普遍认为是由于其靶标钠离子 通道基因发生突变而导致的。

发明内容

本发明根据巴氏新小绥螨对甲氰菊酯敏感和抗性品系分类领域的空白，提供一种巴氏新 小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记。

本发明的另一目的是提供该分子标记在巴氏新小绥螨对甲氰菊酯敏感品系和抗性品系分 类中的应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：一种巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记， 该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：

CAACCTTTCACAGGCCAATCCCGATTCGGGCGACACAAAGAAACTTCAAGAAGCGATCGATCGCTTTCACAGAGCTGGAA GATGGGTGAAAAGAAAATTCAGAGACATGTTCATGCTATGTTCCGGGAAACAGCAAAATCAAATCTCGGACCAAACCTAT CCAGATGATCTTGATATAGACACTGGGGTCATCATCATGGATGGTCAAGTCATAAAGAGGGAGAGCCCAACACCCGAACT CATGGATAGGTTGGACATTGGTTTTCAAGTTGACAAGCACCAACAGGACATTGTCATGCATAAGCTTAAAAACAATTCCC GACCTATCATTGGCAATTCGAAGGAATTCAGCAATAAAGTCCATCCGGGTCCGGATAATTGTCTTTTGAAGCCGTCCAAC GAAAGCCTCATTCAGGACACCGAACTGGGACCATTCTCACTCAGTTCACCTTCGTGTATCGTCGATCAGCCATTATCCGC GCATGACAGTCTGCACAGAAACTCTGAGGGTCTCATCACCCCACTGACCGGGGAATCGCCCTCGGTCAGATTCAGTAGGG AACTCGATGACAACCTTCAACCGGGAGATTTCAAGGCAGCAGACGAATCTCCCGGTACCGGTTCGGAAGAACGCCCGACT CAGGACGCGGATGGTGGGGGCGACGGCGAAGAGAGCGCCGCCGACGAAGTCGATGCGAAGGAAGGATCGGAGGGCGGTCA TAACATCGAAGCCGCGGCATCCGACCTCATCATACCAGAACTTCCGGCGGACTGCTGTCCTGAATGTTGCTATGTACGCT TCGCATGCTGCTGCATAGCCGACGATTCGATGCCTATGTTCAACAAATACAAAATTTACCGAGCGAAGTCATTTGCTCTG GTTGAAAATAATAGATTCGAGACCATTGTCGTCATCCTAATCTTGGCCAGCAGTTTAGCTCTGGCGTTGGAAGACGTCAA TCTAAAACATCGTCCGTGGCTCGTACACGTACTGAACTTCATGGACAAAACATTCACTGTGATTTTCTTCTTTGAAATGT TACTGAAATGGCTTGCTTTCGGCCTACAAAAATATTTTACCAACGCGTGGTGTTGGCTCGACTTCGTCATCGTGTTCGTA TCTGTGATCAATCTAGTAGCGACCTGGCTGGGAGCAGGTAAAATTCAAGCGTTCAAGACCATGAGAACCCTGCGTGCCTT GCGCCCTCTACGAGCGCTTTCCCGCTTCCAAGGCATGAGGGTCGTAGTCAATGCTCTAGTCCAAGCCATTCCTGCCATCT TCAATGTGTTGCTGGTCTGTCTCATATTCTGGCTGATCTTCTCGATCATGGGAGTGCAAATGTTCGCGGGCAAGTTCTAT CACTGTGTGGACGCGAATGGCACACAGTTGAACTCCTCATTCATTCCGAATCGAGAAGCCTGCATAAACAACAATTATAC ATGGCAGAATCCCATGATCAATTTTGACAACGTGCTCAATGCATACCTGGCCCTATTCCAAGTGGCCACGTTCAAAGGTT GGATCGACATAATGGCTCGCGCTACGGATTCTAAATCTAAAGACGATCAACCTGACTACGAAGTCAACATATACATGTAC CTGTATTTCGTATTCTTCATAATTTTTGGAGCATTCTTCACTCTGAATCTGTTTATCGGAGTCATCATTGACAATTTCAA TGGGCAAAAGACGAAAGCCGGAGGATCTTTAGAGATGTTCATGACTGAAGACCAGAAGAAGTATTACAACGCAA

本发明还提供了一种巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记的特异性正反向引物，该 引物序列如下：

F：5’-CAACCTTTCACAGGCCAATC-3’；

R：5’-TTGCGTTGTAATACTTCTTCTG-3’。

本发明还提供了一种巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记的检测方法，其特征在于 PCR扩增体系中采用的特异性正反向引物是根据上述巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标 记的核苷酸序列设计的，所述特异性正反向引物扩增的区域在该标记的核苷酸序列上，该方 法先提取待测巴氏新小绥螨的总RNA，将总RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板用所述特异 性正反向引物进行PCR扩增，得到包含突变区域的钠离子通道基因片段，将得到的基因片段 与上述巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记进行序列比对，即可判断该品系是对甲氰菊 酯的敏感品系还是抗性品系，若得到的钠离子通道基因片段与上述分子标记序列相同则为对 甲氰菊酯的抗性品系；所述特异性正反向引物为：

F：5’-CAACCTTTCACAGGCCAATC-3’；

R：5’-TTGCGTTGTAATACTTCTTCTG-3’。

所述PCR体系为：PCR Master Mix25μL，正反向引物各2μL，待测样本cDNA模板50～ 100ng，补充ddH₂O至50μL。

所述PCR扩增的程序为：94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，58℃退火30sec，72 ℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸5min。

本发明的有益效果是：

1)本发明定位了巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记。该标记的特异性强、稳定 性高，通过对巴氏新小绥螨待测样本的该分子标记的分析，即可得知待测样本是对甲氰菊酯 的敏感品系还是抗性品系。从而可以随时监测捕食螨的抗药性，有利于“以虫杀虫”的生物 防治策略，对于减少化学农药的使用、环境保护、果园可持续发展有重要意义。

2)本发明提供了巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记的特异性正反向引物，还提供 了优化的PCR体系和扩增程序，可以成功快速地从巴氏新小绥螨中扩增出一条1754bp的DNA 条带，该条带即是与巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性密切相关的序列，该方法操作简便快捷， 检测特异性强、灵敏度高。

附图说明

图1为巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性和敏感品系总RNA的电泳图：n1和n2为敏感品系 RNA，n3和n4为抗性品系RNA。

图2为巴氏新小绥螨抗性品系和敏感品系中的钠离子通道基因SNP分析。A，B,C分别 为含有SNPs的三个片段。SS：敏感品系；RS：抗性品系。

图3为巴氏新小绥螨抗性品系和敏感品系中的钠离子通道基因对应的氨基酸序列差异分 析。

图4为特异性正反性引物对田间待测样本cDNA的PCR扩增产物电泳图。M：Marker；1,2： 扩增条带。

具体实施方式

实施例1巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性和敏感品系的钠离子通道基因全长的获得

1.材料

1.1供试螨源

敏感品系：巴氏新小绥螨采集于中国农业科学院柑桔研究所果园周围的柠 檬树叶上，采集后在室内进行多代不接触农药饲养，对其进行毒力测定，确定其LC50值处于 较低水平，对甲氰菊酯没有明显的抗性。

抗性品系：使用巴氏新小绥螨敏感品系作为抗性筛选的原始材料，在室内 进行接触甲氰菊酯的饲养，经过多代筛选，巴氏新小绥螨对于甲氰菊酯的LC50由35.79mg/L 提高到了22190.91mg/L，其抗性种群较敏感种群增长了619.96倍。此后每隔一段时间视其 种群密度对其进行药剂处理，保证其抗性不会出现衰退。

上述巴氏新小绥螨均为已知材料，且本实验室均有保存，可向公众发放用于验证试验。

1.2试剂

RT reagent Kit为反转录试剂盒(TaKaRa公司，日本)，DNA纯化回收试 剂盒(天根公司，中国)，pMD-19T vector试剂盒(TaKaRa公司，日本)，DH5α感受态细胞 (天根公司，中国)，PCR Master Mix(天根公司，中国)，Trizol(Invitrogen，美国)。

2.方法

2.1巴氏新小绥螨抗性和敏感品系的总RNA提取

对巴氏新小绥螨抗性和敏感品系分别采用Trizol试剂提取总RNA，按照如 下步骤操作：

(1)从饲养箱中使用毛笔挑取1000头巴氏新小绥螨放入离心管中，其中 卵、幼螨、若螨和成螨各250头。向装有样品的离心管中加入液氮，将预冷的研磨棒放入离 心管中快速研磨至粉末，然后加入1ml的Trizol试剂，在室温15-30℃的条件下放置10min， 使核酸蛋白复合物完全分离；

(2)将上述离心管中的上清液转入事先灭菌的无RNase的新的离心管中， 加入200μl的氯仿，注意不要吸入底部沉淀。盖好管盖，充分涡旋混匀15sec，之后4℃条 件下放置10min；

(3)将步骤2中的离心管在12,000rpm4℃离心10min，此时样品分成三 层，吸取上层无色的水相于新的离心管中，记录其体积；

(4)向步骤3中的离心管样品中加入等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)混合溶液，充分涡旋混匀15sec，4℃条件下放置10min；

(5)将步骤4中的离心管在12,000rpm4℃离心10min，取上清至新的离 心管中，记录其体积；

(6)向步骤5中的离心管中加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，充分涡旋 混匀15sec，4℃条件下放置10min；

(7)将步骤6中的离心管在12,000rpm4℃离心5min，取上清至新的离 心管中，记录其体积；

(8)向步骤7中的离心管中加入等体积的异丙醇，充分涡旋混匀15sec，4℃ 条件下放置30min，12,000rpm4℃离心10min后，用10μl枪头吸弃上清；

(9)向步骤8中的离心管中加入1ml DEPC水配制的75％乙醇洗涤沉淀， 用10μl枪头吸弃上清；

(10)重复步骤9后，将离心管放于室温15-30℃晾干5min；

(11)在步骤10中的离心管中加入50μl DEPC水溶解RNA，短暂离心后 分装小份，-20℃保存或-80℃长久保存。

(12)利用紫外分光光度计(Bio-rad)测定RNA溶液的浓度和纯度，用1％ 的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，电泳图谱如图1所示。之后用2100生物分析仪(Agilent 公司，美国)对处理后的RNA进行检测。

2.2cDNA的合成

将前述方法得到的总RNA采用RT reagent Kit反转录试剂盒 反转录成cDNA。方法步骤参照试剂盒说明书进行。反应体系20μL，反应条件：37℃，15min； 85℃，5sec。

2.3巴氏新小绥螨钠离子通道基因克隆

在本实验室巴氏新小绥螨转录组数据库中通过人工查找找到3条与钠离子 通道基因相关的Unigenes，分别是comp28931_c2、comp28931_c3和comp28696_c0。根据这 3条Unigenes设计8对引物对前述的巴氏新小绥螨抗性和敏感品系的钠离子通道基因进行全 长克隆，反应体系为：PCR Master Mix25μL，ddH₂O18μL，正反向引物各2μL，前述步 骤得到的cDNA模板3μL。反应条件：94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，退火30 sec(不同引物对应不同退火温度，见下表)，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延 伸5min。8对引物序列及其退火温度如下：

PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测(120V，电泳缓冲液为1％TAE)，溴化乙锭(EB) 染色，拍照，并对扩增图谱进行比较分析。在紫外灯下切下目的条带，采用DNA纯化回收试 剂盒(天根公司，中国)回收目的片段，将回收的目的片段与PMD19-T载体(Takara公司， 日本)按照摩尔比3：1的量在16℃下连接过夜；连接液转化DH5α感受态细胞(天根公司， 中国)，将转化后的菌体涂布在含Amp+IPTG+X-Gal的LB固体培养基上，过夜培养12-16h， 最后挑取白色单菌落，菌液PCR验证过后送华大测序公司进行测序。

将克隆得到的序列使用DNAMAN5.2.2(Lynon Biosoft)软件进行拼接组装。DNA序列利 用在线网站NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行Blast比对，确认获 得6175bp的巴氏新小绥螨对甲氰菊酯敏感品系和抗性品系的钠离子通道基因全长(分别是 SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)。

实施例2巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记的获得

运用序列比对软件BioXM2.6对巴氏新小绥螨抗性品系和敏感品系中的钠离子通道基因 进行序列比对，比对结果如图2所示，发现A，B，C三个碱基片段上存在突变位点，一共有 5个SNP位点，在第3228位点、第3243位点，敏感品系G碱基突变为抗性品系的A碱基； 在第3844、第4730和第4874三个位点，敏感品系A碱基突变为抗性品系的G碱基。即得到 从第3228位点到4874位点的巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记，该分子标记的核苷 酸序列如SEQ ID No.1所示。

碱基的突变最终导致了氨基酸序列的改变，利用BioXM2.6软件将A，B，C三个碱基片 段翻译成氨基酸片段，发现了三处氨基酸突变，如图3所示，分别是第1282位点处敏感品系 S突变为抗性品系的G，第1577位点处敏感品系H突变为抗性品系的R，第1625位点处敏感 品系的E突变为抗性品系的G。

实施例3：巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗敏性专用检测引物的获得

1.引物设计：选取目标基因3228位点上游附近和4874位点下游附近的核苷酸序列，运 用Primer Premier5.0引物设计软件，设计出能够快速克隆出包含全部突变区域的1754bp 碱基的特异性正反性引物，引物序列如下：

F：5’-CAACCTTTCACAGGCCAATC-3’；R：5’-TTGCGTTGTAATACTTCTTCTG-3’。

2.引物验证：在中国农科院柑桔研究所柑橘苗圃中采集待测巴氏新小绥螨 样本，按实施例1中的方法获得cDNA，按照如下反应体系进行PCR扩增：PCR Master Mix25 μL，ddH₂O18μL，上述特异性正反性引物各2μL，待测样本cDNA模板3μL。PCR反应条 件：94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，共 35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，如图4所示， 条带位于1700bp左右，进行TA克隆：采用DNA纯化回收试剂盒(天根公司，中国)回收目 的片段，将回收的目的片段与PMD19-T载体(Takara公司，日本)按照摩尔比3：1的量在16 ℃下连接过夜；连接液转化DH5α感受态细胞(天根公司，中国)，将转化后的菌体涂布在含 Amp+IPTG+X-Gal的LB固体培养基上，过夜培养12-16h，最后挑取白色单菌落，菌液PCR验 证过后送华大测序公司进行测序。将测序结果与抗敏品系钠离子通道基因序列比对，得出该 田间检测样本为巴氏新小绥螨对甲氰菊酯的敏感品系。

实施例4：待测巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗敏性的检测

1.按照实施例1中的方法,获得待测巴氏新小绥螨的总RNA，反转录为cDNA。

2.利用实施例3中的特异性正反向引物，按照实施例3中的方法，进行PCR 扩增，回收目的片段进行克隆，然后进行测序，将测序结果与与抗敏品系钠离子通道基因序 列比对，即可得出该田间检测样本是甲氰菊酯的敏感品系还是抗性品系。