冬虫夏草中国被毛孢磷脂酶C、编号基因及其应用

摘要

本发明涉及一个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与水解磷脂制备相应游离脂肪酸中的磷脂酶C，编码这个酶的基因及其应用。所述磷脂酶C的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示的蛋白具有90％以上同源性，其编码基因核苷酸序列与SEQ ID No.2所示序列具有90％以上同源性。本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节催化水解磷脂制备相应游离脂肪酸的酶对应编码基因的表达，赋予宿主漆酶的高表达性，为扩大磷脂酶C的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与水解磷脂制备相应 游离脂肪酸中的磷脂酶C(Laccase)，编码这个酶的基因及其应用。

(二)背景技术

冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鳞翅目 (Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫 尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具 有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。 冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认 为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸 痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节 阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、 抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。

冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢 子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫 夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无 性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中 国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成 分和药效。

但是，对冬虫夏草中国被毛孢中磷脂酶C的研究几乎为空白，尤其在参与中国被 毛孢水解磷脂制备相应游离脂肪酸中的磷脂酶C的研究上。

磷脂酶是在生物体内存在的可以水解甘油磷脂的一类酶,其中主要包括磷脂酶 A1、AC、B、C和D，它们特异地作用于磷脂分子内部的各个酯键，形成不同的产物， 被广泛用于甘油磷脂的改造。磷脂酶C(EC:3.1.4.3)可以催化PIP2分解产生1,4,5-肌 醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)两个第二信号分子，是存在于胞浆膜上的一个 关键酶。

2001年，查纻光等人从广西产金环蛇(Bungarus fasciatus)毒腺中抽提总RNA，经 mRNA纯化后构建了金环蛇毒腺cDNA文库。根据已发表的眼蛇科蛇毒磷脂酶A[2] 基因序列中的保守区设计探针筛选克隆，得到2个磷脂酶A[2]基因。测定两者序列， 其cDNA的阅读框均为435bp，编码145个氨基酸的磷脂酶A[2]前体。

2002年，李伟琳用探针从紫红链霉菌2917基因组文库中克隆出磷脂酶A3基因， 经双向测序，确定了其基因的全序列，并由此推导出其氮基酸序列，将此序列与其他 来源的磷脂酶A2基因序列进行了比较研究，结果显示，与天蓝色链霉菌A3(2)中磷 脂酶A2的同源性为98％，与蛇毒的磷脂酶A2的同源性小于10％。

2007年，卢冬梅等人从超嗜热需氧古细菌Aeropyrum pernix K1中抽提出染色体 基因组，经PCR扩增得到磷脂酶A2基因，用带有His-tag标记的pET15b作为表达 载体，在大肠杆菌BLP中成功地诱导表达。表达产物经过Ni.螯合柱一步得到纯化。 SDS-PAGE检测只有一条带，其准确分子量为17.871kD。

2007年，罗滟苏等人应用衔接头PCR技术，以蓝猪耳(Torenia fournieri)全基因组 DNA分别经DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和SmaⅠ消化后与衔接头连接产物为模板，用衔 接头引物和TfPLC1基因的特异引物经过多轮的巢式PCR，先后克隆到2个798和813 bp的TfPLC1基因上游序列，经测序、blast比较分析和拼接得到一个蓝猪耳TfPLC1 基因的启动子序列，共1432bp。

2010年，徐贤广等人研究牛分枝杆菌(M.bovis)溶血磷脂酶基因在致病机理中的作 用，本研究构建了表达M.bovis的溶血酶(LIP)基因的重组质粒pET30a-LIP，经IPTG 诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达，SDS-PAGE分析表明，重组蛋白表达量占菌 体总蛋白的20％，该蛋白经电洗脱纯化后，纯度达95％以上。

2011年，JS Seo等人从牙鲆的cDNA上通过cDNA末端(RACE)快速扩增克隆 到了一个磷脂酶C基因。该cDNA编码含有一个高度保守的PH结构域，催化X和Y 结构域，C2结构域1244个氨基酸长度的多肽。

2011年，Simona Antonacci等人利用设计简并引物和RT-PCR的方法扩增出了一 个270bp的DNA片段，并且利用RACE的方法分离到了一个全长为2290bp的磷脂 酶C基因，含有1765bp的开放读码框。

但是，目前NCBI数据库中目前还检索不到中国被毛孢中磷脂酶C的基因相关信 息。

(三)发明内容

本发明目的在于针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对“百令”生产菌 冬虫夏草中国被毛孢水解磷脂制备相应游离脂肪酸中的酶及其编码基因进行深入研 究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢水解磷脂制备相应游离脂肪酸中的一 种磷脂酶C、以及编码的基因及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种参与中国被毛孢水解磷脂制备相应游离脂肪酸中的磷脂酶C(Phospholipase  C)，与SEQ ID No.1所示序列具有90％以上同源性。由于氨基酸序列的特殊性，任何 含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物 活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在 90％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸 的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基 酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变， 如用色氨酸替换甘氨酸。

优选的，所述磷脂酶C氨基酸序列如SEQ ID No.1所示(记为phoC蛋白)；该酶 可催化磷脂制备相应的磷酸胆碱和甘油二酯。

本发明述磷脂酶C来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢。

由磷脂经过磷脂酶C的催化获得对应磷酸胆碱和甘油二酯的路径如下所示：

本发明还涉及所述的磷脂酶C在生物催化磷脂制备相应的磷酸胆碱和甘油二酯 中的应用，具体的，所述应用为：将含磷脂酶C基因的重组工程菌经诱导培养后的湿 菌体用pH8.0磷酸盐缓冲液悬浮，超声细胞破碎后，将破碎混合液离心，取上清液为 催化剂，以磷脂溶液为底物，于pH值为7.0的缓冲液(磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液) 中，37℃下反应，反应结束后，将反应液离心，获得含磷酸胆碱和甘油二酯的混合液， 将混合液分离纯化即获得磷酸胆碱和甘油二酯(所述分离纯化的方法为本领域公知操 作，通常采用亲和层析技术进行)；所述磷脂溶液按如下步骤制备：将大豆磷脂用丙 酮洗涤进行脱油处理，真空脱溶后，获得无油大豆磷脂；将无油大豆磷脂、质量浓度 0.5％聚乙烯醇(PVA)溶于pH值7.0的缓冲液中，在10000r/min的条件下均质3min， 得到磷脂溶液；所述0.5％PVA的体积用量以无油大豆磷脂质量计为3.33mL/g，所述 磷脂溶液中无油大豆磷脂的终浓度为50g/L。

所述磷脂溶液的用量以无油大豆磷脂质量计，所述无油大豆磷脂的初始浓度为 48g/L(终浓度)，所述催化剂的用量以超声破碎前湿菌体的质量计为0.9g/L(终浓度)。

所述催化剂按如下方法制备：将含磷脂酶C基因的重组工程菌接种于含终浓度 50μg/ml的Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养过夜，取1mL培养物， 将其转接(接种量为体积浓度2％)于50mL含有50μg/ml Kan抗性的LB液体培养基 中，37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600为0.6～0.8，向培养物中加入终浓度 0.05mmol/L的IPTG诱导培养8h，收集湿菌体，将湿菌体在功率40％、破1s停1s 条件下超声破碎(优选3次，每次5min)，离心，取上清液即为催化剂。

本发明还涉及编码磷脂酶C的基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2 所示(记为phoC基因；phoC基因编码phoC蛋白)。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该 多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是 指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变 位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所 知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失 或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

所述的基因可用于构建能够生物催化磷脂制备相应的磷酸胆碱和甘油二酯的基 因工程菌，以扩大磷脂酶C的应用，具体为：构建含有所述磷脂酶C基因的重组载 体，将所述重组载体转化至大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3))中，获得的重组基 因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有磷脂酶C基因的菌体细胞。

本发明的要点在于提供了SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.2所示 的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸 序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易 见的。

能够提供本发明所述冬虫夏草磷脂酶C及其编码基因的菌株为中国被毛孢 (Hirsutella sinensis)L0106，该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC No：M2011278，已在先前申请的专利CN102373190A中披露。

本发明的有益效果主要体现在：本发明从原理上对催化磷脂制备相应的磷酸胆碱 和甘油二酯进行了详细研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与水解磷 脂制备相应游离脂肪酸中的磷脂酶C及其编码基因，本发明所提供的核苷酸序列的克 隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节催化苯 二酚制备相应的苯醌的酶对应编码基因的表达，赋予宿主磷脂酶C的高表达性，为扩 大磷脂酶C的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。

(四)附图说明

图1为“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢总RNA的甲醛变性凝胶电泳图；

图2为中国被毛孢磷脂酶C蛋白三级结构图；

图3为磷脂酶C基因PCR扩增产物凝胶电泳图；

图4为克隆载体pMD18-T Vector与表达载体pET-28a物理图谱；

图5为重组克隆质粒pMD18-T/phoC物理图谱；

图6为重组表达质粒pET-28a/phoC构建过程示意图；

图7为重组表达质粒pET-28a/phoC物理图谱；

图8为磷脂酶C蛋白的SDS-PAGE图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：

实施例1：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的培养

菌株来源：首先从青海采集天然冬虫夏草，并将其带回杭州进行分离筛选，得到 了L0106菌株，并经菌种鉴定该菌株为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，该菌种保藏 在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2011278，已在先前申请的 专利CN102373190A中披露。

将该菌种接种于斜面，培养基配方(此为固化之前的液体配方，按下述比例配制 好之后再制成斜面)为：葡萄糖2.0％(w/v，1％表示100mL培养基中含有1g，下同)、 玉米粉1.0％、土豆汁0.5％、糊精0.5％、酵母粉0.5％、麸皮1.0％、蚕蛹粉2.0％、蛋 白胨1.0％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、琼脂粉1.0％，余量为水；在12～16℃ 培养25天；然后将菌种接种于发酵培养基，培养基配方为葡萄糖1.0％、糖蜜1.0％、 蚕蛹粉0.5％、黄豆饼粉1.0％、酵母膏0.5％、硫酸镁0.01％、磷酸二氢钾0.02％，余 量为水；置于摇床上，温度12～16℃培养25天，培养结束后在无菌条件下，进行固 液分离，并将固体置于无菌器具，备用。

实施例2：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢总RNA的提取

用TRIzol试剂提取总RNA，步骤具体为：

1)液氮研磨：取1g新鲜菌体放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状，分 装到预冷的1.5mL离心管中，加入1mL TRIzol试剂，混匀，冰上静置5min，使核酸 蛋白复合物完全分离。

2)RNA分离：加入0.2mL氯仿，用力震荡混匀15s，冰上静置2～3min，4℃、 12000rpm离心15min，分层，取上层水相，约600μL。

3)RNA沉淀：加入500μL异丙醇，在冰上静置10min，4℃、12000rpm离心10min， 弃上清。

4)RNA洗涤：加入1mL75％(v/v)乙醇，将沉淀悬起，冰上静置10min，4℃、 7500rpm离心15min；重复上面洗涤步骤，再洗一遍。

5)溶解RNA：将离心管置于冰上敞开干燥5～10min，加适量DEPC水溶解。

实施例3：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA样品测序

提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentation  buffer将mRNA打断成短片段(200～700bp)，以mRNA为模板，用六碱基随机引物 (random hexamers)合成第一条cDNA链，然后合成第二条cDNA链，再经过QiaQuick  PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然 后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用 Illumina GA IIx进行测序。测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据， 即raw data或raw reads。除去原始测序reads中只含adaptor序列的reads，备以后续 分析。

实施例4：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA短读序列组装

使用短reads组装软件SOAPdenovo(Li,Zhu et al.De novo assembly of human  genomes with massively parallel short read sequencing[J].Genome Res,2010,20: 265-272.)做转录组从头组装。SOAPdenovo首先将具有一定长度overlap的reads连 成更长的不含N的Contig片段。然后将reads比对回Contig，通过paired-end reads 确定来自同一转录本的不同Contig以及这些Contig之间的距离，SOAPdenovo将这些 Contig连在一起，中间未知序列用N表示，这样就得到Scaffold。进一步利用paired-end reads对Scaffold做补洞处理，最后得到含N最少，两端不能再延长的Unigene序列。 最后，将Unigene序列与蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比对 (evalue<0.00001)，取比对结果最好的蛋白确定Unigene的序列方向。如果不同库之 间的比对结果有矛盾，则按nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的优先级确定Unigene的 序列方向，跟以上四个库皆对比不上的Unigene用软件ESTScan(Iseli,Jongeneel et al. ESTScan:a program for detecting,evaluating,and reconstructing potential coding regions  in EST sequences[J].In Proceedings of9th International Conference on Intelligent  Systems for Molecular Biology.AAAIPress,Menlo Park,CA,pp.1999,138-148.)预测其 编码区并确定序列的方向。对于能确定序列方向的Unigene给出其从5'到3'方向的序 列，对于无法确定序列方向的Unigene给出组装软件得到的序列。

实施例5：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢Unigene功能注释

功能注释信息给出Unigene的蛋白功能注释、Pathway注释、COG功能注释和Gene  Ontology(GO)功能注释。首先，通过blastx将Unigene序列比对到蛋白数据库nr、 Swiss-Prot、KEGG和COG(evalue<0.00001)，得到跟给定Unigene具有最高序列相 似性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。根据KEGG注释信息能进一 步得到Unigene的Pathway注释。将Unigene和COG数据库进行比对，预测Unigene 可能的功能并对其做功能分类统计。根据nr注释信息，使用Blast2GO软件(Conesa, Gotz et al.Blast2GO:a universal tool for annotation,visualization and analysis in  functional genomics research[J].Bioinformatics,2005,21(18):3674-3676.)得到Unigene 的GO注释信息。得到每个Unigene的GO注释后，用WEGO软件(Ye,Fang et al. WEGO:a web tool for plotting GO annotations[J].Nucleic Acids Research,2006,34: 293-297.)对所有Unigene做GO功能分类统计，从宏观上认识该物种的基因功能分 布特征。

实施例6：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢磷脂酶C蛋白三级结构的分析

图2是中国被毛孢磷脂酶C蛋白三级结构图。磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C (PI-PLC)有3个家族β、γ、δ。各种PI-PLC有类似的催化活性，主要是因为这些 酶有两个保守性相当高的氨基酸序列，分别叫X和Y区，它们大约含有150和130 个氨基酸残基。此二区在三个家族间的同源性为43％和33％，但各家族内成员间同源 性可达79％。当酶蛋白折叠，此二区靠近形成活性中心。X区位置比较恒定，Y区位 置变异较大。PI-PLC中含有SH结构域可以与其他蛋白相互作用。PI-PLC的结构图 2002年研究发现PLC的一个新构型——PLCζ，是目前发现的PLC家族中最小的亚型， 因为相比较其他亚型缺少了一个PH结构域。PLCζ同雄性不育关系密切。从中国被 毛孢转录组测序以及注释信息中检测到了磷脂酶C的Unigene。通过NCBI中的ORF Finder软件在线检测，找出了这个基因的开放阅读框(SEQ ID No.2)并得到了相应 的蛋白质序列(SEQ ID No.1)。

实施例7：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢磷脂酶C基因引物设计

运用GENE RUNNER引物设计软件根据预测得到的各基因开放阅读框DNA序列 设计引物，用于克隆“百令”生产菌中国被毛孢水解磷脂制备相应游离脂肪酸的磷脂 酶C基因，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如下所列：

phoC基因：正向引物5’AGAGAATTCATGTCCACCCAGAGCGTCCT3’

反向引物5’AGCAAGCTTTCATTGGTAAGAAACGCTG3’

phoC基因长度为1500bp。

实施例8：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢cDNA第一链的制备

先按照实施例1提供的方法培养出中国被毛孢发酵菌丝体后，再按照实施例2所 提供的方法对中国被毛孢进行总RNA的提取，得到总RNA后按下述进行“百令”生 产菌冬虫夏草中国被毛孢cDNA第一链的合成，用于后续各基因克隆实验。

采用PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa)从Total RNA中 反转录合成cDNA第一链，实验步骤如下：

1)在Microtube管中配制下列混合液。

2)变性、退火操作有利于模板RNA的变性以及反转录引物和模板的特异性退火， 可提高反转录反应效率，所以在PCR仪上进行变性、退火反应，条件设置如下：

65℃，5min

3)退火结束后离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。

4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

5)在PCR仪上按下列条件进行反转录反应。

42℃   15～30min

70℃   15min

一般情况，在真核生物mRNA3’末端都有一个PolyA结构，A碱基的数量在十至 几百个不等，利用这一结构可以利用Oligo(dT)引物，在反转录酶的作用下，以mRNA 为模板合成cDNA第一链，本发明采用由TaKaRa独自开发的dT区域的序列 (PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit中提供)为引物，如果获得的mRNA完整 性较好，那么通过逆转录过程可以得到物种中所有酶蛋白编码基因的cDNA第一链。

实施例9：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢磷脂酶C基因的克隆、表达以及蛋白 活力的检测

1、磷脂酶C基因的PCR扩增

以实施例8中得到的cDNA第一链为模板，用实施例7中合成的磷脂酶C基因引物： 5’AGAGAATTCATGTCCACCCAGAGCGTCCT3’和5’AGCAAGCTTTCATTGGTAA GAAACGCTG3’进行Pfu DNA聚合酶PCR扩增反应，条件设置如下：

Pfu PCR扩增反应体系：

Pfu DNA Ploymerase PCR扩增条件：

2、磷脂酶C基因PCR产物凝胶电泳检测

具体检测方法为：

1)将配制好的0.9％的琼脂糖凝胶用微波炉加热使其溶解均匀；

2)取15mL凝胶，待琼脂糖凝胶冷却至50℃左右时，加入1μL染色液Gold view， 混合均匀后倒入电泳琼脂糖凝胶板上，除去气泡后插入点样梳；

3)琼脂糖凝胶板上凝胶凝固后，小心取出点样梳，将胶板放入电泳槽中(点样孔 一端靠近电泳槽的负极)，在电泳槽中加入TAE电泳缓冲液；

4)取5μL样品然后加入6×Loading Buffer1.5μL和ddH2O4μL混合后用移液枪上 样，上样量为10μL；

5)连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色；

6)开启电源，开始电泳，最高电压不超过5V/cm；

7)当样品跑过胶板的2/3时可终止电泳；

8)切断电源后，将琼脂糖凝胶板上凝胶取出放入凝胶成像仪中观察、拍照。

转录组测序预测磷脂酶C基因的大小为1500bp，琼脂糖凝胶电泳结果表明已成 功扩增出了磷脂酶C基因，大小约为1500bp。图3为“百令”生产菌中国被毛孢磷 脂酶C功能基因PCR产物凝胶电泳图。

3、磷脂酶C基因PCR产物的加碱基A处理以及纯化

由于Pfu DNA聚合酶PCR产物末端为平端，所以在胶回收后还需进行加碱基A 处理、纯化后才可用于T载体连接。胶回收产物加碱基A体系如下：

PCR仪中72℃加A碱基20min，最后用AxyPrep PCR清洁试剂盒纯化。

4、磷脂酶C基因与克隆载体的连接

克隆载体pMD18-T Vector购自TaKaRa公司(TaKaRa code D101A)，其物理图谱 见图4，将步骤3纯化后的磷脂酶C基因与克隆载体连接构建重组质粒 pMD18-T/phoC，物理图谱见图5，连接体系和连接条件如下。

连接体系：

连接条件：16℃，16h；灭活：65℃，15min。

5、磷脂酶C重组质粒pMD18-T/phoC的转化

将重组质粒pMD18-T/phoC转入大肠杆菌E.coli JM109中构建携带磷脂酶C基 因的重组菌E.coli JM109/pMD18-T/phoC，具体步骤为：1)将10μL反应体系(即步 骤4的连接产物)转至感受态细胞E.coli JM109中，冰浴30min；2)热击：42℃， 90s；3)冰浴：2-3min；4)加入800μL液体LB，37℃，250rpm，1h；5)涂布平板 (含Amp抗性)；6)37℃培养箱培养过夜。

6、磷脂酶C E.coli JM109/pMD18-T/phoC阳性重组菌的筛选

菌落PCR可不必提取基因组DNA，而直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进 行PCR扩增，该方法操作简便、快捷、可以快速鉴定菌落是否为含有目的质粒的阳 性菌落，在转化鉴定中较为常见。实验中，将接种到液体培养基中对应的单菌落进行 菌落PCR，以验证是否转入目的基因。首先，用牙签挑取单菌落加入含50μL无菌水 的1.5mL离心管中，沸水浴30min，然后离心以上清作为模板，进行PCR扩增，PCR 程序设定为Taq酶扩增一般程序。最后采用0.9％的琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产 物。

7、磷脂酶C重组质粒pMD18-T/phoC的测序

对菌落PCR检测出的阳性重组菌接种至液体LB培养基，37℃、150rpm培养过 夜后，取4mL菌液提取质粒，方法按AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提供的操作说明。 测序由上海桑尼生物科技有限公司完成。经测序验证，序列SEQ ID No.2已重组至 pMD18-T/phoC中。

8、磷脂酶C重组表达质粒pET-28a/phoC的构建

实验根据外源基因在大肠杆菌中表达的原则，以及表达载体pET-28a和磷脂酶C 基因酶切位点比对情况，确定了phoC用EcoRⅠ/HindⅢ双酶切位点，并对重组大肠 杆菌E.coli JM109/pMD18-T/phoC进行液体LB试管摇床培养、重组质粒提取。

磷脂酶C基因的重组质粒pMD18-T/phoC及表达载体pET-28a分别用EcoRⅠ/ HindⅢ限制性内切酶在37℃分别酶切处理6h，酶切体系如下所示：

EcoRⅠ/HindⅢ双酶切体系：

酶切结束后65℃灭活15min，然后分别用Axygen DNA凝胶回收试剂盒进行回收、 纯化。

磷脂酶C基因及表达载体pET-28a经双酶切、纯化后再用T4连接酶16℃连接过 夜，构建重组表达质粒pET-28a/phoC，其构建过程见图6，构建得到的重组表达质粒 pET-28a/phoC图谱见图7。连接体系组成如下：

连接体系：

9、磷脂酶C重组表达质粒的转化以及阳性单克隆的筛选

将构建好的表达质粒热激转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌中，然后涂布到含有 卡那霉素(Kan)抗性(终浓度50μg/ml)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。从平板上 随机挑选单菌落，以步骤7中合成的磷脂酶C基因引物进行PCR扩增，挑选阳性克 隆。

10、磷脂酶C重组菌的诱导表达

将鉴定为阳性的单克隆接种于5mL含有Kan抗性(终浓度50μg/ml)的LB液体 培养基中，37℃、250r/min培养过夜。取1mL培养物，将其转接于50mL含有Kan 抗性(终浓度50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600 约为0.6～0.8左右。向培养物中分别加入一定浓度的IPTG(终浓度0.05mmol/L)诱 导培养8h。收集菌体供电泳分析以及酶活检测。

11、磷脂酶C重组菌表达产物SDS-PAGE分析

以转入空载体的E.coli BL21(DE3)菌及未加入诱导剂IPTG的重组菌作为对照。 鉴定为阳性的重组菌经IPTG诱导培养7h后，取0.5mL诱导培养物，离心收集菌体， 重悬于50μL蒸馏水中，加入50μL上样缓冲液，混匀后煮沸10min，进行SDS-PAGE 电泳分析，图8中的“A”泳道为大肠杆菌BL21(DE3)空细胞的SDS-PAGE图，“B” 泳道为重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a加IPTG诱导后的SDS-PAGE图，“C” 泳道为重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a/phoC未加IPTG的对照SDS-PAGE图， “D”泳道即为重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a/phoC诱导表达的SDS-PAGE图。 表明重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a/phoC含磷脂酶C(经测序验证其氨基酸序 列如SEQ ID No.1所示)。

12、磷脂酶C重组菌的蛋白活力检测：

①NaOH标准溶液(0.05M)的配制：按GB601配制和标定C(NaOH)＝0.5M的标 准溶液，使用时，用去离子水准确稀释10倍。

②缓冲液的配制：0.2M磷酸氢二钠溶液与0.1M柠檬酸溶液按不同比例配制， 并在酶活测定的温度下进行微调以获得所需pH值的缓冲液。

③底物溶液的配制：(1)大豆浓缩磷脂的预处理：为获得无油的大豆浓缩磷脂， 将购得的大豆磷脂进行三次以上的丙酮洗涤进行脱油处理，真空脱溶后获得无油大豆 磷脂。(2)将0.3g无油大豆磷脂、1mL质量浓度0.5％PVA水溶液溶于5mL、pH值 不同的缓冲液中，用高速均质机在10000r/min的条件下均质3min，得到不同pH值 的底物溶液6ml。底物溶液在使用前，先37℃温度下预热5min。

酶液制备：称取步骤10收集的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a/phoC湿菌体 2g，用磷酸盐缓冲液(50mM、pH8.0)100mL悬浮，高压破碎仪(型号FS-600，上 海生析超声仪器有限公司)在功率40％、破1s停1s条件下破碎3次(35Kpa)，每次 5min，离心除去菌体，取上清，得到粗酶液78.8ml。

磷脂酶C酶活测定过程：取4个100m L高型烧杯，2个作为空白瓶，2个作为 样品瓶，各加底物溶液25m L，再于空白瓶中加入体积浓度95％乙醇水溶液15mL， 于37℃的水浴中预热5min，然后在各瓶中加入粗酶液1mL，立即混匀计时，在37 ℃的水浴中150r/min的条件振荡准确反应5min，于样品瓶中立即补加体积浓度95％ 乙醇水溶液15mL，搅拌终止反应，取出反应液，于自动滴定仪下用NaOH标准溶液 滴定，计算标准碱液平均消耗量。

磷脂酶C酶活力定义为：在特定条件下1min水解磷脂产生1微摩尔(μmo1)量游 离脂肪酸所需的酶量即为一个磷脂酶活力单位(U)。

检测磷脂酶C酶活的空白对照为煮沸20min后失活的粗酶液替代酶液。另外，同 样条件下也检测了E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21(DE3)/pET-28a诱导后的粗 酶液的活力，均未检测到磷脂酶C酶活。

利用考马斯亮蓝法测得磷脂酶C粗酶液中的蛋白含量为0.246mg/mL，通过 Bandscan软件，对SDS-PAGE中的粗酶液条带含量进行分析，磷脂酶C占总蛋白的 15.8％，故参与催化反应的磷脂酶C为0.246mg/mL×1mL×0.158＝0.0389mg。根据酶 活定义，磷脂酶C的最大比酶活为：(0.459-0.13)mL×0.05mol/L×1000/(0.0389mg×5min) ＝84.6μmo1/mg/min＝84.6U/mg。因此，磷脂酶C重组菌所表达的磷脂酶C的最大比酶 活为84.6U/mg，上述反应的转化率为63.2％。比酶活计算公式为：(V-V0)×c/(m×t)， 其中V表示滴定样品时消耗的NaOH标准溶液体积(mL)；V0表示滴定空白时消耗 的NaOH标准溶液体积(mL)；c表示NaOH标准溶液的浓度(mol/L)；m表示催化 过程中所需的磷脂酶C的酶量；t表示催化反应的时间。转化率计算公式为：转化率 ＝(初始浓度-平衡浓度)/初始浓度。