H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR引物、探针及其检测试剂盒和检测方法

摘要

本发明公开了一种H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR引物及其检测试剂盒和检测方法。本发明检测试剂盒含有特异性引物和探针，通过反应体系和条件的优化，一次试验可同时特异性地检测H7N9HA基因和NA基因，具有很好的特异性、敏感性和重复性；可特异性地检测H7N9，与AIVH1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H6N2、H9N2亚型及NDVLasota等病毒的不发生交叉反应；检测限达1.22pg/μL；重复性较好，批间CV值小于5%；与常规的荧光RT-PCR相比，本发明检测仅耗时3h，且费用低廉；本发明的检测方法是H7N9亚型禽流感病毒快速初筛及初步确认定型的良好方法。

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测领域，涉及一种H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR引物、探针及其检测试剂盒和检测方法。 

背景技术

禽流感是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)引起的禽类急性传染病，其发病率和死亡率极高，是危害禽类的主要烈性传染病之一，世界动物卫生组织(OIE)将所有高致病性禽流感列为法定通报性疾病，部分低致病性禽流感也属于法定通报性疾病，OIE成员一旦发现或怀疑发生通报性疾病时应立即向OIE中央局报告，并由OIE中央局向所有成员通报。禽流感病毒属于正粘病毒科A型流感病毒属，为单股负链RNA，多形态的有囊膜病毒，根据A型流感病毒的血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)表面抗原的不同，可进行亚型分类。目前已知A型流感病毒有16种HA亚型(H1～H16)和9种NA亚型(N1～N9)。 

2013年，中国在全世界范围内首次爆发H7N9亚型禽流感病毒感染人类疫情，这表明禽流感病毒已突破种间屏障，感染人类致病，甚至死亡。流行病学调查结果显示，虽然人感染H7N9亚型禽流感病毒后死率较高，H7N9亚型禽流感病毒引起急性呼吸道传染病，并已致多人死亡，但目前还没有相应的保护性疫苗可供使用。为了应对H7N9亚型禽流感疫情，提高对H7N9亚型禽流感疫情的防控能力，疾病防控机构迫切需要快速、有效的H7N9亚型禽流感病毒检测方法，因此建立快速、敏感、准确的H7N9亚型禽流感病毒检测方法具有十分重要和紧迫的意义。 

近年来，实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)技术在病毒检测领域得到了广泛的应用，它将普通RT-PCR技术与荧光定量检测技术相结合，不仅具有敏感性高、特异性强、重复性好等优点，而且通过分析软件对数据进行分析整理，结果更为准确直观，整个检测过程不需要打开试管，有效地减少了假阳性发生的机会，已成为病原体检测的重要方法。 

文献检索表明，目前国内外诊断H7N9亚型禽流感病毒的方法仍然是病毒分离、血清学试验和普通RT-PCR、单重荧光RT-PCR等，一次试验完成禽流感病毒H7亚型和N9亚型初步确认的双重荧光RT-PCR检测技术尚属空白。经典的病毒分离、血清学诊断方法费时费力， 不适于临床检测，不符合生物安全条例的要求，无法满足快速检测的要求。普通PCR不仅无法对病料样本中的病毒进行定量检测，且扩增反应后需要电泳检测，不仅不适于大批量样本的筛选，而且容易因操作污染造成假阳性。单重荧光RT-PCR，仅能对禽流感H7亚型或N9亚型进行检测。 

发明内容

为了解决上述技术难题，本发明通过大量实验研究筛选出高灵敏和高特异性的引物序列和检测探针，及特定的双重荧光RT-PCR反应程序和条件，针对2013年我国爆发H7N9亚型禽流感病毒变异株，构建了高敏感、高特异性的H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测试剂盒及检测方法，发明H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法及试剂盒，一次实验即可检测H7亚型和N9亚型禽流感病毒，具有快速、敏感性高、特异性强、重复性好等优点。 

本发明的目的在于提供一种H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测试剂盒。 

本发明的另一目的在于提供一种H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法。 

本发明所采取的技术方案是： 

H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR引物，其序列为： 

HA-F：5’-TGATGACTGTATGGCCAGTATTAGAAA-3’(SEQ ID NO：1)， 

HA-R：5’-TTGCATTGCCTCTTCCCTGTA-3’(SEQ ID NO：2)， 

NA-F：5’-AATCAGAGGGAAACACTCAAACG-3’(SEQ ID NO：3)， 

NA-R：5’-GCTTATCAGGGCGCGATACT-3’(SEQ ID NO：4)； 

或者为该些序列的核苷酸互补序列。 

一种H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。 

进一步的，上述试剂盒还含有RT-PCR检测探针，其序列如下所示： 

HA-P：5’-AACACCTATGATCACAGCAA-3’(SEQ ID NO：5)， 

NA-P：5’-AACAATACACGATAGGTCC-3’(SEQ ID NO：6)； 

或者为该些序列的核苷酸互补序列。 

进一步的，上述试剂盒还含有RT-PCR反应液、酶液、ROX染料、阳性对照品和阴性对照品。 

H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法，包括以下步骤： 

1)提取病毒RNA； 

2)RT-PCR反应体系： 

3)RT-PCR反应程序： 

4)结果分析：根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和CT值判定结果，当阴性对照的检测结果无数值或Ct值＞30，阳性对照的Ct值≤28.0时，Ct值≤30.0的样本判为阳性，Ct值无数值或Ct值＞30的样本判为阴性。 

本发明的有益效果是： 

1)核酸提取需要60min左右，一步法实时荧光RT-PCR需要120min左右，因此从收到样品到得到检验结果的时间仅为3h，大大节省了检测时间。 

2)对10⁷拷贝的模板在三个不同时间进行检测，每次做10个重复。统计结果显示，三 次检测结果之间的变异系数(CV)值都小于5％，三次检测所得的Ct值之间无统计学差异，该方法具有良好的重复性。 

3)污染的避免：反应混合物的配制中加入了足够进行反转录和扩增的探针和引物，因此本方法采用一步法反转录闭管检测荧光技术，避免了普通PCR方法因交叉污染而产生假阳性的缺陷，并可防止病毒扩散污染环境，减少了溴化乙锭对操作人员的危害。 

4)检测成本：商品化H7N9实时荧光RT-PCR试剂盒价格较高。除荧光PCR仪的成本外，每份样品检测的试剂成本就高达100元人民币左右，难以适应中国国情在全国普及和推广。本研究所使用的德国公司产品Multiplex RT-PCR目前的价格是20元/头份，合成5OD探针和引物仅需1400元，每份样品探针、引物的费用为6元，因此本试剂盒每份样品检测的试剂成本仅为30元人民币左右，初略估算本方法的试剂成本仅为商品化的荧光RT-PCR试剂盒的三分之一，检测成本低廉，可大幅度节省检测费用，非常适合在全国推广和普及。 

5)本发明建立的H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR方法具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉，一次试验即可完成H7N9亚型禽流感病毒HA基因和NA基因的检测等优点。是H7N9亚型禽流感病毒快速初筛及初步确认定型的良好方法。 

附图说明

图1为RT-PCR电泳检测图； 

图2为H7N9亚型AIV双重荧光RT-P CR检测结果； 

图3为H7N9亚型AIV双重荧光RT-PCR特异性试验图，图中H7N9(49)、H7N9(134)、H7N9(637)分别表示编号为49、134、637的H7N9； 

图4为阳性质粒稀释敏感性试验； 

图5为病毒稀释敏感性试验； 

图6为H7N9亚型AIV双重荧光RT-PCR标准曲线图。 

具体实施方式

实施例1：H7N9亚型AIV双重荧光RT-PCR检测试剂盒 

1材料 

1.1病毒核酸 

AIV H7N9亚型3株(毒株编号分别为49、134、637)、H1N2亚型、H2N2亚型、H3N2亚型、H5N1亚型、H6N2亚型、H9N2亚型AIV及NDV Lasota核酸由华南农亚大学禽病室赠送。 

1.2质粒、菌株和培养基 

pMD 18-TVector、工程菌JM109为宝生物工程(大连)有限公司产品。 

含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基：蛋白胨(OXOID公司产品)10g，酵母提取物(OXOID公司产品)5g，NaCl10g，加800mL蒸馏水，用5mol/L NaOH调pH至7.4，定容至1000mL，高压灭菌后冷却至50℃左右时，加入氨苄青霉素至终浓度为100μg/mL，混匀，4℃保存备用。 

1.3RNA提取试剂 

总RNA纯化试剂(Trizol)为美国Invitrogen公司产品。 

1.4DEPC处理水 

取超纯水加入0.1％DEPC(美国ACROS ORGANICS公司产品)，分装小管，37℃保温过夜，121℃高压20min，-20℃保存。 

1.5缓冲液 

TE缓冲液：10mmol/LTris-Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。 

PBS溶液(pH7.2)：NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O1.92g，KH₂PO₄0.24g，加水至1L。 

改良50×TAE：242g Tris，57.1mL冰乙酸，10mL0.5mol/L EDTA(pH8.0)，加双蒸水至1000mL，工作液1×。 

电泳上样缓冲液(6×)：0.2％溴酚蓝，50％蔗糖。 

1.6主要仪器 

Applied Biosystems ViiA 7 Real-TimePCR System为美国ABI公司产品。Multimage II凝胶成像及分析系统为美国Alpha Imager HP公司产品。Sigma3-18K小型高速冰冻台式离心机为德国Sartorius公司产品。DNA Engine DYAD MJ Research PTC-200核酸扩增仪为美国Bio-Rad公司产品。NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer紫外分光光度计为美国NanoDrop Technologies公司产品。 

2建立H7N9亚型AIV双重荧光RT-PCR检测试剂盒 

2.1引物和探针的设计和筛选 

Tagman探针所选序列是高度特异、具有最小二级结构的扩增片段。在设计过程中进行BLAST和类似的分析，以确保特异性，如果扩增片段的二级结构不能避免，则引物的退火温度要相应提高，Tm值在68～70℃之间。探针的设计应在设计引物之前，然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。扩增片断越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容 易保证分析的一致性。如果是目测探针，则要仔细审查GC富含区，探针的5’端的碱基G会有淬灭作用，即使被切割下来淬灭作用还会存在，因此应选择C多于G的链作探针，G的含量多于C会降低反应效率。另外，探针应尽可能的短，不要超过30个bp。在60℃温度下Tag酶5’核酸外切酶的活性最高，因此试验退火温度一般都为60℃，引物的Tm值应在58～60℃之间。引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。 

根据上述设计原则，本研究根据GeneBank中公布的H7N9亚型AIV HA基因、NA基因序列，与AIV H5、AIV H9、AIV H6、AIV H1、AIV H2、AIV H3等禽流感毒株的序列进行比对，寻找高度保守的区域，选取适当的HA基因、NA基因相关序列，设计多套特异性检测H7N9亚型AIV的引物及Tagman荧光探针，由大连宝生物技术有限公司合成，合成好的探针和引物用DEPC处理水分别稀释至终浓度10pM和20pM，分装后置-80℃避光保存。 

以H7N9 AIV核酸为模板，分别对上述设计的多套引物和探针进行双重荧光RT-PCR试验和筛选，试验结果表明：编号为70的引物、探针(见表1)可以很好的检测H7N9亚型AIV的HA基因，编号为64的引物、探针(见表1)可以很好的检测H7N9亚型AIV的NA基因，这2套引物、探针(见表1)搭配进行H7N9亚型AIV双重荧光RT-PCR检测其敏感性、特异性、荧光强度、CT值最佳。 

表1 H7N9亚型AIV双重荧光RT-PCR引物、探针 

2.2H7N9亚型AIV双重荧光RT-PCR检测试剂盒 

H7N9亚型AIV双重荧光RT-PCR检测试剂盒有以下成份： 

1)引物，其序列为： 

HA-F：5’-TGATGACTGTATGGCCAGTATTAGAAA-3’(SEQ ID NO：1)， 

HA-R：5’-TTGCATTGCCTCTTCCCTGTA-3’(SEQ ID NO：2)， 

NA-F：5’-AATCAGAGGGAAACACTCAAACG-3’(SEQ ID NO：3)， 

NA-R：5’-GCTTATCAGGGCGCGATACT-3’(SEQ ID NO：4)。 

2)探针： 

HA-P：Fam-5’-AACACCTATGATCACAGCAA-3’-Eclipse(SEQ ID NO：5)， 

NA-P：Hex-5’-AACAATACACGATAGGTCC-3’-Eclipse(SEQ ID NO：6)。 

3)RT-PCR反应液： 

含有dNTP、Tris-HCl(pH8.0)、KCl、(NH₄)SO₄、MgCl₂。 

4)酶液 

反转录酶Reverse Transcriptase XL(简称AMV)、DNA聚合酶(Taq酶)。 

5)ROX染料 

6)阳性对照品 

阳性对照品为含基因HA的重组质粒和含基因NA的重组质粒。 

阳性对品的制备具体为： 

流感病毒为RNA病毒，如果用病毒作为阳性对照抽提RNA，RNA极不稳定，容易裂解，在日常检验中容易造成环境污染和病毒扩散，生物安全的风险非常高，不符合生物安全管理的相关规定。本研究成功构建了扩增目的片段阳性对照---重组质粒pMD-HA和pMD-NA，测序结果证实为扩增特异性相关目的片段。抽提质粒后按一定浓度进行稀释作为阳性对照，为避免阳性对照Ct值太高，造成样品之间的污染，Ct值控制在18～25之间，实际检测中应用方便、避免了生物安全风险。 

将需扩增的H7N9亚型AIV HA基因及NA基因的目的基因序列送宝生物工程(大连)有限公司，进行全基因合成，制备目的片段重组质粒pMD-HA和pMD-NA，在含Amp的LB细菌培养液中进行培养，收获菌液，抽提质粒作为阳性对照。 

7)阴性对照品 

无菌抽取未接种任何病原体的正常SPF胚的尿囊液作为阴性对照。 

实施例2：H7N9亚型AIV双重荧光RT-PCR检测方法 

1.材料：同实施例1。 

2.H7N9亚型AIV双重荧光RT-PCR反应体系的建立与优化 

2.1引物和探针浓度的优化 

将PCR反应中的引物和探针浓度从0.1μmol/L至1μmol/L以0.05μmol/L递增，采用矩阵法进行对比试验，对比试验的其它条件完全一致。 

实验结果显示各引物的体积(浓度)为1μL(20pmol/μL)较为合适，探针体积(浓度)为0.5μL(10pmol/μL)较合适，因此每条引物选择1μL(20pmol/μL)的体积(浓度)，探针HA-P 和NA-P选择0.5μL(10pmol/μL)的体积(浓度)，作为AIV H7N9双重荧光RT-PCR检测方法的引物和探针浓度。 

2.2最佳退火温度和PCR循环数的确定 

为了提高荧光RT-PCR反应的灵敏度和特异性，根据设计的引物退火温度，以51℃为基础，以0.5℃递加，直到55℃。将阳性质粒DNA模板采用极限梯度稀释法进行PCR实验，采用循环次数为35、40和45。 

实验结果显示54℃作为退火温度较为合适，扩增循环数45个循环即可达到检测的极限。 

2.3优化后的H7N9亚型AIV双重荧光RT-PCR检测方法 

利实施例1建立的RT-PCR检测试剂盒进行H7N9亚型AIV的双重荧光RT-PCR检测，检测方法包括以下步骤： 

(1)病毒RNA提取 

1)取n个灭菌的1.5mLEppendorf管，分别加入被检样品、阳性对照与阴性对照样品(阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出)，并编号。 

2)每管加入600μL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL，再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀)。于4℃、12000r/min离心15min。 

3)取与1)相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管，加入400μL异丙醇(-20℃预冷)，做标记。吸取本标准2)各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μL，不能吸出中间层，颠倒混匀。 

4)于4℃、12000r/min离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600μL75％乙醇，颠倒洗涤。 

5)于4℃、12000r/min离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。 

6)4000r/min离心10s(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥5～10min。 

7)加入11μL DEPC水，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。若需长期保存须放置-70℃冰箱。 

(2)RT-PCR反应体系和反应程序 

经优化，确定了同时检测H7N9亚型AIV HA基因及NA基因的双重荧光RT-PCR检测 的最佳反应体系及反应参数，反应总体积25μl，各组分及浓度见表2，反应程序见表3。据此可在同一个反应管中一次试验完成H7N9亚型AIV HA基因及NA基因的荧光RT-PCR检测。 

表2 荧光RT-PCR反应体系的组份及浓度 

表3 实时荧光RT-PCR反应程序 

荧光素设定：Report Dye设定，HA为FAM、NA为Hex；Quench Dye均设定为Eclipse；Reference dye设定为ROX。 

下而对实施例中所述的H7N9亚型AIV的双重荧光RT-PCR检测试剂盒及其检测方法作 进一步的效果检测。 

一、电泳检测 

(1)病毒RNA提取：提取编号为49、134、637的H7N9亚型AIV毒株的RNA，提取方法见实施例2。 

(2)RT-PCR扩增 

以提取的病毒RNA为模板，进行一步法RT-PCR。 

RT-PCR反应体系： 

RT-PCR反应程序： 

(3)电泳检测 

电泳检测RT-PCR扩增的结果，电泳结果如图1所示，其中1、2、3分为引物NA-F和 NA-R扩增编号为49、134和637的H7N9；4、5、6分为引物HA-F和HA-R扩增编号为49、134和637的H7N9；M：DNA Marker DL-2000；N：阴性对照。从图1中可以看出引物NA-F和NA-R均可从3种编号的H7N9中扩增出约为64 bp的目的条带，与预期大小相符；引物HA-F和HA-R均可从3种编号的H7N9中扩增出约为70 bp的目的条带，与预期大小相符，可说明上述实施例所述的检测试剂盒和检测方法可用于对H7N9的检测。 

(4)测序验证 

切胶回收纯化上述RT-PCR产物，并进行测序，对测序结果进行分析后表明：扩增目的片段的长度分别为64bp和70bp，与引物设计时的预计扩增长度相符。将序列提交NCBI BLAST Server进行检索，检索结果显示：本试验所扩增的片段分别与GenBank中H7N9亚型AIV HA基因和NA基因相应片段同源性最高(见表4～6)，说明本发明所筛选的特异性引物可以很好地用于对H7N9亚型AIV的检测，特异性好。 

表4 HA基因荧光RT-PCR扩增产物核苷酸序列Blastn检索结果(毒株编号49、134、637) 

表5 NA基因荧光RT-PCR扩增产物核苷酸序列Blastn检索结果(毒株编号49) 

表6 NA基因荧光RT-PCR扩增产物核苷酸序列Blastn检索结果(毒株编号134、637) 

二、H7N9亚型AIV的双重荧光RT-PCR检测 

利用实施例1所述的检测试剂盒进行H7N9亚型AIV的双重荧光RT-PCR检测，包括以下步骤： 

(1)病毒RNA提取：提取待检测样品中的病毒RNA，方法同实施例2所述。 

(2)荧光RT-PCR反应体系 

(3)荧光RT-PCR反应程序 

荧光素设定：Report Dye设定，HA为FAM、NA为Hex；Quench Dye均设定为Eclipse；Reference dye设定为ROX。 

(4)结果与分析： 

以ABI荧光PCR仪为例，检测结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值(，通过收集的荧光曲线和CT值判定结果；当阴性对照的检测结果无数值或Ct值＞30，阳性对照的Ct值≤28.0时，Ct值≤30.0的样本判为阳性，Ct值无数值或Ct值＞30的样本判为阴性。 

检测结果如图2所示，从图中可以看出，阴性对照品无荧光值，而阳性对照品和待检测样本中对基因HA和NA的检测均出现了明显的“S”型荧光曲线，说明待检测样本为H7N9亚型AIV阳性。 

另外，用analysis功能框观察结果，本研究设计的探针具有较强的荧光信号，探针HA-P检测H7N9亚型AIVHA基因荧光值≥800,000，探针NA-P检测H7N9亚型AIVNA基因荧光值≥900,000(图2)，说明本发明的设计和筛选出的特异性探针具有很好的检测效果，灵敏度高。 

三、特异性实验 

按实施例2所述的检测方法，分别提取H7N9(毒株编号分别为49、134、637)、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H6N2、H9N2亚型AIV及NDVLasota的核酸，并进行双重荧光RT-PCR检测，同时设阳性对照(重组质粒pMD-HA、pMD-NA)和阴性对照。 

检测结果如图3和表7所示，从中可以看出编号引物HA-F、HA-R和探针HA-P检测编号为49、134、637的H7N9亚型AIV和阳性对照(重组质粒pMD-HA)时均有荧光增加信号曲线，而H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H6N2、H9N2亚型AIV及NDV Lasota和阴性对照均未观察到荧光信号增加曲线。 

引物HA-F、HA-R和探针HA-P检测编号为49、134、637的H7N9亚型AIV和阳性对照(重组质粒pMD-NA)均有荧光增加信号曲线，而H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H6N2、H9N2亚型AIV及NDV Lasota和阴性对照均未观察到荧光信号增加曲线(图3和表7)。 

表7 H7N9亚型AIV双重荧光RT-PCR特异性实验 

注：“-”表示无，“+”表示有。 

试验结果表明，本发明建立的H7N9亚型AIV双重荧光RT-PCR检测方法具有良好的特异性，可准确、特异地检测H7N9亚型AIV，而对H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H6N2、H9N2亚型AIV及NDV Lasota检测均为阴性，说明本发明的检测结果不受临床其他常见的病毒的干扰，具有很好的特异性和准确性。 

四、敏感性实验 

(1)阳性质粒稀释敏感性试验 

提取阳性质粒，经测定浓度为1.22×10⁴ng/μL，然后进行10倍梯度稀释至10^-10，对梯度稀释的样本进行双重荧光RT-PCR检测。 

检测结果如图4所示，从中可以看出，本方法可以检测到阳性质粒的10^-8稀释倍数，经换算为1.22pg/μL，即本发明的检测试剂盒和检测方法的检测限可达1.22pg/μL。 

(2)病毒稀释敏感性试验 

取编号为49的H7N9亚型AIV，血凝效价为log₂8，经灭活处理的H7N9亚型AIV作10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10倍稀释，分别提取各浓度病毒稀释液RNA，配制反应混合物后进行双重荧光RT-PCR，同时设阳性对照(重组质粒pMD-HA、pMD-NA)和阴性对照，对梯度稀释的样本进行荧光PCR检测。 

检测结果如图5所示，从中可以看出，本方法可以检测经灭活处理的H7N9亚型AIV(毒株编号49，血凝价log₂8)的最低稀释度为10^-8。 

上述实验结果表明，本发明的检测血凝效价为log₂8的H7N9亚型AIV的最低稀释度为10^-8，检测阳性质粒的极限为1.22pg/μL，具有很好的敏感性。荧光检测的灵敏度显著高于肉眼观察电泳条带的灵敏度，因此用荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，能获得较高的检测精度，另外由于本方法在正式PCR循环(收集荧光)之前设置了5个低温(退火温度为45℃)PCR循环(反应参数为92℃10s，45℃30s，72℃60s)，使得模板在较低的退火温度下得到了大量的扩增，因此大大提高了本发明方法的敏感性。 

五、重复性和稳定性试验 

按表2配制反应体系(不加酶液和模板)，置-20℃保存。用10⁷拷贝的阳性定量模板分三次实验进行稳定性和重复性检测，实验时取出-20℃保存的检测反应体系，加入反转录酶和模板。稳定性检测每次间隔1周，每次进行10个重复试验。结束后观察标准模板的Ct值，并将三次结果进行比较。 

检测结果和稳定性分析如表8所示，从表8中可以看出H7N9亚型AIV双重荧光RT-PCR检测方法对三份样本的重复性检测，三次检测结果之间的变异系数(CV)值都小于5％，三次检测所得的Ct值之间无统计学差异，说明本发明检测试剂盒和检测方法具有很好的重复性。 

表8 H7N9亚型AIV双重荧光RT-PCR重复性实验 

六、TaqMan PCR标准曲线的制作 

在制作标准曲线时使用DEPC处理水对含有目的扩增片段的质粒标准品作系列稀释，使拷贝数分别为10⁶copies/μL，10⁵copies/μL，10⁴copies/μL，10³copies/μL，10²copies/μL，进行荧光定量PCR扩增，分别加入不同的反应管在ABI ViiA 7扩增仪上同时进行荧光RT-PCR，反应结束后在计算机上得到标准曲线。检测临界点为扩增信号进入相对稳定对数增长的下限(阈值T)的PCR循环数，在这一区间内CT与起始模板量的对数呈反比关系，根据系列模板的浓度对数与CT值做直线回归得到标准曲线。 

将检测定在产物大量生成初期，即刚进入指数增长期的起始点位置--循环阈值(CT)，经对数拟合做图，得到定量标准曲线(见图6)，显示不同浓度标准品的Ct值与该标准品浓度的对数存在线性关系(X轴为模板量的对数值，CT值为Y轴作回归曲线，从标准曲线图中可得：标准曲线的统计学分析相关系数R2为0.975，线性关系较好，斜率为-3.7，符合实时定量PCR的要求，根据未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的DNA拷贝数。 

<110>  中华人民共和国珠海出入境检验检疫局

 

<120>  H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR引物、探针及其检测试剂盒和检测方法

      

 

<130> 

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  1

tgatgactgt atggccagta ttagaaa                                           27

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  2

ttgcattgcc tcttccctgt a                                                 21

 

 

<210>  3

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  3

aatcagaggg aaacactcaa acg                                               23

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  4

gcttatcagg gcgcgatact                                                   20

 

 

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工探针

 

<400>  5

aacacctatg atcacagcaa                                                   20

 

 

<210>  6

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工探针

 

<400>  6

aacaatacac gataggtcc                                                    19