一种杉木正冠组培苗继代芽培育方法

摘要

本发明公开的一种杉木正冠组培苗继代芽培育方法，是以杉木优良无性系当年生嫩枝为外植体，通过灭菌消毒组培获取繁殖芽，将繁殖芽接种于包括1/2MS，6-BA1.0mg/L和IBA0.5mg/L的增殖培养基内诱导丛生芽发生，选择繁殖芽基部萌发、生长健壮的继代芽扦插于常用的生根培养基上，炼苗，移栽，杉木苗高15～30cm时出圃造林。使用本方法，杉木继代芽增殖系数高，达4～6，繁殖速度快、育苗量大、可以在短期内批量生产遗传稳定性高、组培苗正冠率100%，生根率高达96%以上的组培继代芽，能适应我国杉木储备基地建设发展对良种种苗的需要，具有较好的经济效益、社会效益和生态效益。

说明书

技术领域

本发明属于植物无性快繁技术领域，尤其是涉及一种杉木正冠组培苗继代芽培育方法。

背景技术

杉木(CunninghamiaLanceolata)属杉科(Taxodiaceae)，杉木属(Cunninghamia)。 是我国特有的速生商品材树种，生长快，材质好。木材纹理通直，结构均匀，不翘不裂。材 质轻韧，强度适中，质量系数高。具香味,材中含有“杉脑”，能抗虫耐腐，加工容易。广泛 用于建筑、家具、器具、造船等各方面。

我国既是一个木材生产大国，又是一个木材消费大国。天然林保护工程实施以后，木材 供需矛盾进一步加剧，木材供需缺口逐年增加。预计到2015年,我国生产建设用木材需求量 约为4.8亿m³,缺口将达1.9亿m³。如果按照近10年我国木材消费平均年增长率3.71％计算, 到2020年我国木材消费总量将达到6.78亿m3,供需矛盾有增无减。

无性系林业生产力高，在国内外许多研究和造林实践广泛证实。1990年开始，广西林科 院和区林业技术推广总站等单位，分别在融安县西山林场等十多单位推广杉木优良无性系造 林，以杉木良种(融水白云康杉)实生苗作对照。1997年测定分析，在初选参试的927个无 性系中有230个无性系表现较为优良，其木材总平均比对照增益45.1％；最优的无性系89个， 材积总平均比对照增益53.5％；较优的无性系141个，材积总平均比对照增益39.9％。而杉木 优良无性系比杉木家系的增益还高12.5％～37.5％。筛选出的优良无性系增产效果显著，应用 前景广阔。南京林业大学、福建省林业科学研究院和广西林科院已成功地将杉木优良无性系 以组培工厂化育苗方式扩繁，推进了杉木良种的应用进程，因此，杉木良种繁育，特别是组 培快繁前景看好。

中国专利201110195928.6的一种杉木组织培养方法。本发明所述培养方法采用开放式组 织培养，采用的抑制剂菌杀果、代森锰锌和次氯酸钠中的一种或几种。该方法，在不影响组 培效果的同时，能够将污染率降低到可接受的范围，在抑菌剂的作用下，使杉木组织培养脱 离严格无菌的操作环境，在自然、开放的有菌环境中进行植物的组织培养，从根本上简化组 培环节，降低组培成本。

中国专利200810070456.X一种杉木组织培养生根方法。本发明提供了一种杉木组织培 养生根方法，切去杉木增殖继代小苗，接种于杉木生根培养基进行组织培养生根，杉木生根 培养基由改良MS培养基、ABT1#0.4～0.8mg/L、IBA0.1～0.5mg/L和根太阳稀释液2～6ml/L 组成。采用上述杉木生根培养基后，杉木的生根时间缩短至16～22天，经22天培养后，杉 木的生根率达到96％，苗木生长速度快，使得育苗成本降低，实现杉木产业化生产。

杉木具有一定的遗传保守性，主干上的不定芽有明显的形态极性(这就是顶端优势)，长 出的枝条能形成直立的主干。一旦断顶截干后，顶芽与侧芽之间失去了平衡，相应地受活跃 的顶端分生组织抑制的侧芽就大量的萌发。自然状态下，断稍后萌芽位置效应效果见表1。

表1 杉木断稍后萌芽情况表

备注：摘自洪昌端，1994年“杉木带皮芽接是提高接穗利用率和接株正冠率的好方法”

表1显示，杉木位置效应显著，倾斜型萌芽条最低也占58.3％，高者占92.7％。但杉木的 年龄和位置效应并不是一成不变，通过人为因素采取适当的措施，可以纠正杉木偏冠问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，提供一种能够解决杉木组织苗偏冠的问题，开发杉木优良无 性系高效正冠组培快繁技术的杉木正冠组培苗继代芽的培育方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种杉木正冠组培苗继代芽培育方法，包括获取外植体、正冠组培苗继代芽培养、生根 苗培养、生根苗移栽和出圃工序，通过获取消毒灭菌后的外植体，依次接种于初始培养基和 增殖培养基后获得正冠组培苗，对正冠组培苗进行不定根诱导生根后移栽，出圃，具体操作 步骤如下：

(1)获取外植体：选择优良的无性系嫁接杉木幼树当年生的嫩枝为外植体；将消毒灭菌 后的外植体接种到初始培养基内，获取繁殖芽；

(2)继代芽增殖培养：将长1.5～3cm的繁殖芽接种到增殖培养基内，诱导继代芽；待 繁殖芽基部萌发出2～3个长0.3～0.5cm的继代芽时进行转接；每次转接，将繁殖芽逐渐剪 短至0.3～0.5cm；取剪短后的繁殖芽基部萌发扦插生根用的继代芽，获得正冠组培苗；

(3)生根苗培养：在正冠组培苗中选择繁殖芽基部萌发、生长健壮的继代芽扦插于常用 的生根培养基上，在温度25～30℃，2000～7000Lx光照条件下进行不定根诱导，培养10～ 15d后开始生根，25～30d根长0.4～0.6cm时，获得生根苗，将生根苗转到炼苗室炼苗；

(4)生根苗移栽：炼苗20～30d,待根系由白色转变成灰白色时，将生根苗进行移栽， 移栽时先将生根苗置于清水中漂洗，洗净根部的培养基，晾干根系的表面水分，将生根苗栽 入装有红心土与椰糠的混合基质容器中培养；

(5)出圃：在容器中的生根苗进行培养8～10月，杉木苗高15～30cm时出圃造林。

以上步骤(1)所述的外植体消毒灭菌的方法为：剪除外植体上的叶片，在洗洁精溶液中 用毛刷轻轻刷洗，放入质量浓度为0.1％的新吉尔灭中浸泡40～50min，再用纯净水冲洗3～ 5遍，将外植体剪切成1～2cm的长茎段；在超净工作台用体积浓度75％的乙醇对剪切后的外 植体消毒10s，然后将外植体置于10～30mg/L的抗坏血酸中浸泡5～12min；最后用无菌水冲 洗3～4遍。

以上步骤(1)中对外植体进行消毒灭菌，当外植体属于幼嫩茎尖处时，置于10mg/L的 抗坏血酸中浸泡5min；当外植体属于半木质化茎段时，置于30mg/L的抗坏血酸中浸泡8min； 当外植体属于木质化茎段时，置于30mg/L的抗坏血酸中浸泡12min。

以上步骤(1)所述的初始培养基是以2/3MS为基本培养基，还包括6-BA1.0mg/L、IBA 0.5mg/L和ZT0.2mg/L；其中2/3MS基本培养基中的Ca(NO₃)₂含量为150mg/L，Na₂SO₄含量为 50mg/L。

以上步骤(2)中所述的增殖培养基是以1/2MS为基本培养基，还包括6-BA0.8mg/L、 IBA0.4mg/L和ZT0.1mg/L；其中1/2MS基本培养基中的Ca(NO₃)₂含量为150mg/L。

以上所述的增殖培养基用500ml的三角瓶分装，每瓶70ml，用棉球封口，再用牛皮纸包 扎棉球和瓶口，在120℃和1.1kg.cm²条件下，用高压蒸汽灭菌锅灭菌15min。

以上步骤(2)中所述的继代增殖培养控制光照2000～7000Lx，温度25～30℃。

以上步骤(4)中所述的混合基质是按红心土与椰糠的体积比为3:1的比例混合。

相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：

1、本发明利用植物顶端优势原理，即植物顶芽合成的生物素向下运输，大量积累在侧芽 部位，并且侧芽对生长素的敏感程度比顶芽强，所以就会抑制侧芽的生长，表现为顶芽优先 生长而侧芽受到抑制。一旦顶端优势被解除，顶芽和侧芽内源激素失去了平衡，侧芽细胞分 裂素增加，受顶端分生组织抑制的侧芽就大量萌发，使芽幼态化。选择繁殖芽基部萌发的大 量增殖继代壮芽作为微插繁殖材料，既克服继代芽的年龄效应，也解除了位置效应，培育正 冠组培苗。

2、本发明以杉木优良无性系当年生嫩枝为外植体，通过灭菌消毒获取无菌繁殖体,将外 植体接种于初始培养基和增殖培养基后诱导继代芽；每次转接仅留基部萌生的丛芽，其它芽 全部除掉,繁殖芽条逐渐剪短；选择长0.3～0.5cm基部萌发，高1.5～3cm，2/3叶片浓绿色， 叶面光亮的芽扦插生根，获取正冠组培苗；使用本方法，继代芽增殖系数高，达4～6，繁殖 速度快、育苗量大、可以在短期内批量生产遗传稳定性高、组培苗正冠率达100％，生根率高 达96％以上的继代芽。能适应我国林木储备基地建设发展对良种种苗的需要。

3、本发明的杉木正冠组培苗继代芽的培育方法，材料易得，成本低，操作简单，扩繁快， 繁殖系数高，获得正冠杉木苗木数量大，具有较好的经济效益、社会效益和生态效益。

附图说明

图1为常规方法培育得到的偏冠杉木组培苗。

图2为本发明培育得到的正冠杉木组培苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：

一种杉木正冠组培苗继代芽培育方法，选择优良的无性系嫁接杉木幼树当年生的嫩枝为 外植体。剪除外植体上的叶片，在洗洁精溶液中用毛刷轻轻刷洗，放入质量浓度为0.1％的新 吉尔灭中浸泡40min，再用纯净水冲洗3～5遍，将外植体剪切成1～2cm的长茎段，在超净 工作台用体积浓度75％的乙醇对剪切后的外植体消毒10s。当外植体属于幼嫩茎尖处时，将消 毒后的外植体置于10mg/L的抗坏血酸中浸泡5min进行灭菌；当外植体属于半木质化茎段时， 将消毒后的外植体置于30mg/L的抗坏血酸中浸泡8min进行灭菌；当外植体属于木质化茎段 时，将消毒后的外植体置于30mg/L的抗坏血酸中浸泡12min进行灭菌。然后将消毒灭菌后的 外植体接种到初始培养基内。所述的初始培养基是以2/3MS为基本培养基，还包括6-BA 1.0mg/L、IBA0.5mg/L和ZT0.2mg/L；其中2/3MS基本培养基中的Ca(NO₃)₂含量为150mg/L， Na₂SO₄含量为50mg/L。外植体在初始培养基内培养获取繁殖芽。将长1.5～3cm的繁殖芽接种 到增殖培养基内，诱导继代芽。所述的增殖培养基是以1/2MS为基本培养基，还包括6-BA 0.8mg/L、IBA0.4mg/L和ZT0.1mg/L；其中1/2MS基本培养基中的Ca(NO₃)₂含量为150mg/L。 增殖培养基用500ml的三角瓶分装，每瓶70ml，用棉球封口，再用牛皮纸包扎棉球和瓶口， 在120℃和1.1kg.cm²条件下，用高压蒸汽灭菌锅灭菌15min。继代增殖培养过程中，控制光 照2000～3000Lx，温度30℃。

待繁殖芽基部萌发出2～3个长0.3～0.5cm的继代芽时进行转接。每次转接，将繁殖芽 逐渐剪短至0.3～0.5cm；取剪短后的繁殖芽基部萌发扦插生根用的继代芽，即为正冠组培苗； 在正冠组培苗中选择繁殖芽基部萌发、生长健壮的继代芽扦插于常用的生根培养基上，在温 度30℃，2000～3000Lx光照条件下进行不定根诱导，培养10～12d后开始生根，25～28d根 长0.4～0.5cm时，获得生根苗，将生根苗转到炼苗室炼苗。炼苗20～25d,待根系由白色转 变成灰白色时，将生根苗进行移栽。移栽时先将生根苗置于清水中漂洗，洗净根部的培养基， 晾干根系的表面水分，将生根苗栽入装有红心土与椰糠的混合基质容器中培养，红心土与椰 糠按体积比为3:1的比例混合。在容器中的生根苗进行培养8月，杉木苗高15～20cm时出圃 造林。

实施例2：

一种杉木正冠组培苗继代芽培育方法，选择优良的无性系嫁接杉木幼树当年生的嫩枝为 外植体。剪除外植体上的叶片，在洗洁精溶液中用毛刷轻轻刷洗，放入质量浓度为0.1％的新 吉尔灭中浸泡45min，再用纯净水冲洗4～5遍，将外植体剪切成1～2cm的长茎段，在超净 工作台用体积浓度75％的乙醇对剪切后的外植体消毒10s。当外植体属于幼嫩茎尖处时，将消 毒后的外植体置于10mg/L的抗坏血酸中浸泡5min进行灭菌；当外植体属于半木质化茎段时， 将消毒后的外植体置于30mg/L的抗坏血酸中浸泡8min进行灭菌；当外植体属于木质化茎段 时，将消毒后的外植体置于30mg/L的抗坏血酸中浸泡12min进行灭菌。然后将消毒灭菌后的 外植体接种到初始培养基内。所述的初始培养基是以2/3MS为基本培养基，还包括6-BA 1.0mg/L、IBA0.5mg/L和ZT0.2mg/L；其中2/3MS基本培养基中的Ca(NO₃)₂含量为150mg/L， Na₂SO₄含量为50mg/L。外植体在初始培养基内培养获取繁殖芽。将长1.5～3cm的繁殖芽接种 到增殖培养基内，诱导继代芽。所述的增殖培养基是以1/2MS为基本培养基，还包括6-BA 0.8mg/L、IBA0.4mg/L和ZT0.1mg/L；其中1/2MS基本培养基中的Ca(NO₃)₂含量为150mg/L。 增殖培养基用500ml的三角瓶分装，每瓶70ml，用棉球封口，再用牛皮纸包扎棉球和瓶口， 在120℃和1.1kg.cm²条件下，用高压蒸汽灭菌锅灭菌15min。继代增殖培养过程中，控制光 照3000～4000Lx，温度27℃。

待繁殖芽基部萌发出2～3个长0.3～0.5cm的继代芽时进行转接。每次转接，将繁殖芽 逐渐剪短至0.3～0.4cm；取剪短后的繁殖芽基部萌发扦插生根用的继代芽，即为正冠组培苗； 在正冠组培苗中选择繁殖芽基部萌发、生长健壮的继代芽扦插于常用的生根培养基上，在温 度27℃，3000～4000Lx光照条件下进行不定根诱导，培养10～12d后开始生根，25～27d根 长0.4～0.5cm时，获得生根苗，将生根苗转到炼苗室炼苗。炼苗20～25d,待根系由白色转 变成灰白色时，将生根苗进行移栽。移栽时先将生根苗置于清水中漂洗，洗净根部的培养基， 晾干根系的表面水分，将生根苗栽入装有红心土与椰糠的混合基质容器中培养，红心土与椰 糠按体积比为3:1的比例混合。在容器中的生根苗进行培养8月，杉木苗高15～20cm时出圃 造林。

实施例3：

一种杉木正冠组培苗继代芽培育方法，选择优良的无性系嫁接杉木幼树当年生的嫩枝为 外植体。剪除外植体上的叶片，在洗洁精溶液中用毛刷轻轻刷洗，放入质量浓度为0.1％的新 吉尔灭中浸泡45min，再用纯净水冲洗4～5遍，将外植体剪切成1～2cm的长茎段，在超净 工作台用体积浓度75％的乙醇对剪切后的外植体消毒10s。当外植体属于幼嫩茎尖处时，将消 毒后的外植体置于10mg/L的抗坏血酸中浸泡5min进行灭菌；当外植体属于半木质化茎段时， 将消毒后的外植体置于30mg/L的抗坏血酸中浸泡8min进行灭菌；当外植体属于木质化茎段 时，将消毒后的外植体置于30mg/L的抗坏血酸中浸泡12min进行灭菌。然后将消毒灭菌后的 外植体接种到初始培养基内。所述的初始培养基是以2/3MS为基本培养基，还包括6-BA 1.0mg/L、IBA0.5mg/L和ZT0.2mg/L；其中2/3MS基本培养基中的Ca(NO₃)₂含量为150mg/L， Na₂SO₄含量为50mg/L。外植体在初始培养基内培养获取繁殖芽。将长1.5～3cm的繁殖芽接种 到增殖培养基内，诱导继代芽。所述的增殖培养基是以1/2MS为基本培养基，还包括6-BA 0.8mg/L、IBA0.4mg/L和ZT0.1mg/L；其中1/2MS基本培养基中的Ca(NO₃)₂含量为150mg/L。 增殖培养基用500ml的三角瓶分装，每瓶70ml，用棉球封口，再用牛皮纸包扎棉球和瓶口， 在120℃和1.1kg.cm²条件下，用高压蒸汽灭菌锅灭菌15min。继代增殖培养过程中，控制光 照5000～6000Lx，温度28℃。

待繁殖芽基部萌发出2～3个长0.3～0.5cm的继代芽时进行转接。每次转接，将繁殖芽 逐渐剪短至0.4～0.5cm；取剪短后的繁殖芽基部萌发扦插生根用的继代芽，即为正冠组培苗； 在正冠组培苗中选择繁殖芽基部萌发、生长健壮的继代芽扦插于常用的生根培养基上，在温 度28℃，5000～6000Lx光照条件下进行不定根诱导，培养12～15d后开始生根，27～30d根 长0.5～0.6cm时，获得生根苗，将生根苗转到炼苗室炼苗。炼苗25～30d,待根系由白色转 变成灰白色时，将生根苗进行移栽。移栽时先将生根苗置于清水中漂洗，洗净根部的培养基， 晾干根系的表面水分，将生根苗栽入装有红心土与椰糠的混合基质容器中培养，红心土与椰 糠按体积比为3:1的比例混合。在容器中的生根苗进行培养9月，杉木苗高20～25cm时出圃 造林。

实施例4：

一种杉木正冠组培苗继代芽培育方法，选择优良的无性系嫁接杉木幼树当年生的嫩枝为 外植体。剪除外植体上的叶片，在洗洁精溶液中用毛刷轻轻刷洗，放入质量浓度为0.1％的新 吉尔灭中浸泡50min，再用纯净水冲洗4～5遍，将外植体剪切成1～2cm的长茎段，在超净 工作台用体积浓度75％的乙醇对剪切后的外植体消毒10s。当外植体属于幼嫩茎尖处时，将消 毒后的外植体置于10mg/L的抗坏血酸中浸泡5min进行灭菌；当外植体属于半木质化茎段时， 将消毒后的外植体置于30mg/L的抗坏血酸中浸泡8min进行灭菌；当外植体属于木质化茎段 时，将消毒后的外植体置于30mg/L的抗坏血酸中浸泡12min进行灭菌。然后将消毒灭菌后的 外植体接种到初始培养基内。所述的初始培养基是以2/3MS为基本培养基，还包括6-BA 1.0mg/L、IBA0.5mg/L和ZT0.2mg/L；其中2/3MS基本培养基中的Ca(NO₃)₂含量为150mg/L， Na₂SO₄含量为50mg/L。外植体在初始培养基内培养获取繁殖芽。将长1.5～3cm的繁殖芽接种 到增殖培养基内，诱导继代芽。所述的增殖培养基是以1/2MS为基本培养基，还包括6-BA 0.8mg/L、IBA0.4mg/L和ZT0.1mg/L；其中1/2MS基本培养基中的Ca(NO₃)₂含量为150mg/L。 增殖培养基用500ml的三角瓶分装，每瓶70ml，用棉球封口，再用牛皮纸包扎棉球和瓶口， 在120℃和1.1kg.cm²条件下，用高压蒸汽灭菌锅灭菌15min。继代增殖培养过程中，控制光 照6000～7000Lx，温度25℃。

待繁殖芽基部萌发出2～3个长0.3～0.5cm的继代芽时进行转接。每次转接，将繁殖芽 逐渐剪短至0.4～0.5cm；取剪短后的繁殖芽基部萌发扦插生根用的继代芽，即为正冠组培苗； 在正冠组培苗中选择繁殖芽基部萌发、生长健壮的继代芽扦插于常用的生根培养基上，在温 度25℃，6000～7000Lx光照条件下进行不定根诱导，培养12～15d后开始生根，25～30d根 长0.5～0.6cm时，获得生根苗，将生根苗转到炼苗室炼苗。炼苗25～30d,待根系由白色转 变成灰白色时，将生根苗进行移栽。移栽时先将生根苗置于清水中漂洗，洗净根部的培养基， 晾干根系的表面水分，将生根苗栽入装有红心土与椰糠的混合基质容器中培养，红心土与椰 糠按体积比为3:1的比例混合。在容器中的生根苗进行培养10月，杉木苗高20～30cm时出 圃造林。