一种利用薄片培养技术获得白姜花四倍体植株的方法

摘要

本发明公开一种利用薄片培养技术获得白姜花四倍体植株的方法。该方法从试管苗茎段切取薄片，对薄片用秋水仙素进行处理，然后采用薄片培养技术对处理后的薄片进行不定芽诱导，获得再生植株；通过对再生植株进行检测，筛选获得四倍体植株。本发明中进行诱导突变时，所用的外植体为薄片，厚度只有0.3～0.5mm，细胞数目少，在用秋水仙素进行处理时，可使外植体的细胞充分暴露于药液中，所获得的植株绝大多数为纯合体，简化了多倍体植株的筛选过程；所用的染色体数目分析技术，具有操作简单、所需时间短，获得的染色体图像清晰等优点。本发明的方法具有操作简单、植株再生频率高、再生周期短、取材容易的优点，操作性强，易于普及和推广。

说明书

技术领域

本发明属于姜科(Zingiberaceae)姜花属(Hedychium)白姜花(Hedychium  coronarium)育种技术领域，特别涉及一种利用薄片培养技术获得白姜花四倍体 植株的方法。通过薄片培养技术建立白姜花的快繁培养体系，并利用所建立的 快繁培养体系，结合秋水仙素处理，能够快速获得白姜花多倍体植株，从而实 现对白姜花品种进行改良、获得新品种的目的。

背景技术

白姜花为姜科姜花属、多年生根茎状草本花卉植物，因其色彩艳丽且气味 芬芳，主要用作香型鲜切花、庭院绿化和园林景观植物，为广受亲睐的庭园芳 香花卉，市场需求量巨大。此外，白姜花还是一种很好的芳香调味植株，其植 株中含有沉香醇，金合欢烯等多种芳香化合物，可以提取芳香油，用作高档香 精。

但目前白姜花的大规模应用上还存在许多问题，例如鲜切花瓶插期短(2～ 3天)、提取有效药用成分效率低下，植株分蘖系数低下，繁殖速度缓慢等。白 姜花在广州少育或不育限制了通过人工有性杂交的方法获得新品种，通过生物 技术有望实现问题的解决。

多倍体育种(polyploid breeding)技术是利用人工诱变或自然变异筛选等途 径获得多倍体材料，用以选育多倍体新品种的技术。多倍体植株通常具有花冠 大而厚实，香味更浓厚，花期变长、茎变粗壮，耐倒伏，叶片变宽厚，光合作 用增强等特点，已通过人工诱导多倍体手段育成一批具有较高观赏价值的花卉 品种。

在进行植物多倍体育种过程中，常用秋水仙素进行化学诱变处理。其诱导 染色体加倍主要有活体处理加倍法和离体处理加倍法。活体处理所获得的植株 多为嵌合体，受环境干扰大，往往不能稳定遗传，极易回复为原来的染色体倍 数。离体加倍时常采用茎尖、顶芽、腋芽、丛生芽、离体叶片等作为外植体诱 导材料，所获得的变异植株很多也是嵌合体，还存在着变异率低下、倍性不稳 定等现象，从而必须进行大量的筛选工作。这些成为限制通过诱导突变进行多 倍体育种的主要因素。因此，建立合适的植株再生体系是降低嵌合体发生的前 提条件，是采用多倍体诱变育种时需要解决的一个重要的瓶颈问题。

目前报道的白姜花离体植株再生体系主要是采用成熟种子的无菌苗的下胚 轴作为外植体，或者采用不定芽诱导丛芽繁殖并再生完整植株，还没有白姜花 薄片培养技术和多倍体植株诱导成功的报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种利用薄片培 养技术获得白姜花四倍体植株的方法。该方法从试管苗茎段切取薄片，对薄片 用秋水仙素进行处理，然后采用薄片培养技术对处理后的薄片进行不定芽诱导， 获得再生植株。通过对再生植株进行检测，筛选获得四倍体植株。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用薄片培养技术获得白姜花 四倍体植株的方法，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒和不定芽的诱导：以白姜花的根状茎萌发的芽为外植体， 接种于芽诱导培养基A中进行培养，诱导出不定芽；

(2)不定芽成苗：将步骤(1)诱导的不定芽转入成苗培养基中进行培养， 得到健壮的试管苗；

(3)试管苗的扩繁：取步骤(2)得到的试管苗，从其基部切取薄片，接 种在芽诱导培养基B中进行培养，得到健壮的不定芽；将不定芽转入成苗培养 基中进行培养，得到试管苗；

(4)根据需要重复步骤(3)，直到获得足够的试管苗；

(5)四倍体植株的诱导：取步骤(3)或(4)得到的试管苗，从其基部切 取薄片，用秋水仙素溶液进行浸泡处理；将处理后的薄片接种在芽诱导培养基B 中进行培养，得到不定芽；将不定芽转移到成苗培养基上培养，得到诱变处理 后的试管苗；

(6)将步骤(5)中得到的试管苗进行驯化，移栽到装有营养土的花盆， 得到诱变的白姜花再生植株；

(7)将步骤(6)所获得的诱变的白姜花再生植株与原种二倍体植株苗期 进行对比，将叶片变宽大，颜色浓绿，叶脉凸显，叶片微下垂生长，气孔变大， 气孔密度变小的植株选为候选植株；

(8)取步骤(7)中获得的候选植株的根尖，进行染色体数目分析，选取 染色体数目为2n＝4x＝68的幼苗，即获得白姜花四倍体植株；

(9)对步骤(8)所获得的四倍体植株进行田间观察，选取花器官明显变 大、植株生长具有明显优势的植株，确定为具有优良农业性状的白姜花四倍体 植株。

步骤(1)中：

所述的白姜花的根状茎萌发的芽优选采用以下方法进行前处理：取白姜花 的根状茎萌发的芽，用水冲洗干净后用洗洁精泡25～30分钟，再用水冲洗25～ 30分钟，用70～75wt％酒精进行表面消毒60～90秒，最后用0.1wt％升汞消 毒15～20分钟，切取长0.5～2.0cm的芽作为外植体；

所述的芽诱导培养基A优选为MS培养基+(3～6)mg·L^-16-BA+(0.1～ 0.2)mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

所述的芽诱导培养基A更优选为MS培养基+5mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

所述的培养的时间优选为20～40天；

步骤(2)中：

所述的成苗培养基优选为1/2MS培养基+(0.5～1)g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

所述的成苗培养基更优选为1/2MS培养基+1g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖 +7g·L^-1琼脂；

所述的培养的时间优选为15～45天；

步骤(3)中：

所述的芽诱导培养基B优选为MS培养基+(1～5)mg·L^-16-BA或(0.05～ 0.2)mg·L^-1TDZ+(0.1～0.2)mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

所述的芽诱导培养基B更优选为MS培养基+3mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

步骤(3)中，所述的不定芽长为1～2cm；所述的成苗培养基同步骤(2) 中的成苗培养基；

所述的试管苗为不定芽转移到成苗培养基上获得的高6cm以上的植株；所 述的薄片的厚度优选为0.3～0.5mm；

步骤(5)中，所述的秋水仙素溶液优选为MS培养基+(0.2～0.8)wt％秋 水仙素+1％(v/v)DMSO(二甲基亚砜)；所述的浸泡处理的时间优选为12～ 36h；

更优选，所述的秋水仙素溶液为MS培养基+0.6wt％秋水仙素+1％(v/v) DMSO(二甲基亚砜)；所述的浸泡处理的时间为24h；

所述的在芽诱导培养基B中进行培养的时间优选为20～40天；

所述的转移到成苗培养基上培养的时间优选为15～45天；

步骤(1)、(2)、(3)、(5)的所述的培养基的pH为5.6～5.9，除TDZ采 用过滤灭菌后加入到高温高压灭菌的培养基外，其余的培养基均采用高温高压 灭菌(121℃、1.06kg/cm²下灭菌15min)；

步骤(1)、(2)、(3)、(5)的所述的培养的条件均在26～28℃、30μmol·m^-2s^-1光强(白色荧光灯)、16L/8D光照条件下进行；

步骤(6)中，所述的驯化的时间优选为3～7天；

所述的营养土优选为富含有机质的土壤，如从花卉市场购买的用于花卉栽 培的有机土、靓土；

所述的土壤优选采用浓度为1/20MS培养基的无机盐溶液一次浇透，整个过 程不再施肥，视土壤的干湿情况适当补充水分；

步骤(6)中，将步骤(5)中得到的试管苗移栽到花盆后，应适当遮阴， 并保持土壤湿润，培养一个月待植株成活后即可转入正常的栽培管理；

步骤(7)中：

所述的气孔大小和密度测定方法为：选取发育程度一致的二倍体植株和秋 水仙素处理后获得的植株，取节位一致的叶片，从叶片相同部位，撕取下表皮， 置于载玻片上，制作临时装片，于显微镜下测量气孔的长度和密度；

所述的叶片大小的测定方法：选取发育程度一致的二倍体植株和秋水仙素 处理后获得的植株，取叶片节位相同的叶片，测定叶长(叶基部至叶尖长)和 叶宽(叶片最宽的部位)；

步骤(8)中所述的染色体数目分析方法：选取二倍体植株和经过秋水仙素 处理获得的候选植株，实验前一天17：00点浇足水，次日早上9：00点到10： 00点，取根部白嫩粗壮的根尖，采用“解离-低渗-染色-压片-观察”方法进行染 色体数目分析；具体步骤如下：用解剖刀刮去根尖表皮，浸泡于解离液(37％HCl： 95％C₂H₅OH＝1:3～1:5，体积比)中，常温下解离5～8min；取出根尖，用蒸 馏水冲洗3～4遍，再放到蒸馏水中低渗25～30min；取少量分生区材料用解剖 针拨散，滴加苯酚品红染液染色3～5min；盖上盖玻片，吸掉多余的染液，再 用滤纸盖在盖玻片上，用铅笔橡皮头隔着滤纸沿对角线轻轻敲击盖片，使材料 成分分散均匀；将压好的片子置于显微镜下观察，鉴定染色体数目；观察的细 胞数不少于30个，分裂细胞中85％以上为恒定一致的染色体数即为该植物的染 色体数；

所述的解离液优选为体积比37％HCl：95％C₂H₅OH＝1:3；所述的解离的时 间优选为6min；其中，37％HCl是指质量分数为37％的HCl；95％C₂H₅OH是 指体积百分数为95％的C₂H₅OH；

步骤(9)中所述的花器官的大小的测定，采用唇瓣、翼瓣的长度和宽度(最 宽)、雄蕊的花丝、花药的长度进行测量；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明利用薄片培养技术建立的白姜花植株再生体系，具有操作简单、 植株再生频率高、再生周期短、取材容易的优点，采用此技术，进行白姜花多 倍体的诱导，操作性强，易于普及和推广。

(2)进行诱导突变时，所用的外植体为薄片，厚度只有0.3～0.5mm，细 胞数目少，在用秋水仙素进行处理时，可以使外植体的细胞充分暴露于药液中， 所获得的植株绝大多数为纯合体，简化了多倍体植株的筛选过程。

(3)本发明中所采用的染色体数目分析技术，具有操作简单、所需时间短， 获得的染色体图像清晰等优点，解决了利用染色体数目进行植株倍性检测的耗 时耗力的难题。

附图说明

图1为实施例1利用薄片培养技术建立白姜花植株再生体系的过程。

图2为实施例1获得的四倍体植株与二倍体植株的植株外形、气孔和染色 体的比较结果图；

图3为实施例1获得的四倍体植株与二倍体植株的花器官大小的比较结果 图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

实施例中所需的各种培养基如下：

芽诱导培养基A为MS培养基+(3～6)mg·L^-16-BA+(0.1～0.2)mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

成苗培养基为1/2MS培养基+(0.5～1)g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7 g·L^-1琼脂；

芽诱导培养基B为MS培养基+(1～5)mg·L^-16-BA或(0.05～0.2)mg·L^-1TDZ+(0.1～0.2)mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

上述的培养基pH为5.6～5.9，除TDZ采用过滤灭菌后加入到高温高压灭 菌的培养基外，其余的培养基均采用高温高压灭菌(121℃、1.06kg/cm2下灭菌 15min)；所有培养过程都在26～28℃、30μmol·m^-2s^-1光强(白色荧光灯)、16L/8D 光照条件下进行；

以上所述培养基的成分中，6-BA指6-苄基腺嘌呤；NAA指a-萘乙酸；TDZ 指噻重氮苯基脲，商品名噻苯隆(Thidiazuron，N-Phenyl-N’-1,2,3-thiadiazol-5- ylurea，N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲，TDZ)；1/2MS培养基是指MS培养基的 大量元素、微量元素、氨基酸和维生素含量均减半。

实施例1

(1)外植体的消毒和不定芽的诱导：取白姜花(Hedychium coronarium)(市 售常规。下同)的根状茎萌发出的新芽，用自来水冲洗干净后用洗洁精泡30分 钟，再用自来水流动冲洗30分钟后用70wt％酒精进行表面消毒60秒，最后用 0.1wt％升汞消毒18分钟，在超净工作台上切取0.5cm的芽作为外植体，接种 到芽诱导培养基A中进行培养，经过20天的培养诱导出不定芽；所述的芽诱导 培养基A为MS培养基+3mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7 g·L^-1琼脂；

(2)不定芽成苗：将步骤(1)诱导的不定芽转入成苗培养基中，促进苗生 根成熟，培养15天后可获得高6cm以上的健壮试管苗；所述的成苗培养基为 1/2MS培养基+1g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(3)不定芽的诱导和试管苗的获得：将步骤(2)获得的试管苗切取薄片 (薄片厚0.3～0.5mm)，接种在芽诱导培养基B上中进行培养，培养20天后可 获得健壮的不定芽；所述的芽诱导培养基B为MS培养基+2mg·L^-16-BA+0.1 mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

将长到1cm的不定芽转移到成苗培养基上进行成苗培养，培养15天可获 得健壮的试管苗；所述的成苗培养基为1/2MS培养基+1g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(4)根据需要重复步骤(3)，直到获得足够的试管苗；

(5)薄片的诱导处理：取步骤(3)或(4)得到的试管苗，从其基部切取 薄片(薄片厚0.3～0.5mm)，用MS培养基+0.2wt％秋水仙素+1％(v/v)的 DMSO液体培养基进行浸泡处理36小时；处理后的薄片用蒸馏水冲洗1～2遍， 接种在芽诱导培养基B(MS培养基+5mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂)中进行培养，培养20天后获得健壮的不定芽；将不定芽转 移到成苗培养基(1/2MS培养基+0.5g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼 脂)上培养15天，得到诱变处理的试管苗；

(6)将步骤(5)中得到的试管苗进行开瓶驯化，在室内散射光照下放置7 天，保持瓶内湿润。然后将苗清洗干净，移栽到装有营养土的花盆，营养土为 从花卉市场购买的用于花卉栽培的有机土，植株移栽前用浓度为1/20MS培养 基的无机盐溶液一次浇透，整个过程再不施肥，视土壤的干湿情况适当补充水 分，保持土壤湿润并适当遮阴，经过1个月后得到诱变的白姜花再生植株，可 以转入正常的栽培管理。

(7)将步骤(6)所获得的诱变的白姜花再生植株与原种二倍体植株进行 对比，将叶片变宽大，颜色浓绿，叶脉凸显，叶片微下垂生长，气孔变大，气 孔密度变小的植株选为候选植株；选取发育程度一致的二倍体植株和秋水仙素 处理后获得的植株，取节位一致的叶片，从叶片相同部位撕取下表皮，置于载 玻片上，制作临时装片，于显微镜下测量气孔的长度和密度；选取发育程度一 致的二倍体植株和秋水仙素处理后获得的植株，取叶片节位相同的叶片，测定 叶长(叶基部至叶尖长)和叶宽(叶片最宽的部位)；结果分别如表1和图2中 A、B、E、F所示。

(8)选取步骤(7)中获得的候选植株，用二倍体植株做对照。实验前一天 17：00点浇足水，次日早上9：00点到10：00点，取根部白嫩粗壮的根尖，采 用“解离-低渗-染色-压片-观察”方法进行染色体数目分析；具体步骤如下：用 解剖刀刮去根尖表皮，浸泡于解离液(37％HCl：95％C₂H₅OH＝1:3，体积比) 中，常温下解离6min；取出根尖，用蒸馏水冲洗3遍，再放到蒸馏水中低渗30 min；取少量分生区材料用解剖针拨散，滴加苯酚品红染液染色3min；盖上盖 玻片，吸掉多余的染液，再用滤纸盖在盖玻片上，用铅笔橡皮头隔着滤纸沿对 角线轻轻敲击盖片，使材料成分分散均匀；将压好的片子置于显微镜下观察， 鉴定染色体数目；观察的细胞数不少于30个，分裂细胞中85％以上为2n＝4x＝68 条染色体数的植株，确定为白姜花四倍体植株(如图2C、D所示)。

(9)对步骤(8)所获得的四倍体植株进行田间观察，测定花器官的唇瓣、 翼瓣的长度和宽度(最宽)，并测定雄蕊的花丝、花药的长度；将花器官明显变 大的植株确定为具有优良农业性状的白姜花四倍体植株。表2和图3所示为二 倍体植株和四倍体植株花器官的比较。

表1 二倍体植株和四倍体植株的叶片和气孔特征比较

  叶长(cm) 叶宽(cm) 气孔长度(μm) 气孔密度(个/mm²) 二倍体 21.55±0.20A 4.83±0.05A 33.23±0.28A 130.28±3.36A 四倍体 25.00±0.51B 5.36±0.09B 44.76±0.99B 86.17±3.90B

表2 白姜花二倍体植株和四倍体植株花器大小比较(cm)

  唇瓣长 唇瓣宽 翼瓣长 翼瓣宽 花丝长 花药长 二倍体 4.32±0.09A 4.24±0.09A 4.21±0.03A 1.93±0.03A 2.89±0.07A 1.19±0.01A 四倍体 5.33±0.14B 5.13±0.27B 5.47±0.08B 2.50±0.09B 4.04±0.10B 1.55±0.04B

图1为实施例1利用薄片培养技术建立白姜花植株再生体系的过程，其中： A用于切取薄片用的成熟植株(bar＝1cm)；B从一株成熟植株上所切取的部分 薄片(bar＝5mm)；C从一个薄片上长出的不定芽(bar＝1cm)；D获得的再生植 株。

图2为实施例1获得的四倍体植株与二倍体植株的植株外形、气孔和染色体 的比较结果图；A是二倍体植株，B是四倍体植株；C是二倍体植株的染色体，D 是四倍体植株的染色体；E是二倍体植株的气孔，F是四倍体植株的气孔。

图3为实施例1获得的四倍体植株与二倍体植株的花器官大小的比较结果 图；A是二倍体的即将开放的花蕾，B是四倍体的即将开放的花蕾；C是四倍体 的花药和花丝，D是二倍体的花药和花丝；E是四倍体植株的花，F是二倍体植 株的花。

实施例2

(1)外植体的消毒和不定芽的诱导：取白姜花(Hedychium coronarium)的 根状茎萌发出的新芽，用自来水冲洗干净后用洗洁精泡28分钟，再用自来水流 动冲洗28分钟后用75wt％酒精进行表面消毒75秒，最后用0.1wt％升汞消毒 15分钟，在超净工作台上切取1.0cm的芽作为外植体，接种到芽诱导培养基A 中进行培养，经过30天的培养可诱导出不定芽；所述的芽诱导培养基A为MS 培养基+4mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(2)不定芽成苗：将步骤(1)诱导的不定芽转入成苗培养基中，促进苗生 根成熟，培养30天可获得高6cm以上的健壮试管苗；所述的成苗培养基为1/2 MS培养基+0.5g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(3)不定芽的诱导和试管苗的获得：将步骤(2)获得的试管苗切取薄片 (薄片厚0.3～0.5mm)，接种在芽诱导培养基B上中进行培养，培养20天获得 健壮的不定芽；所述的芽诱导培养基B为MS培养基+5mg·L^-16-BA+0.15 mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

将长到1.5cm的不定芽转移到成苗培养基上进行成苗培养，培养15天后获 得健壮的试管苗；所述的成苗培养基为1/2MS培养基+0.5g·L^-1活性炭+15 g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(4)根据需要重复步骤(3)，直到获得足够的试管苗；

(5)薄片的诱导处理：取步骤(3)或(4)得到的试管苗，从其基部切取 薄片(薄片厚0.3～0.5mm)，用MS培养基+0.4wt％秋水仙素+1％(v/v)的 DMSO液体培养基进行浸泡处理24小时；处理后的薄片用蒸馏水冲洗1～2遍， 接种在芽诱导培养基B(MS培养基+3mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂)中，进行培养30天获得健壮的不定芽；将不定芽转移到成 苗培养基(1/2MS培养基+1g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂)上培 养20天，得到诱变处理的试管苗；

(6)将步骤(5)中得到的试管苗进行开瓶驯化，在室内散射光照下放置3 天，保持瓶内湿润。然后将苗清洗干净，移栽到装有营养土的花盆，营养土为 从花卉市场购买的用于花卉栽培的有机土，植株移栽前用浓度为1/20MS培养 基的无机盐溶液一次浇透，整个过程不再施肥，视土壤的干湿情况适当补充水 分，保持土壤湿润并适当遮阴，经过1个月后得到诱变的白姜花再生植株，可 以转入正常的栽培管理。

(7)将步骤(6)所获得的诱变的白姜花再生植株与原种二倍体植株进行 对比，将叶片变宽大，颜色浓绿，叶脉凸显，叶片微下垂生长，气孔变大，气 孔密度变小的植株选为候选植株；选取发育程度一致的二倍体植株和秋水仙素 处理后获得的植株，取节位一致的叶片，从叶片相同部位撕取下表皮，置于载 玻片上，制作临时装片，于显微镜下测量气孔的长度和密度；选取发育程度一 致的二倍体植株和秋水仙素处理后获得的植株，取叶片节位相同的叶片，测定 叶长(叶基部至叶尖长)和叶宽(叶片最宽的部位)。

(8)选取步骤(7)中获得的候选植株，用二倍体植株做对照。实验前一天 17：00点浇足水，次日早上9：00点到10：00点，取根部白嫩粗壮的根尖，采 用“解离-低渗-染色-压片-观察”方法进行染色体数目分析；具体步骤如下：用 解剖刀刮去根尖表皮，浸泡于解离液(37％HCl：95％C₂H₅OH＝1:4，体积比) 中，常温下解离6min；取出根尖，用蒸馏水冲洗3遍，再放到蒸馏水中低渗30 min；取少量分生区材料用解剖针拨散，滴加苯酚品红染液染色3min；盖上盖 玻片，吸掉多余的染液，再用滤纸盖在盖玻片上，用铅笔橡皮头隔着滤纸沿对 角线轻轻敲击盖片，使材料成分分散均匀；将压好的片子置于显微镜下观察， 鉴定染色体数目；观察的细胞数不少于30个，分裂细胞中85％以上为2n＝4x＝68 条染色体数的植株，确定为白姜花四倍体植株。

(9)对步骤(8)所获得的四倍体植株进行田间观察，测定花器官的唇瓣、 翼瓣的长度和宽度(最宽)，并测定雄蕊的花丝、花药的长度；将花器官明显 变大的植株确定为具有优良农业性状的白姜花四倍体植株。

实施例3

(1)外植体的消毒和不定芽的诱导：取白姜花(Hedychium coronarium)的 根状茎萌发出的新芽，用自来水冲洗干净后用洗洁精泡25分钟，再用自来水流 动冲洗25分钟后用72wt％酒精进行表面消毒90秒，最后用0.1wt％升汞消毒 20分钟，在超净工作台上切取1.5cm的芽作为外植体，接种到芽诱导培养基A 中进行培养，经过40天的培养诱导出不定芽；所述的芽诱导培养基A为MS培 养基+5mg·L^-16-BA+0.15mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(2)不定芽成苗：将步骤(1)诱导的不定芽转入成苗培养基中，促进苗生 根成熟，培养45天可获得高6cm以上的健壮试管苗；所述的成苗培养基为1/2 MS培养基+0.75g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(3)不定芽的诱导和试管苗的获得：将步骤(2)获得的试管苗切取薄片 (薄片厚0.3～0.5mm)，接种在芽诱导培养基B上中进行培养，培养20天获得 健壮的不定芽；所述的芽诱导培养基B为MS培养基+1mg·L^-16-BA+0.2 mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

将长到2cm的不定芽转移到成苗培养基上进行成苗培养；培养15天后获得 健壮的试管苗；所述的成苗培养基为1/2MS培养基+0.75g·L^-1活性炭+15 g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(4)根据需要重复步骤(3)，直到获得足够的试管苗；

(5)薄片的诱导处理：取步骤(3)或(4)得到的试管苗，从其基部切取 薄片(薄片厚0.3～0.5mm)，用MS培养基+0.6wt％秋水仙素+1％(v/v)的 DMSO液体培养基进行浸泡处理24小时；处理后的薄片用蒸馏水冲洗1～2遍， 接种在芽诱导培养基B(MS培养基+4mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂)中，进行培养40天获得健壮的不定芽；将不定芽转移到成 苗培养基(1/2MS培养基+0.75g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂)上 培养30天，得到诱变处理的试管苗；

(6)将步骤(5)中得到的试管苗进行开瓶驯化，在室内散射光照下放置5 天，保持瓶内湿润。然后将苗清洗干净，移栽到装有营养土的花盆，营养土为 从花卉市场购买的用于花卉栽培的有机土，植株移栽前用浓度为1/20MS培养 基的无机盐溶液一次浇透，整个过程再不施肥，视土壤的干湿情况适当补充水 分，保持土壤湿润并适当遮阴，经过1个月后得到诱变的白姜花再生植株，可 以转入正常的栽培管理。

(7)将步骤(6)所获得的诱变的白姜花再生植株与原种二倍体植株进行 对比，将叶片变宽大，颜色浓绿，叶脉凸显，叶片微下垂生长，气孔变大，气 孔密度变小的植株选为候选植株；选取发育程度一致的二倍体植株和秋水仙素 处理后获得的植株，取节位一致的叶片，从叶片相同部位撕取下表皮，置于载 玻片上，制作临时装片，于显微镜下测量气孔的长度和密度；选取发育程度一 致的二倍体植株和秋水仙素处理后获得的植株，取叶片节位相同的叶片，测定 叶长(叶基部至叶尖长)和叶宽(叶片最宽的部位)。

(8)选取步骤(7)中获得的候选植株，用二倍体植株做对照。实验前一 天17：00点浇足水，次日早上9：00点到10：00点，取根部白嫩粗壮的根尖， 采用“解离-低渗-染色-压片-观察”方法进行染色体数目分析；具体步骤如下： 用解剖刀刮去根尖表皮，浸泡于解离液(37％HCl：95％C₂H₅OH＝1:3，体积比) 中，常温下解离6min；取出根尖，用蒸馏水冲洗3遍，再放到蒸馏水中低渗30 min；取少量分生区材料用解剖针拨散，滴加苯酚品红染液染色3min；盖上盖 玻片，吸掉多余的染液，再用滤纸盖在盖玻片上，用铅笔橡皮头隔着滤纸沿对 角线轻轻敲击盖片，使材料成分分散均匀；将压好的片子置于显微镜下观察， 鉴定染色体数目；观察的细胞数不少于30个，分裂细胞中85％以上为2n＝4x＝68 条染色体数的植株，确定为白姜花四倍体植株。

(9)对步骤(8)所获得的四倍体植株进行田间观察，测定花器官的唇瓣、 翼瓣的长度和宽度(最宽)，并测定雄蕊的花丝、花药的长度；将花器官明显 变大的植株确定为具有优良农业性状的白姜花四倍体植株。

实施例4

(1)外植体的消毒和不定芽的诱导：取白姜花(Hedychium coronarium)的 根状茎萌发出的新芽，用自来水冲洗干净后用洗洁精泡25分钟，再用自来水流 动冲洗25分钟后用70wt％酒精进行表面消毒90秒，最后用0.1wt％升汞消毒 20分钟，在超净工作台上切取2.0cm的芽作为外植体，接种到芽诱导培养基A 中进行培养，经过20天的培养诱导出不定芽；所述的芽诱导培养基A为MS培 养基+5mg·L^-16-BA+0.15mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(2)不定芽成苗：将步骤(1)诱导的不定芽转入成苗培养基中，促进苗生 根成熟，培养20天可获得高6cm以上的健壮试管苗；所述的成苗培养基为1/2 MS培养基+0.75g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(3)不定芽的诱导和试管苗的获得：将步骤(2)获得的试管苗切取薄片 (薄片厚0.3～0.5mm)，接种在芽诱导培养基B上中进行培养，培养20天获得 健壮的不定芽；所述的芽诱导培养基B为MS培养基+0.05mg·L^-1TDZ+0.2 mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

将长到2cm的不定芽转移到成苗培养基上进行成苗培养，培养15天获得健 壮的试管苗；所述的成苗培养基为1/2MS培养基+0.75g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(4)根据需要重复步骤(3)，直到获得足够的试管苗；

(5)薄片的诱导处理：取步骤(3)或(4)得到的试管苗，从其基部切取 薄片(薄片厚0.3～0.5mm)，用MS培养基+0.8wt％秋水仙素+1％(v/v)的 DMSO液体培养基进行浸泡处理12小时；处理后的薄片用蒸馏水冲洗1～2遍， 接种在芽诱导培养基B(MS培养基+0.05mg·L^-1TDZ+0.2mg·L^-1NAA+30 g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂)中，进行培养20天获得健壮的不定芽；将不定芽转移 到成苗培养基(1/2MS培养基+0.75g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂) 上培养35天，得到诱变处理的试管苗；

(6)将步骤(5)中得到的试管苗进行开瓶驯化，在室内散射光照下放置5 天，保持瓶内湿润。然后将苗清洗干净，移栽到装有营养土的花盆，营养土为 从花卉市场购买的用于花卉栽培的有机土，植株移栽前用浓度为1/20MS培养 基的无机盐溶液一次浇透，整个过程再不施肥，视土壤的干湿情况适当补充水 分，保持土壤湿润并适当遮阴，经过1个月后得到诱变的白姜花再生植株，可 以转入正常的栽培管理。

(7)将步骤(6)所获得的诱变的白姜花再生植株与原种二倍体植株进行 对比，将叶片变宽大，颜色浓绿，叶脉凸显，叶片微下垂生长，气孔变大，气 孔密度变小的植株选为候选植株；选取发育程度一致的二倍体植株和秋水仙素 处理后获得的植株，取节位一致的叶片，从叶片相同部位撕取下表皮，置于载 玻片上，制作临时装片，于显微镜下测量气孔的长度和密度；选取发育程度一 致的二倍体植株和秋水仙素处理后获得的植株，取叶片节位相同的叶片，测定 叶长(叶基部至叶尖长)和叶宽(叶片最宽的部位)。

(8)选取步骤(7)中获得的候选植株，用二倍体植株做对照。实验前一 天17：00点浇足水，次日早上9：00点到10：00点，取根部白嫩粗壮的根尖， 采用“解离-低渗-染色-压片-观察”方法进行染色体数目分析；具体步骤如下： 用解剖刀刮去根尖表皮，浸泡于解离液(37％HCl：95％C₂H₅OH＝1:5，体积比) 中，常温下解离6min；取出根尖，用蒸馏水冲洗3遍，再放到蒸馏水中低渗30 min；取少量分生区材料用解剖针拨散，滴加苯酚品红染液染色3min；盖上盖 玻片，吸掉多余的染液，再用滤纸盖在盖玻片上，用铅笔橡皮头隔着滤纸沿对 角线轻轻敲击盖片，使材料成分分散均匀；将压好的片子置于显微镜下观察， 鉴定染色体数目；观察的细胞数不少于30个，分裂细胞中85％以上为2n＝4x＝68 条染色体数的植株，确定为白姜花四倍体植株。

(9)对步骤(8)所获得的四倍体植株进行田间观察，测定花器官的唇瓣、 翼瓣的长度和宽度(最宽)，并测定雄蕊的花丝、花药的长度；将花器官明显 变大的植株确定为具有优良农业性状的白姜花四倍体植株。

实施例5

(1)外植体的消毒和不定芽的诱导：取白姜花(Hedychium coronarium)的 根状茎萌发出的新芽，用自来水冲洗干净后用洗洁精泡28分钟，再用自来水流 动冲洗28分钟后用75wt％酒精进行表面消毒75秒，最后用0.1wt％升汞消毒 15分钟，在超净工作台上切取1.0cm的芽作为外植体，接种到芽诱导培养基A 中进行培养，经过30天的培养诱导出不定芽；所述的芽诱导培养基A为MS培 养基+4mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(2)不定芽成苗：将步骤(1)诱导的不定芽转入成苗培养基中，促进苗生 根成熟，培养30天可获得高6cm以上的健壮试管苗；所述的成苗培养基为1/2 MS培养基+0.5g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(3)不定芽的诱导和试管苗的获得：将步骤(2)获得的试管苗切取薄片 (薄片厚0.3～0.5mm)，接种在芽诱导培养基B上中进行培养，培养20天获得 健壮的不定芽；所述的芽诱导培养基B为MS培养基+0.2mg·L^-1TDZ+0.15 mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

将长到1.5cm的不定芽转移到成苗培养基上进行成苗培养，培养15天获得 健壮的试管苗；所述的成苗培养基为1/2MS培养基+0.5g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(4)根据需要重复步骤(3)，直到获得足够的试管苗；

(5)薄片的诱导处理：取步骤(3)或(4)得到的试管苗，从其基部切取 薄片(薄片厚0.3～0.5mm)，用MS培养基+0.4wt％秋水仙素+1％(v/v)的 DMSO液体培养基进行浸泡处理24小时；处理后的薄片用蒸馏水冲洗1～2遍， 接种在芽诱导培养基B(MS培养基+0.2mg·L^-1TDZ+0.1mg·L^-1NAA+30 g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂)中，进行培养30天获得健壮的不定芽；将不定芽转移 到成苗培养基(1/2MS培养基+1g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂) 上培养40天，得到诱变处理的试管苗；

(6)将步骤(5)中得到的试管苗进行开瓶驯化，在室内散射光照下放置3 天，保持瓶内湿润。然后将苗清洗干净，移栽到装有营养土的花盆，营养土为 从花卉市场购买的用于花卉栽培的有机土，植株移栽前用浓度为1/20MS培养 基的无机盐溶液一次浇透，整个过程再不施肥，视土壤的干湿情况适当补充水 分，保持土壤湿润并适当遮阴，经过1个月后得到诱变的白姜花再生植株，可 以转入正常的栽培管理。

(7)将步骤(6)所获得的诱变的白姜花再生植株与原种二倍体植株进行 对比，将叶片变宽大，颜色浓绿，叶脉凸显，叶片微下垂生长，气孔变大，气 孔密度变小的植株选为候选植株；选取发育程度一致的二倍体植株和秋水仙素 处理后获得的植株，取节位一致的叶片，从叶片相同部位撕取下表皮，置于载 玻片上，制作临时装片，于显微镜下测量气孔的长度和密度；选取发育程度一 致的二倍体植株和秋水仙素处理后获得的植株，取叶片节位相同的叶片，测定 叶长(叶基部至叶尖长)和叶宽(叶片最宽的部位)。

(8)选取步骤(7)中获得的候选植株，用二倍体植株做对照。实验前一天 17：00点浇足水，次日早上9：00点到10：00点，取根部白嫩粗壮的根尖，采 用“解离-低渗-染色-压片-观察”方法进行染色体数目分析；具体步骤如下：用 解剖刀刮去根尖表皮，浸泡于解离液(37％HCl：95％C₂H₅OH＝1:3，体积比) 中，常温下解离6min；取出根尖，用蒸馏水冲洗3遍，再放到蒸馏水中低渗30 min；取少量分生区材料用解剖针拨散，滴加苯酚品红染液染色3min；盖上盖 玻片，吸掉多余的染液，再用滤纸盖在盖玻片上，用铅笔橡皮头隔着滤纸沿对 角线轻轻敲击盖片，使材料成分分散均匀；将压好的片子置于显微镜下观察， 鉴定染色体数目；观察的细胞数不少于30个，分裂细胞中85％以上为2n＝4x＝68 条染色体数的植株，确定为白姜花四倍体植株。

(9)对步骤(8)所获得的四倍体植株进行田间观察，测定花器官的唇瓣、 翼瓣的长度和宽度(最宽)，并测定雄蕊的花丝、花药的长度；将花器官明显 变大的植株确定为具有优良农业性状的白姜花四倍体植株。

实施例6

(1)外植体的消毒和不定芽的诱导：取白姜花(Hedychium coronarium)的 根状茎萌发出的新芽，用自来水冲洗干净后用洗洁精泡28分钟，再用自来水流 动冲洗28分钟后用73wt％酒精进行表面消毒75秒，最后用0.1wt％升汞消毒 15分钟，在超净工作台上切取1.5cm的芽作为外植体，接种到芽诱导培养基A 中进行培养，经过40天的培养诱导出不定芽；所述的芽诱导培养基A为MS培 养基+4mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(2)不定芽成苗：将步骤(1)诱导的不定芽转入成苗培养基中，促进苗生 根成熟，培养40天可获得高6cm以上的健壮试管苗；所述的成苗培养基为1/2 MS培养基+0.5g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(3)不定芽的诱导和试管苗的获得：将步骤(2)获得的试管苗切取薄片 (薄片厚0.3～0.5mm)，接种在芽诱导培养基B上中进行培养，培养20天获得 健壮的不定芽；所述的芽诱导培养基B为MS培养基+0.1mg·L^-1TDZ+0.15 mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

将长到1.5cm的不定芽转移到成苗培养基上进行成苗培养，培养15天获得 健壮的试管苗；所述的成苗培养基为1/2MS培养基+0.5g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂；

(4)根据需要重复步骤(3)，直到获得足够的试管苗；

(5)薄片的诱导处理：取步骤(3)或(4)得到的试管苗，从其基部切取 薄片(薄片厚0.3～0.5mm)，用MS培养基+0.6wt％秋水仙素+1％(v/v)的 DMSO液体培养基进行浸泡处理24小时；处理后的薄片用蒸馏水冲洗1～2遍， 接种在芽诱导培养基B(MS培养基+0.1mg·L^-1TDZ+0.1mg·L^-1NAA+30 g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂)中，进行培养40天获得健壮的不定芽；将不定芽转移 到成苗培养基(1/2MS培养基+1g·L^-1活性炭+15g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂) 上培养45天，得到诱变处理的试管苗；

(6)将步骤(5)中得到的试管苗进行开瓶驯化，在室内散射光照下放置3 天，保持瓶内湿润。然后将苗清洗干净，移栽到装有营养土的花盆，营养土为 从花卉市场购买的用于花卉栽培的有机土，植株移栽前用浓度为1/20MS培养 基的无机盐溶液一次浇透，整个过程再不施肥，视土壤的干湿情况适当补充水 分，保持土壤湿润并适当遮阴，经过1个月后得到诱变的白姜花再生植株，可 以转入正常的栽培管理。

(7)将步骤(6)所获得的诱变的白姜花再生植株与原种二倍体植株进行 对比，将叶片变宽大，颜色浓绿，叶脉凸显，叶片微下垂生长，气孔变大，气 孔密度变小的植株选为候选植株；选取发育程度一致的二倍体植株和秋水仙素 处理后获得的植株，取节位一致的叶片，从叶片相同部位撕取下表皮，置于载 玻片上，制作临时装片，于显微镜下测量气孔的长度和密度；选取发育程度一 致的二倍体植株和秋水仙素处理后获得的植株，取叶片节位相同的叶片，测定 叶长(叶基部至叶尖长)和叶宽(叶片最宽的部位)。

(8)选取步骤(7)中获得的候选植株，用二倍体植株做对照。实验前一天 17：00点浇足水，次日早上9：00点到10：00点，取根部白嫩粗壮的根尖，采 用“解离-低渗-染色-压片-观察”方法进行染色体数目分析；具体步骤如下：用 解剖刀刮去根尖表皮，浸泡于解离液(37％HCl：95％C₂H₅OH＝1:3，体积比) 中，常温下解离6min；取出根尖，用蒸馏水冲洗3遍，再放到蒸馏水中低渗30 min；取少量分生区材料用解剖针拨散，滴加苯酚品红染液染色3min；盖上盖 玻片，吸掉多余的染液，再用滤纸盖在盖玻片上，用铅笔橡皮头隔着滤纸沿对 角线轻轻敲击盖片，使材料成分分散均匀；将压好的片子置于显微镜下观察， 鉴定染色体数目；观察的细胞数不少于30个，分裂细胞中85％以上为2n＝4x＝68 条染色体数的植株，确定为白姜花四倍体植株。

(9)对步骤(8)所获得的四倍体植株进行田间观察，测定花器官的唇瓣、 翼瓣的长度和宽度(最宽)，并测定雄蕊的花丝、花药的长度；将花器官明显 变大的植株确定为具有优良农业性状的白姜花四倍体植株。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。