一种包含吲哚青绿的多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用

摘要

本发明提供一种多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；所述目标投递物包括抗癌药物和造影剂；所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm。该多聚体白蛋白纳米球是一种安全、稳定的生物相容性纳米载体，可以包载药物或者造影剂等目标投递物，且其储存稳定性高，有利于长时间有效、稳定地释放目标投递物；此外，该多聚体白蛋白纳米球的粒径小，且尺寸均一，分散性好；本发明还提供了该多聚体白蛋白纳米球的制备方法及应用。

说明书

本申请要求于2013年9月27日提交中国专利局的申请号为201310449770.X，其发明名 称为“一种多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用”的中国专利申请的优先权，其部分内 容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及一种多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应 用。

背景技术

纳米技术的兴起使得基于高分子纳米微粒的药物输送得到了广泛的关注，白蛋白具有可 生物降解、无毒、无抗原性等诸多特点，被认为是一个理想的药物载体。而通常单个白蛋白 分子的尺寸在几个纳米以内，不适合直接用于载药，超声乳化法和去溶剂法可制得粒径小于 1μm的白蛋白纳米球，可用于运载药物，但由于白蛋白分子的水溶性高，该类方法制得的白 蛋白纳米球载体的释药性能不易于控制，如何使白蛋白纳米颗粒在水中有良好的稳定性，且 在稀释条件下不溶解是目前制备技术上的难点。

戊二醛等交联剂常被用来稳定得到的纳米球，但戊二醛会非选择性的结合白蛋白表面的 氨基位点，在生物体内会释放出醛类残基，对生物体有着显著毒副作用。因此，有必要提供 一种制备安全、稳定性高的白蛋白纳米球的方法。

光学治疗是近年来发展起来的一种微创肿瘤治疗技术，受到了研究者的广泛关注。目前， 光学试剂根据材质的不同可分为无机和有机光学试剂两大类。无机光学治疗试剂存在难降解、 体内有残留的局限。有机光学试剂因具有良好的生物相容性、体内易降解而受到研究者的广 泛关注。

常见的有机光学试剂有二氢卟吩和吲哚菁绿，二氢卟吩e6(chlorin e6,Ce6)作为第二代声 敏剂具有无毒、肿瘤组织高选择性及非肿瘤组织清除率高等优点，在光照和氧存在下能够产 生单线态氧和/或自由基而用于肿瘤的光动力学治疗。但是，二氢卟吩e6不溶于水，稳定性 差，无法制成水溶液体系，即使先用有机溶剂溶解，然后分散在水溶液中，也是以悬浊液形 式存在，很难被细胞有效地摄取；而且，有机溶剂本身对细胞也存在一定的毒性。吲哚菁绿 (ICG)是一种具有近红外特征吸收峰的三碳花菁染料，在光照和氧存在下能够产生单线态氧和 /或自由基而用于肿瘤的光动力学治疗，同时可将吸收的光能部分转化为热能而用于肿瘤的光 热治疗。ICG也是目前唯一被美国食品药品管理局(FDA)和中国食品药品监督管理总局 (SFDA)批准临床使用的近红外染料，具有生物相容性好，代谢途径明确等优点。但作为一 种有机小分子，ICG在光学治疗过程中也存在不稳定、易分解、缺乏肿瘤主动靶向性等不足。 因此，如何提高Ce6的亲水性和稳定性以及ICG的稳定性和靶向性，使Ce6和ICG快速、 有效地进入细胞以提高光学治疗的疗效是目前研究的热点。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球，该多聚体白蛋白纳米球包括 含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，在稀释条件下 有较高的稳定性；此外，该多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm，且其尺寸均一，分散 性好，是运载药物或造影剂等目标投递物的良好载体，有利于在患者体内长时间有效、安全、 稳定地释放投递物；本发明还提供了一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法和应用。

第一方面，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯 基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白 纳米球的粒径为10～1000nm。

优选地，所述含巯基和/或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清 白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。

优选地，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物。

进一步优选地，所述目标投递物为抗癌药物和造影剂中的至少一种。

进一步优选地，所述抗癌药物为铂及铂的配合物、5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六 羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2’R,3’S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯] (紫杉醇)、(7S：9S)-9-羟乙酰基-4-甲氧基-7,8,9,10-四氢-6,7,9,11-四羟基-7-0-(2’,3’,6’,-三去氧 -3’-氯基-a-1-来苏已吡喃基)-5,12-萘二酮(阿霉素)、(E,E)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1,6- 庚二烯-3,5-二酮(姜黄素)、1,3,5,8-四甲基-2,4-二(a-羟乙基)卟酚-6,7-二丙酸(血卟啉)、4-乙 基-4，12-二氧-4-羟-1H-吡喃(3'，4'，6，7)吡吲哚(1，2-6)喹啉-3，14-二酮(喜树碱)、 (2S-反式)-18-羧基-20-(羧甲基)-13-乙基-2,3-二氢3,7,12,17-四甲基-8-乙烯基-21H,23H-卟吩-2- 丙酸(二氢卟吩e6)、IR700碘化物和11-氯-1,1'-二正丙基-3,3,3',3'-四甲基-10,12-三亚甲基吲 哚三碳花青碘盐(IR780)中的至少一种。

进一步优选地，所述造影剂为2,7-双[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1,3,5-庚三烯单 钠盐(吲哚青绿)、对-[(2,4-二氨基喋啶-6)-N-甲基甲氨基]苯甲酰谷氨酸(甲氨蝶呤)、3,7-双 (二甲氨基)吩噻嗪-5-翁氯化物(美蓝)、6,6'-[[3,3'-二甲基(1,1'-二苯基)-4,4'-二基]双(偶氮基)] 双(4-氨基-5-羟基-1,3-萘二磺酸)四钠盐(伊文思蓝)、2-((4-二乙氨基)苯)(4-(二乙氨基)环己烷 -2,5-二烯)甲烷)苯基-1,4-二磺酸盐(异硫蓝)、4,4'-双(二乙氨基)三苯脱水甲醇-2'',4''-二磺酸单 钠(专利蓝)和金属纳米粒子中的至少一种。

由于白蛋白单体分子易溶性，物理方法团聚的白蛋白纳米球容易解体，纳米球中包载的 药物很容易被过早地释放，不利于药物等目标投递物在人体循环系统内的运输，即物理方法 团聚的白蛋白纳米球载体的释药性能的可控性不高，而本发明提供的多聚体白蛋白纳米球由 多个白蛋白单体分子通过分子间的二硫键相互连接，这种化学键稳定的多聚体结构比通过物 理方法聚集的蛋白纳米球更稳定，不易被人体体液稀释、溶解而解体，有助于保证靶向部位 足够的给药浓度。

在生物医学应用中，纳米粒子药物的粒径比较重要，不同的粒径代谢路径也不一样，小 粒径通过肾代谢，大粒径通过肝代谢；其中，20～200nm的粒子对肿瘤有被动靶向作用，在此 粒径范围内的纳米粒子药物可以降低药物本身的毒副作用，同时也增加了疗效。

此外，纳米粒子药物的分散性是比较重要的，分散性不好，粒子容易团聚，甚至沉淀， 导致应用较为困难，特别是其生物医学应用，分散性尤其重要。

本发明提供的多聚体白蛋白纳米球粒径小且尺寸均一，分散性好，用该纳米球包括投递 药物在生物医学应用有较大优势，有利于纳米球通过EPR效应进入肿瘤内部并通过gp60通 路靶向到肿瘤细胞。

另外，一般自由蛋白质分子的分子量大都小于60KDa，本发明提供的多聚体白蛋白纳米 球由多个白蛋白单体分子聚集而成，分子量高于60KDa，不易被肾小球滤过(由于肾小球的 滤过作用下，一般分子量小于60KDa的蛋白质分子会在代谢的过程中被清除掉，而不能达到 靶向位置)，能提高药物等目标投递物的投递效率。

第二方面，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备体积质量浓度为0.01～300mg/mL的含巯基和/或二硫键的白蛋白水溶液，并调 节所述白蛋白水溶液的pH值为7～12；

(2)向步骤(1)所得的所述pH值为7～12的白蛋白水溶液中加入带巯基的还原剂得反 应液，然后在0～60℃下轻轻摇动反应0.05～12小时，在所述反应液中，所述带巯基的还原剂 的摩尔数为白蛋白摩尔数的10～5000倍；

(3)将步骤(2)反应后的溶液在0～60℃的条件下进行超声，所述超声的功率范围为 1～100KW，同时在搅拌的条件下在所述进行超声的溶液中以0.01～1000ml/s的速度加入有机 溶剂得到微乳溶液，所述微乳溶液在0～60℃的条件下反应5～240min后，静置分层，然后去 除有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液，其中，所述有机溶剂加入的体积为所述步 骤(2)反应后的溶液的1～100倍；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在0～60℃以及pH值为7～12 的条件下进行透析，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理，得到多聚体白蛋 白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子 之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm。

优选地，所述步骤(1)中，所述含巯基和/或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛 血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。

优选地，所述步骤(1)中，所述白蛋白水溶液中含有体积分数为0％～20％的二甲基亚砜、 甲醇、乙醇、丙醇和叔丁醇中的至少一种。

本发明采用的二甲基亚砜、甲醇、乙醇、丙醇或叔丁醇能提高药物或造影剂在溶液中的 溶解度，使药物或造影剂充分溶解均匀。

优选地，所述步骤(1)中，所述白蛋白水溶液中含有目标投递物，所述目标投递物的质 量为所述白蛋白质量的0.0002～0.5倍。

进一步优选地，所述目标投递物为抗癌药物和造影剂中的至少一种。

进一步优选地，所述抗癌药物为铂及铂的类似物、紫杉醇、阿霉素、姜黄素、血卟啉、 喜树碱、二氢卟吩e6、IR700碘化物和IR780中的至少一种。

进一步优选地，所述造影剂为吲哚青绿、甲氨蝶呤、美蓝、伊文思蓝、异硫蓝、专利蓝 和金属纳米粒子中的至少一种。

本发明采用的二甲基亚砜、甲醇、乙醇、丙醇或叔丁醇还能提高目标投递物(如药物或 造影剂)在溶液中的溶解度，使目标投递物与蛋白质充分溶解并混合均匀，且目标投递物与 白蛋白分子可以充分接触，为下一步超声过程中白蛋白包载目标投递物做准备。

优选地，所述步骤(2)中，所述带巯基的还原剂为谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇或二 硫苏糖醇。

优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇和叔丁醇中的至少一种。

进一步优选地，所述有机溶剂中还含有二甲基亚砜、三氯甲烷、二氯甲烷和正己烷中的 至少一种。

优选地，步骤(2)所述反应液在4～60℃下轻轻摇动反应，步骤(3)中步骤(2)反应 后的溶液在4～60℃的条件下进行超声，所述微乳溶液在4～60℃的条件下反应5～240min，步 骤(4)所述含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在4～60℃下进行透析。

优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液的 2～50倍。

更优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液 的2～20倍。

优选地，所述步骤(4)中，所述进行透析的方法为：先将步骤(3)所得的含多聚体白 蛋白纳米球的悬浊液置于pH值为7～12的PBS缓冲液中透析10～300小时，然后在双蒸水内 透析12小时，得到含多聚体白蛋白纳米球的溶液。

本发明采用pH值为7～12的PBS缓冲液进行透析，一方面可以去除多聚体白蛋白纳米球 的悬浊液中的无机小分子等杂质，另一方面，在碱性条件下，某些存在于多聚体白蛋白纳米 球之间的二硫键断开，然后和各自纳米球中的蛋白质分子形成新的二硫键，从而使得聚集的 多聚体白蛋白纳米球分离，达到分散多聚体白蛋白纳米球的目的，进而形成单个的分散的多 聚体白蛋白纳米球。

如本文所述的，所述单个的分散的多聚体白蛋白纳米球为粒径范围在10～1000nm之间的 多聚体白蛋白纳米球。碱性条件下透析处理之前，有些多聚体白蛋白纳米球之间会团聚，导 致团聚后的纳米球的粒径偏大，经过碱性条件下透析处理后，团聚的纳米球得到分散，形成 粒径更小的纳米球。

本发明采用pH值为7～12的缓冲液进行透析，一方面可以去除纳米探针的悬浊液中的无 机小分子等杂质，更重要的是，团聚的纳米探针在碱性条件下能分散为粒径更小的纳米球， 从而获得分散、粒径均匀的多聚体白蛋白纳米球。

优选地，所述步骤(5)中，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物。

优选地，所述对步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理的方式为： 将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于0～-20℃下预冻1～48小时后转移至-20～-80℃ 下冷冻2～48小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥12～120小时。

本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法，采用了边超声边将有机溶剂(乙醇或含 氯仿等非极性溶剂的乙醇)注入白蛋白溶液的超声乳化-去溶剂法的方式制备纳米球，一方面， 乙醇等有机溶剂注入白蛋白溶液时能将蛋白质分子析出，与此同时，白蛋白分子间因二硫键 的形成而聚集形成多聚体白蛋白纳米球。另一方面，控制好超声功率的大小和乙醇等有机溶 剂的注入速度，可以控制所制备的多聚体白蛋白纳米球的粒径。这是因为，当超声功率大， 乙醇等有机溶剂的注入速度大，所得的多聚体白蛋白纳米球的粒径就小；反之，当超声功率 小，乙醇等有机溶剂的注入速度小，所得的多聚体白蛋白纳米球的粒径就大。因此，本发明 提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法不但能获得多聚体白蛋白纳米球，而且能得到粒径可 控的多聚体白蛋白纳米球，本发明提供的方法可以制备出粒径在10～1000nm之间的多聚体白 蛋白纳米球。

此外，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法，将白蛋白水溶液和目标投递物先 充分混合，使得白蛋白在包载目标投递物之前就与目标投递物充分接触，能提高白蛋白包载 目标投递物的效率。

第三方面，本发明提供了如第一方面所述的多聚体白蛋白纳米球或如第二方面所述的多 聚体白蛋白纳米球的制备方法在制备预防、治疗或诊断癌症的药物中的应用。

如本文所用的，“癌症”包括肿瘤。

本发明提供了的多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用具有如下有益效果：

(1)本发明提供的多聚体白蛋白纳米球由不同的白蛋白分子通过分子之间二硫键相互连 接形成纳米球团，在水、磷酸盐缓冲液、乙醇、血清或培养基等溶剂稀释条件下，比物理结 合的白蛋白载体具有更高的稳定性；

(2)与使用化学交联剂如戊二醛等稳定的白蛋白载体相比，本发明提供的白蛋白纳米球 采用了蛋白质分子本身的二硫键来获得稳定的纳米球，因此本发明提供的白蛋白纳米球更加 安全；

(3)本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm，且其尺寸均一，分散性好， 是运载药物或造影剂等目标投递物的良好载体，有利于在患者体内长时间有效、安全、稳定 地释放投递物；

(4)本发明提供的多聚体白蛋白纳米球可用于制备预防、治疗或诊断癌症的药物。

第四方面，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯 基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，

所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；

所述目标投递物包括抗癌药物和造影剂；

所述抗癌药物包括(2S-反式)-18-羧基-20-(羧甲基)-13-乙基-2,3-二氢3,7,12,17-四甲基-8-乙 烯基-21H,23H-卟吩-2-丙酸(二氢卟吩e6)；

所述造影剂包括2,7-双[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1,3,5-庚三烯单钠盐(吲哚青 绿)；

所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm。

如本文所用的，“吲哚青绿”又称吲哚菁绿。

优选地，本发明所采用的ICG优选为医用等级的无残留碘的ICG。

如本发明所述的，“多聚体白蛋白纳米球”由白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，由于 单体白蛋白分子中含有至少一个巯基或二硫键，若该白蛋白单体分子中的巯基或二硫键在形 成多聚体白蛋白纳米球时没有发生反应，则有可能保留在了多聚体白蛋白球中，因此，本发 明提供的多聚体白蛋白纳米球可含有巯基、二硫键、或者同时含有巯基和二硫键，即本发明 提供的多聚体白蛋白纳米球可含有巯基和/或二硫键。

优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为60～200nm。

优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为400～500nm。

优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为200～300nm。

优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为300～400nm。

优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为500～700nm。

优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为700～1000nm。

如本文所述的，所述多聚体白蛋白纳米球中包裹目标投递物指所述多聚体白蛋白作为载 体，包载所述目标投递物。

优选地，所述多聚体白蛋白包载目标投递物的方式为：部分目标投递物被所述白蛋白分 子包裹，剩余部分的目标投递物镶嵌在所述白蛋白分子间。

更优选地，所述二氢卟吩e6被所述白蛋白分子包裹，所述吲哚菁绿部分被所述白蛋白分 子包裹，剩余部分镶嵌在所述白蛋白分子间。

优选地，所述含巯基和/或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清 白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。

优选地，所述目标投递物的质量为所述含巯基和/或二硫键的白蛋白质量的0.0002～0.5倍。

优选地，所述目标投递物的质量为所述含巯基和/或二硫键的白蛋白质量的0.0008～0.5倍。

优选地，所述目标投递物的质量为所述含巯基和/或二硫键的白蛋白质量的0.008～0.5倍。

白蛋白是一种生物内源性蛋白，具有可生物降解、无毒等优点，但是白蛋白在稀释条件 下会溶解，在生物体内不稳定，不能有效负载药物分子进入靶器官。

本发明多聚体白蛋白包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过 二硫键相互连接，多聚体白蛋白稳定性良好，可以在水溶液中稳定存在，可以作为良好的药 物载体。

本发明将疏水性二氢卟吩e6包载在亲水性的多聚体白蛋白中，可以提高二氢卟吩e6 (Ce6)的水溶性，有助于二氢卟吩e6快速、有效地进入细胞以提高光动力学治疗的疗效。 本发明多聚体白蛋白纳米球可以稳定存在于生物体内血液循环系统中，从而避免二氢卟吩e6 在血液循环系统传输过程中的无效释放；同时，由于肿瘤组织的生长失控增加了大分子类物 质和脂质粒子的选择性、高通透性和滞留性(EPR效应)，为多聚体白蛋白纳米球提供了一种 被动靶向肿瘤组织的能力；肿瘤组织细胞膜表面富含gp60、gp30和gp18等白蛋白受体，为 多聚体白蛋白纳米球提供了一种主动靶向肿瘤组织的能力，从而提高了多聚体白蛋白纳米球 的靶向性。

吲哚菁绿(ICG)是目前唯一被美国食品药品管理局(FDA)和中国食品药品监督管理总局 (SFDA)批准临床使用的近红外染料，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球中含有ICG，因此， 本发明提供的多聚体白蛋白纳米球能作为荧光活体成像以及光声成像探针，具有生物相容性 好，代谢途径明确等优点。

然而，作为一种有机小分子，ICG在临床应用过程中也存在不稳定、易分解、缺乏肿瘤 主动靶向性等不足。

本发明采用二硫键稳定的多聚体白蛋白纳米球包载ICG，可以避免ICG在血液循环系统 传输过程中的无效释放和分解，提高ICG在生物体内血液循环系统中的稳定性。

此外，ICG是一种具有近红外特征吸收峰的三碳花菁染料，在光照和氧存在下能够产生 单线态氧和/或自由基而用于肿瘤的光动力学治疗，同时可将吸收的光能部分转化为热能而用 于肿瘤的光热治疗，因此，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球还可用于癌症、肿瘤的光动力 学、光热治疗。

所述多聚体白蛋白纳米球还具有良好的近红外荧光和光声成像能力，可用于实时、无创 地监测治疗前纳米粒子在体内的输送行为，光动力治疗后可通过成像对疗效进行实时评估， 实现成像引导的光动力学治疗。

本发明多聚体白蛋白纳米球粒径较小，粒子分散性良好。

第五方面，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备体积质量浓度为0.01～300mg/mL的含巯基和/或二硫键的白蛋白水溶液，并调 节所述白蛋白水溶液的pH值为7～12；

其中，所述白蛋白水溶液中含有目标投递物；

所述目标投递物包括抗癌药物和造影剂；

所述抗癌药物包括(2S-反式)-18-羧基-20-(羧甲基)-13-乙基-2,3-二氢3,7,12,17-四甲基-8-乙 烯基-21H,23H-卟吩-2-丙酸；

所述造影剂包括2,7-双[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1,3,5-庚三烯单钠盐；

(2)向步骤(1)所得的所述pH值为7～12的白蛋白水溶液中加入带巯基的还原剂得反 应液，然后在0～60℃下轻轻摇动反应0.05～12小时，在所述反应液中，所述带巯基的还原剂 的摩尔数为白蛋白摩尔数的10～5000倍；

(3)将步骤(2)反应后的溶液在0～60℃的条件下进行超声，所述超声的功率范围为 1～100KW，同时在搅拌的条件下在所述进行超声的溶液中以0.01～1000ml/s的速度加入有机 溶剂得到微乳溶液，所述微乳溶液在0～60℃的条件下反应5～240min后，静置分层，然后去 除有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液，其中，所述有机溶剂加入的体积为所述步 骤(2)反应后的溶液的1～100倍；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在0～60℃以及pH值为7～12 的条件下进行透析，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理，得到多聚体白蛋 白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子 之间通过二硫键相互连接，

其中，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；

所述目标投递物包括抗癌药物和造影剂；

所述抗癌药物包括(2S-反式)-18-羧基-20-(羧甲基)-13-乙基-2,3-二氢3,7,12,17-四甲基-8-乙 烯基-21H,23H-卟吩-2-丙酸；

所述造影剂包括2,7-双[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1,3,5-庚三烯单钠盐；

所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm。

优选地，所述ICG与Ce6的质量比为1:0.02～50。

优选地，所述步骤(1)中，所述含巯基和/或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛 血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。

优选地，所述步骤(1)中，所述目标投递物的质量为所述含巯基和/或二硫键的白蛋白 质量的0.0002～0.5倍。

进一步优选地，所述目标投递物的质量为所述含巯基和/或二硫键的白蛋白质量的 0.0008～0.5倍。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述目标投递物的质量为所述含巯基和/或二硫键的 白蛋白质量的0.008～0.5倍。

优选地，所述步骤(2)中，所述带巯基的还原剂的摩尔数为白蛋白摩尔数的10～100倍。

优选地，所述步骤(2)中，所述带巯基的还原剂的摩尔数为白蛋白摩尔数的100～2500 倍。

优选地，所述步骤(2)中，所述带巯基的还原剂为谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇或二 硫苏糖醇。

优选地，所述步骤(2)中，所述带巯基的还原剂的浓度为0.01～2mol/L。

优选地，所述步骤(3)中，所述超声的功率范围为50～100KW。

优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇和叔丁醇中的至少一种。

可替代的，本发明步骤(3)中所述的对溶液进行超声的目的是为了增加溶液中白蛋白、 目标投递物的分散性，并使之充分接触，该超声步骤可以采用行业内其他混合方式，比如搅 拌。

可替代的，所述步骤(3)中，所述反应后的微乳溶液可以不经过去除有机相的步骤就能 得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液。静置分层是当采用的有机溶剂与水互不相溶时，才需 要进行静置分层，并去除掉，相反，如果采用乙醇等与水互溶的有机溶剂，是不需要静置分 层，去除有机相的步骤的。

进一步优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂中还含有二甲基亚砜、三氯甲烷、二氯 甲烷和正己烷中的至少一种。

优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂中含有目标投递物，所述目标投递物为二氢卟 吩e6和ICG。

本发明可在步骤(1)的白蛋白溶液中加入目标投递物；可替代的，还可以在步骤(3) 的有机溶剂中加入目标投递物；可替代的，可以同时在步骤(1)的白蛋白溶液中，以及步骤 (3)的有机溶剂中加入目标投递物。

在步骤(1)的白蛋白溶液中和/或步骤(3)有机溶剂中加入二氢卟吩e6时，可以再加 入二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种，以提高二氢卟吩 e6的在白蛋白溶液中和/或有机溶剂中的溶解度。

优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液的 2～50倍。

更优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液 的2～20倍。

优选地，所述步骤(3)中，所述有机溶剂的速度加入为50～1000mL/s。

本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法将有机相(有机溶剂)加入水相(白蛋白 溶液)中，可替代的，也可将水相加入有机相中。

优选地，所述步骤(4)中，所述进行透析的方法为：将步骤(3)所得的含多聚体白蛋 白纳米球的悬浊液置于pH值为7～12的缓冲液中透析，得到多聚体白蛋白纳米球溶液。

进一步优选地，所述步骤(4)中，所述用于透析的缓冲液的pH为9～12。

进一步优选地，所述步骤(4)中，所述用于透析的缓冲液为PBS缓冲液或Tris缓冲液。

进一步优选地，所述步骤(4)中，所述含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在缓冲液中的透 析时间为10～300小时。

进一步优选地，所述步骤(4)中，含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液置于pH值为7～12 的缓冲液中透析后，再置于双蒸水内透析。

更进一步优选地，置于双蒸水内透析的时间为1～24小时。

本发明采用pH值为7～12的PBS缓冲液进行透析，一方面可以去除含多聚体白蛋白纳米 球的悬浊液中的无机小分子等杂质，更重要的是，团聚的含多聚体白蛋白纳米球在碱性条件 下能分散为粒径更小的纳米球，从而获得分散、粒径均匀的多聚体白蛋白纳米球。

优选地，步骤(2)所述反应液在4～60℃下轻轻摇动反应，步骤(3)中步骤(2)反应 后的溶液在4～60℃的条件下进行超声，所述微乳溶液在4～60℃的条件下反应5～240min，步 骤(4)所述含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在4～60℃下进行透析。

本发明提供的多聚体白蛋白纳米球粒径范围在10～1000nm之间，然而，这不是同一批次 制备的纳米探针的粒径分布，相反，采用本发明提供的制备方法获得的每个批次的纳米探针 的粒径分布范围较窄，比如在20～250nm之间，因此，本发明制备的纳米探针的粒径比较均 匀，大小可控。

优选地，所述步骤(5)中，所述对步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥 脱水处理的方式为冷冻干燥、喷雾干燥或减压蒸馏。

进一步优选地，所述步骤(5)中，所述冷冻干燥的步骤为：将步骤(4)所得的多聚体 白蛋白纳米球溶液置于0～-20℃下预冻1～48小时后转移至-20～-80℃下冷冻2～48小时,然后 在冷冻干燥机中冷冻干燥12～120小时。

本发明通过控制含巯基和/或二硫键白蛋白和带巯基的还原剂的摩尔比，含巯基和/或二硫 键白蛋白和目标投递物的摩尔比，各步骤的pH，尤其是透析缓冲液的pH，以及有机相和水 相混合的速度获得了粒径小、粒径分布范围较窄、粒径可控的多聚体白蛋白纳米球。

本发明第五方面制得的多聚体白蛋白纳米球具有以下有益效果：

(1)无残留：采用多聚体白蛋白为载体，ICG和Ce6为光学试剂，三者均具有安全无 毒、无免疫原性、可生物降解、生物相容性好等优点。多聚体白蛋白分子间以二硫键连接， 该粒子可以稳定存在于生物体内血液循环系统中，从而避免ICG和Ce6在血液循环系统传输 过程中的无效释放，并在细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)的作用下降解并释放出单体白蛋白、 ICG和Ce6，白蛋白在体内通过自然的新陈代谢进行降解，从而不会在体内引入任何外源性 物质；

(2)靶向性好：一方面，肿瘤组织的生长失控增加了大分子类物质和脂质粒子的选择 性、高通透性和滞留性(EPR效应)，为多聚体白蛋白纳米球提供了一种被动靶向肿瘤组织的 能力；另一方面，肿瘤组织细胞膜表面富含gp60、gp30、gp18等白蛋白受体，为多聚体白 蛋白纳米球提供了一种主动靶向肿瘤组织的能力；另一方面，利用Ce6光动力治疗肿瘤后产 生的急性炎症能促使多聚体白蛋白纳米球在肿瘤部位进一步的富集。三者的结合，提高了多 聚体白蛋白纳米球的靶向性；

(3)可视化：多聚体白蛋白纳米球同时具有良好的近红外荧光和光声成像能力，可用于 实时、无创地监测光学治疗前纳米粒子体内输送行为，光学治疗后可通过成像对疗效进行实 时评估，实现成像引导的光学治疗。

本发明制备方法简单，反应条件温和，反应重现性良好，制得的多聚体白蛋白纳米球粒 径小，分散性好。

第六方面，本发明提供了如第四方面所述的多聚体白蛋白纳米球或如第五方面所述的多 聚体白蛋白纳米球的制备方法在制备预防、治疗或诊断癌症的药物中的应用。

优选地，所述应用为多聚体白蛋白纳米球或多聚体白蛋白纳米球的制备方法在制备肿瘤 光动力治疗药物、肿瘤光热治疗药物、荧光成像探针和光声成像探针中的应用。

如本文所用的，“癌症”包括肿瘤。

本发明所述多聚体白蛋白纳米球的应用具有以下有益效果：利用Ce6光动力治疗肿瘤后产 生的急性炎症能促使多聚体白蛋白纳米球在肿瘤部位进一步的富集，有助于ICG发挥光热和 光动力的同时治疗，大大抑制了肿瘤的生长。

附图说明

图1为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球的扫描电子显微镜图像；

图2为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球的透射电镜图像；

图3为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球在不同溶剂中的稀释实验；

图4为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球在还原型条件下溶解实验；

图5为本发明实施例八制得的多聚体白蛋白纳米球的扫描电子显微镜图像；

图6为本发明实施例八制得的多聚体白蛋白纳米球注射入荷瘤裸鼠后的荧光成像图；

图7为本发明实施例八制得的多聚体白蛋白纳米球注射入荷瘤裸鼠后的光声成像图；

图8为本发明实施例九制得的多聚体白蛋白纳米球用于荷瘤裸鼠光动力实验的肿瘤生长 曲线。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明 的保护范围。

实施例一

一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：

(1)取1mL体积质量浓度为0.01(w/v，mg/mL)的吲哚青绿的二甲基亚砜溶液和1mL 体积质量浓度为0.02(w/v，mg/mL)的牛血清白蛋白混合，得到白蛋白混合液，然后采用 0.1mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的pH值到7；

(2)向步骤(1)所得的所述pH值为7的白蛋白混合液中加入谷胱甘肽得反应液，然 后在0℃下轻轻摇动反应1小时，在所述反应液中，所述谷胱甘肽的摩尔数为白蛋白摩尔数 的10倍；

(3)将步骤(2)反应后的溶液在0℃的条件下进行超声，超声功率为100KW，同时在 所述进行超声的溶液中以1000mL/s的速度注入的4mL无水乙醇得到微乳溶液，所述微乳溶 液在0℃的条件下反应5min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为0℃ 的条件下，将透析袋置于5L pH为10的PBS缓冲液内透析10小时，期间每12个小时换液1 次，每次都采用5L pH为10的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析1小时， 得到多聚体白蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20℃下预冻2小时后转移至负 80℃下冷冻12小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥12小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所 述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫 键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～100nm。

为充分说明本发明实施例制备的多聚体白蛋白纳米球的有益效果，本实施例还提供了该 多聚体白蛋白纳米球的扫描电子显微镜图像，如图1所示，图1为本发明实施例一制得的多聚 体白蛋白纳米球的扫描电子显微镜图像，由该图像可知，本实施例制备的多聚体白蛋白纳米 球尺寸均一，颗粒较为分散。

本实施例还提供了该多聚体白蛋白纳米球的透射电镜(TEM)图像，如图2所示，图2为 本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球的透射电镜图像，由该图像可知，本实施例制备 的多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～100nm，尺寸均一，颗粒较为分散。

此外，本实施例还提供了该多聚体白蛋白纳米球在不同溶剂中的稀释实验，具体操作为： 将该多聚体白蛋白纳米球溶液分别溶解在磷酸盐缓冲液(pH为7.4)、血清(pH为7.4)和细 胞培养基(pH为7.4)中，随后在不同的时间点取样观察该多聚体白蛋白纳米球的粒径，结 果如图3所示。

图3为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球在不同溶剂中的稀释实验，由图3可 知：该多聚体白蛋白纳米球在磷酸盐缓冲液、血清和细胞培养基中的粒径随时间变化不明显， 即本发明提供的多聚体白蛋白纳米球能在接近生理条件下的稀释实验中稳定存在，具有医学 应用前景。

其次，本实施例还提供了该多聚体白蛋白纳米球在还原型条件下的溶解实验，具体操作 为：将该多聚体白蛋白纳米球溶液分别溶解在浓度为20mM的二硫苏糖醇，2小时，8小时和 24小时后，分别跑SDS-PAGE电泳，检测该多聚体白蛋白纳米球在还原型条件下的溶解规律， 其中，a、b、c泳道分别对应多聚体白蛋白纳米球在还原2小时、8小时、24小时后的样品，d 泳道为白蛋白单体分子的对照，结果如图4所示。

图4为本发明实施例一制得的多聚体白蛋白纳米球在还原型条件下溶解实验，由图4可知， 框1中的条带为本实施例制备的多聚体白蛋白纳米球，框2中的条带为组成该多聚体白蛋白纳 米球的白蛋白低聚物的条带，框3中的条带为组成该多聚体白蛋白纳米球的白蛋白二聚体和三 聚体的条带，框4中的条带为组成该多聚体白蛋白纳米球的白蛋白单分子的条带；该结果显示， 即白蛋白二聚体和三聚体对应的框3中的条带浓度随还原时间的延长而升高，此外，蛋白质单 体对应的框4中的条带浓度随还原时间的延长也有明显的提高；即本实施例提供的该多聚体白 蛋白纳米球可以在还原剂存在的条件下溶解，并随还原时间的延长，其二硫键被还原的程度 越高，因此，当采用该多聚体白蛋白纳米球进行药物投递时，可以被细胞中的还原性谷胱甘 肽等还原性物质降解，从而释放药物。

实施例二

一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：

(1)取0.1mL体积质量浓度为0.1(w/v，mg/mL)阿霉素的二甲基亚砜溶液和2mL体 积质量浓度为300(w/v，mg/mL)的猪血清白蛋白混合，得到白蛋白混合液，然后采用1mol /L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的pH值到7；

(2)向步骤(1)所得的所述pH值为7的白蛋白混合液中加入二硫苏糖醇得反应液， 然后在60℃下轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述二硫苏糖醇的摩尔数为白蛋白 摩尔数的5000倍；

(3)将步骤(2)反应后的溶液在60℃的条件下进行超声，超声功率为1KW，同时在 所述进行超声的溶液中以0.01ml/s的速度注入的200mL含氯仿的乙醇溶液(氯仿和乙醇的体 积比为1:9)得到微乳溶液，所述微乳溶液在60℃的条件下反应20min后，静置待微乳溶液 分层后除去有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为30℃ 的条件下，将透析袋置于1L pH为7的PBS缓冲液内透析300小时，期间每12个小时换液1 次，每次都采用1L pH为7的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析24小时， 得到多聚体白蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于0℃下预冻1小时后转移至负20℃ 下冷冻2小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚 体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互 连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为900～1000nm。

实施例三

一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：

(1)取0.5mL体积质量浓度为0.5(w/v，mg/mL)美篮的水溶液和1.5mL200(w/v， mg/mL)的重组血清白蛋白混合，得到白蛋白混合液，然后采用2mol/L的NaOH溶液调节 所述白蛋白混合液的pH值到12；

(2)向步骤(1)所得的所述pH值为12的白蛋白混合液中加入β-巯基乙醇得反应液， 然后在30℃下轻轻摇动反应12小时，在所述反应液中，所述β-巯基乙醇的摩尔数为白蛋白 摩尔数的100倍；

(3)将步骤(2)反应后的溶液在30℃的条件下进行超声，超声功率为100KW，同时 在所述进行超声的溶液中以1000ml/s的速度注入的100mL含氯仿的乙醇溶液(氯仿和乙醇 的体积比为1:9)得到微乳溶液，所述微乳溶液在30℃的条件下反应240min后，静置待微乳 溶液分层后除去有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为60℃ 的条件下，将透析袋置于1L pH为12的PBS缓冲液内透析144小时，每次都采用1L pH为 12的PBS缓冲液，期间每12个小时换液1次，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析12小 时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负4℃下预冻48小时后转移至负 50℃下冷冻48小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥96小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所 述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫 键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为100～200nm。

实施例四

一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：

(1)取1mL体积质量浓度为1(w/v，mg/mL)二氢卟吩e6溶液的二甲基亚砜溶液和 1mL300(w/v，mg/mL)的血红蛋白溶液混合，得到白蛋白混合液，然后采用0.5mol/L的 NaOH溶液调节所述白蛋白混合的pH值到9；

(2)向步骤(1)所得的所述pH值为9的白蛋白混合液中加入谷胱甘肽得反应液，然 后在60℃下轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述谷胱甘肽的摩尔数为白蛋白摩尔 数的2500倍；

(3)将步骤(2)反应后的溶液在60℃的条件下进行超声，超声功率为10KW，同时在 所述进行超声的溶液中以50ml/s的速度注入的22mL乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液 在60℃的条件下反应30min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为60℃ 的条件下，将透析袋置于1L pH为9的PBS缓冲液内透析36小时，期间每12个小时换液1 次，每次都采用1L pH为9的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析18小时， 得到多聚体白蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负10℃下预冻24小时后转移至 负80℃下冷冻24小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥120小时,得到多聚体白蛋白纳米球， 所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二 硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为600～700nm。

实施例五

一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：

(1)取2mL体积质量浓度为0.01(w/v，mg/mL)的猪血清白蛋白溶液，然后采用1mol /L的NaOH溶液调节所述白蛋白混合液的pH值到7；

(2)向步骤(1)所得的所述pH值为7的白蛋白混合液中加入半胱氨酸得反应液，然 后在60℃下轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述半胱氨酸的摩尔数为白蛋白摩尔 数的10倍；

(3)将步骤(2)反应后的溶液在60℃的条件下进行超声，超声功率为1KW，同时在 所述进行超声的溶液中以50ml/s的速度注入的4mL乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液 在60℃的条件下反应20min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为30℃ 的条件下，将透析袋置于1L pH为7的PBS缓冲液内透析10小时，期间每12个小时换液1 次，每次都采用1L pH为7的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析1小时， 得到多聚体白蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于0℃下预冻1小时后转移至负20℃ 下冷冻2小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥12小时,得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚 体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互 连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为700～800nm。

实施例六

一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：

(1)取2mL300(w/v，mg/mL)的重组血清白蛋白溶液，然后采用2mol/L的NaOH溶 液调节所述白蛋白混合液的pH值到12；

(2)向步骤(1)所得的所述pH值为12的白蛋白混合液中加入二硫苏糖醇得反应液， 然后在30℃下轻轻摇动反应12小时，在所述反应液中，所述二硫苏糖醇的摩尔数为白蛋白 摩尔数的5000倍；

(3)将步骤(2)反应后的溶液在30℃的条件下进行超声，超声功率为100KW，同时 在所述进行超声的溶液中以1000ml/s的速度注入的200mL乙醇溶液得到微乳溶液，所述微 乳溶液在30℃的条件下反应240min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为60℃ 的条件下，将透析袋置于1L pH为12的PBS缓冲液内透析300小时，每次都采用1L pH为 12的PBS缓冲液，期间每12个小时换液1次，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析24小 时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负4℃下预冻48小时后转移至负 80℃下冷冻36小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥96小时,得到多聚体白蛋白纳米球，所 述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫 键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～100nm。

实施例七

一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：

(1)取2mL150(w/v，mg/mL)的白蛋白溶液，然后采用2mol/L的NaOH溶液调节 所述白蛋白混合液的pH值到9；

(2)向步骤(1)所得的所述pH值为9的白蛋白混合液中加入β-巯基乙醇得反应液， 然后在0℃下轻轻摇动反应17小时，在所述反应液中，所述β-巯基乙醇的摩尔数为白蛋白摩 尔数的2500倍；

(3)将步骤(2)反应后的溶液在0℃的条件下进行超声，超声功率为10KW，同时在 所述进行超声的溶液中以0.01ml/s的速度注入的100mL乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳 溶液在0℃的条件下反应5min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为0℃ 的条件下，将透析袋置于1L pH为9的PBS缓冲液内透析144小时，每次都采用1L pH为12 的PBS缓冲液，期间每12个小时换液1次，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析12小时， 得到多聚体白蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20℃下预冻24小时后转移至 负50℃下冷冻48小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥120小时,得到多聚体白蛋白纳米球， 所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二 硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为700～900nm。

对比实施例一

一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：

(1)取2mL0.01(w/v，mg/mL)的牛血清白蛋白溶液；

(2)向步骤(1)所得的牛血清白蛋白水溶液中加入半胱氨酸得反应液，然后在60℃下 轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述半胱氨酸的摩尔数为白蛋白摩尔数的10倍；

(3)在所述步骤(2)所得的溶液中加入10mL无水乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳 溶液在0℃的条件下反应10min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为25℃ 的条件下，将透析袋置于5L双蒸水内透析12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20℃下预冻2小时后转移至负 80℃下冷冻24小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所 述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫 键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～600nm。

对比实施例二

一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：

(1)取1mL体积质量浓度为1(w/v，mg/mL)的吲哚青绿和1mL300(w/v，mg/mL) 的牛血清白蛋白混合，得到白蛋白混合液；

(2)向步骤(1)所得的白蛋白混合液中加入谷胱甘肽得反应液，然后在60℃下轻轻摇 动反应0.05小时，在所述反应液中，所述谷胱甘肽的摩尔数为白蛋白摩尔数的5000倍；

(3)在所述步骤(2)所得的溶液中加入10mL无水乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳 溶液在0℃的条件下反应10min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为25℃ 的条件下，将透析袋置于5L双蒸水内透析12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20℃下预冻2小时后转移至负 80℃下冷冻24小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48小时,得到多聚体白蛋白纳米球，所 述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫 键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为100～1000nm。

相对于本发明实施例提供的多聚体白蛋白纳米球，对比实施例1和对比实施例2提供的 多聚体白蛋白纳米球粒径分布集中度不高，不利于其在生物医学上的应用。

实施例八

一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：

(1)取体积质量浓度为50mg/mL(w/v)的牛血清白蛋白水溶液，然后采用0.1mol/L的 NaOH溶液调节所述白蛋白水溶液的pH值到7；

(2)向步骤(1)所得的所述pH值为7的白蛋白水溶液中加入谷胱甘肽得反应液，然 后在4℃下轻轻摇动反应2小时，在所述反应液中，所述谷胱甘肽的摩尔数为白蛋白摩尔数 的10倍；

(3)将步骤(2)反应后的溶液在4℃的条件下进行超声，超声功率为100KW，同时在 所述进行超声的溶液中以1000mL/s的速度注入乙醇溶液，该乙醇溶液中含二甲基亚砜、浓 度为1mg/mL的二氢卟吩e6和浓度为0.1mg/mL的ICG，二甲基亚砜的体积和乙醇溶液中溶 剂乙醇的体积比为1：9，得到微乳溶液，该微乳溶液在4℃的条件下反应10min后得到含多 聚体白蛋白纳米球的悬浊液；乙醇溶液加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液体积的2倍；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为4℃ 的条件下，将透析袋置于1L pH为9的PBS缓冲液内透析24小时，期间每8个小时换液1 次，每次都采用1L pH为9的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于1L双蒸水内透析12小时， 得到多聚体白蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20℃下预冻2小时后转移至负 80℃下冷冻24小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所 述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；所述目标投递物包括二氢卟吩e6和ICG，多聚 体白蛋白包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，白蛋白之间通过二硫键相互连接，多聚体白 蛋白纳米球的粒径为60～200nm。

图5为实施例8所得到的多聚体白蛋白纳米球的扫描电镜图，从图中可以看出，多聚体白 蛋白纳米球的粒径范围为60nm～200nm，粒径较小且纳米粒子分散性良好。

实施例九

一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：

(1)取浓度为200mg/mL(w/v)的猪血清白蛋白水溶液，然后采用10mol/L的NaOH溶 液调节所述白蛋白混合液的pH值到12；

(2)向步骤(1)所得的所述pH值为12的白蛋白混合液中加入二硫苏糖醇得反应液， 然后在60℃下轻轻摇动反应240小时，在所述反应液中，所述二硫苏糖醇的摩尔数为白蛋白 摩尔数的5000倍；

(3)将步骤(2)反应后的溶液在60℃的条件下进行超声，超声功率为1KW，同时在 所述进行超声的溶液中以1000ml/s的速度注入乙醇溶液，乙醇溶液中含二甲基亚砜、体积质 量浓度为2.5mg/mL的二氢卟吩e6和体积质量浓度为5mg/mL的ICG，二甲基亚砜和乙醇溶 液中的溶剂乙醇的体积比为1:9，得到微乳溶液，所述微乳溶液在60℃的条件下反应5min后， 得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；乙醇溶液加入的体积为所述步骤(2)反应后的溶液体 积的2倍；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，室温下，将透析 袋置于5L pH为12的PBS缓冲液内透析300小时，期间每12个小时换液1次，每次都采用 5L pH为12的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于5L双蒸水内透析12小时，得到多聚体白 蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于0℃下预冻1小时后转移至负20℃ 下冷冻2小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所述多 聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；所述目标投递物包括二氢卟吩e6和ICG，多聚体白 蛋白包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，多聚体白 蛋白纳米球的粒径为400～500nm。

实施例十

一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤：

(1)取白蛋白混合液，白蛋白混合液含有浓度为100mg/mL(w/v)的猪血清白蛋白和 浓度为5mg/mL的ICG，然后采用0.1mol/L的NaOH溶液调节所述白蛋白水溶液的pH值到 9；

(2)向步骤(1)所得的所述pH值为9的白蛋白混合液中加入β-巯基乙醇得反应液， 然后在30℃下轻轻摇动反应0.05小时，在所述反应液中，所述β-巯基乙醇的摩尔数为白蛋 白摩尔数的100倍；

(3)将步骤(2)反应后的溶液在30℃的条件下进行超声，超声功率为50KW，同时在 所述进行超声的溶液中以0.01ml/s的速度注入乙醇溶液，乙醇溶液中含二甲基亚砜和体积质 量浓度为0.1mg/mL的二氢卟吩e6，二甲基亚砜和乙醇溶液中的溶剂乙醇的体积比为1:9，得 到微乳溶液，所述微乳溶液在30℃的条件下反应240min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的 悬浊液；乙醇溶液加入的体积为步骤(2)反应后的溶液体积的50倍；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为60℃ 的条件下，将透析袋置于100mL pH为7的PBS缓冲液内透析2小时，每次都采用100mL pH 为7的PBS缓冲液，期间每1个小时换液1次，然后再将透析袋置于100mL双蒸水内透析 12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负4℃下预冻48小时后转移至负 50℃下冷冻48小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥96小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所 述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；所述目标投递物包括二氢卟吩e6和ICG，多聚 体白蛋白包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，多聚 体白蛋白纳米球的粒径为200～300nm。

实施例十一

(1)取白蛋白混合液，白蛋白混合液含有浓度为100mg/mL(w/v)的猪血清白蛋白、 浓度为0.1mg/mL的ICG、浓度为5mg/mL的二氢卟吩和二甲基亚砜，二甲基亚砜和白蛋白混 合液中溶剂水的体积比是0.1:1，然后采用0.1mol/L的NaOH溶液调节混合液的pH值到9；

(2)向步骤(1)混合液中加入谷胱甘肽得反应液，然后在30℃下轻轻摇动反应1小时， 在反应液中，谷胱甘肽的摩尔数为白蛋白摩尔数的10倍；

(3)将步骤(2)反应后的溶液在4℃的条件下进行超声，超声功率为100KW，同时将 进行超声的溶液中以100mL/s的速度注入到无水乙醇中，得到微乳溶液，所述微乳溶液在4℃ 的条件下反应10min后，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液；无水乙醇加入的体积为步骤 (2)反应后的溶液体积的50倍；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为0℃ 的条件下，将透析袋置于100mL pH为7的PBS缓冲液内透析2小时，期间每1个小时换液 1次，每次都采用100mL pH为7的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于100mL双蒸水内透析 12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20℃下预冻2小时后转移至负 80℃下冷冻24小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，得到多聚体白蛋白纳米球，所 述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；所述目标投递物包括二氢卟吩e6和ICG，多聚 体白蛋白包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，多聚 体白蛋白纳米球的粒径为100～200nm。

实施例十二

(1)取白蛋白混合液，白蛋白混合液含有浓度为100mg/mL(w/v)的猪血清白蛋白、 浓度为1mg/mL的二氢卟吩和二甲基亚砜，二甲基亚砜和白蛋白混合液中溶剂水的体积比是 0.1:1，然后采用0.1mol/L的NaOH溶液调节混合液的pH值到9；

(2)向步骤(1)所得混合液中加入谷胱甘肽得反应液，然后在30℃下轻轻摇动反应1 小时，在所述反应液中，所述谷胱甘肽的摩尔数为白蛋白摩尔数的10倍；

(3)将步骤(2)反应后的溶液在0℃的条件下进行超声，超声功率为50KW，同时将 进行超声的溶液中以0.01mL/s的速度注入到乙醇溶液中，该乙醇溶液含体积质量浓度为 1mg/mL的ICG，得到微乳溶液，所述微乳溶液在0℃的条件下反应10min后，得到含多聚体 白蛋白纳米球的悬浊液；乙醇溶液加入的体积为步骤(2)反应后的溶液体积的20倍；

(4)将步骤(3)所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液移入透析袋，保持温度为0℃ 的条件下，将透析袋置于100mL pH为7的PBS缓冲液内透析2小时，期间每1个小时换液 1次，每次都采用100mL pH为7的PBS缓冲液，然后再将透析袋置于100mL双蒸水内透析 12小时，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；

(5)将步骤(4)所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负20℃下预冻2小时后转移至负 80℃下冷冻24小时，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48小时,得到多聚体白蛋白纳米球，所 述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；所述目标投递物包括二氢卟吩e6和ICG，多聚 体白蛋白包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，多聚 体白蛋白纳米球的粒径为300～400nm。

应用实施例

为了验证本发明实施例提供的多聚体白蛋白纳米球在制备预防、治疗或诊断癌症的药物 中的应用效果，本应用研究了多聚体白蛋白纳米球在小鼠体内的传输过程及对乳腺癌肿瘤组 织识别的特异性和灵敏度，并设置不同的实验组验证实施例提供的多聚体白蛋白纳米球抑制 肿瘤生长的效果，结果见图6、图7和图8。

以MCF-7荷瘤小鼠为模型，设置三个实验组，第一组不注射多聚体白蛋白纳米球，第二 组(小鼠的左侧肿瘤部位)通过尾静脉注射多聚体白蛋白纳米球水溶液0.02mg/ml，但不进行 激光照射，第三组(小鼠的右侧肿瘤部位)通过尾静脉注射多聚体白蛋白纳米球并进行相应 的激光照射。利用荧光活体成像系统(型号Maestro^TM2Maestro^TM EX-RRO，公司为美国CRi  Maestro^TM)和光声成像平台(光源为可调谐光学参量振荡器，波长范围从400nm-2500nm， 型号Vibrant355II HE,Opotek,Carlsbad，USA，光源脉冲重复频率10Hz，脉宽5ns；超声探头 中心频率10MHz，型号V315,Panametrics，Waltham，US)研究多聚体白蛋白纳米球在小鼠体 内的传输过程及对乳腺癌肿瘤组织识别的特异性和灵敏度。

图6和图7分别为实施例8制得的多聚体白蛋白纳米球用于荷瘤裸鼠和肿瘤组织的荧光 和光声成像图，图6中a没有注射多聚体白蛋白纳米球，图6中b为注射多聚体白蛋白纳米 球1h后采用660nm的激光照射产生的荧光成像图、c为660nm的激光照射24后产生的荧光 成像图，d为在c的基础上换用808nm的激光照射5min后产生的荧光成像图，左侧肿瘤部位 没有进行激光照射，从图6中可以看出，小鼠左侧肿瘤部位荧光信号慢慢增强，右侧肿瘤660nm 光动力治疗后荧光信号比左侧变得更强，这是因为注射1h后采用660nm的激光对右侧肿瘤 进行照射，Ce6进行光动力治疗会使肿瘤部位产生炎症，照射24h后多聚体白蛋白纳米球在 炎症肿瘤部位的富集量增加，再采用808nm的激光照射，ICG对炎症肿瘤进行光光动力和光 热同时治疗，治疗5min后右侧肿瘤相对于左侧肿瘤的荧光明显减弱，说明肿瘤部位的ICG 在808nm光热治疗的时候由于产生了大量的热量已经基本分解。光动力治疗肿瘤后产生的急 性炎症能促使以白蛋白为载体的光学试剂在肿瘤部位进一步的富集，提高了多聚体白蛋白纳 米球的靶向性，最终提高了多聚体白蛋白纳米球的治疗效果。

图7中左图为注射实施例8制得的多聚体白蛋白纳米球前的肿瘤组织的光声成像图，右 图为注射多聚体白蛋白纳米球24h时的光声成像图，从图中可以看出，左图基本上没有光声 信号，而右图在肿瘤部位光声信号较强。说明多聚体白蛋白纳米球对肿瘤组织具有很强的靶 向性。

图8为实施例9制得的多聚体白蛋白纳米球用于荷瘤裸鼠光动力实验的肿瘤生长曲线。 在肿瘤模型长至100mm³后，将多聚体白蛋白纳米球溶液通过尾静脉注射到小鼠体内，具体 实验方案为：将54只6～8周的裸鼠(Balb/c)，6只一组共分9个实验组进行实验，包括：1、 PBS缓冲液组(对照组)；2.注射仅包含Ce6的多聚体白蛋白纳米球(Ce6的注射量为0.5mg/kg， 即每1kg小鼠注射含有0.5mg Ce6的多聚体白蛋白纳米球)，注射1h后采用660nm激光照射 5min；仅包含Ce6的多聚体白蛋白纳米球的制备可参照本发明多聚体白蛋白纳米球的制备方 法；3注射游离Ce6(Ce6的注射量为0.5mg/kg，即每1kg小鼠注射含有0.5mg的Ce6)，注 射1h后采用660nm激光照射；4.注射仅包含ICG的多聚体白蛋白纳米球(ICG的注射量为 1mg/kg，即每1kg小鼠注射含有1mg ICG的多聚体白蛋白纳米球)，注射24h后采用808nm 激光照射；仅包含ICG的多聚体白蛋白纳米球的制备可参照本发明多聚体白蛋白纳米球的制 备方法；5.注射游离ICG(ICG的注射量为1mg/kg)，注射24h后采用808nm激光照射；6. 注射游离Ce6(Ce6的注射量为0.5mg/kg)和游离ICG(ICG的注射量为1mg/kg)，在注射 Ce6和ICG1h后，采用660nm激光照射5min，24h后，再换用808nm激光进行照射5min； 7.注射实施例9制得的包含有Ce6和ICG的多聚体白蛋白纳米球(ICG的注射量为1.0mg/kg， Ce6的注射量为0.5mg/kg，即每1kg小鼠注射含有1.0mg ICG和0.5mg Ce6的多聚体白蛋白 纳米球)；在注射多聚体白蛋白纳米球1h后，采用660nm激光照射5min，24h后，换用808nm 激光进行照射5min；8.游离Ce6(Ce6的注射量为0.25mg/kg)+游离ICG(ICG的注射量为 0.5mg/kg)；在注射Ce6和ICG1h后，采用660nm激光照射5min，24h后，换用808nm激光 进行照射5min；9.实施例9制得的包含有Ce6和ICG的多聚体白蛋白纳米球(Ce6的注射 量为0.25mg/kg，ICG的注射量为0.5mg/kg)，在注射多聚体白蛋白纳米球1h后，采用660nm 激光照射5min，24h后，换用808nm激光进行照射5min。

从图8中可以看出，对照组中肿瘤的体积增长速度快，游离的ICG、游离的Ce6、仅包含 ICG的多聚体白蛋白纳米球和仅包含Ce6的多聚体白蛋白纳米球虽然对肿瘤的生长有一定的 抑制效果，但效果没有本发明实施例9制得的包含有ICG和Ce6的多聚体白蛋白纳米球效果好， 且随着包含有ICG和Ce6的多聚体白蛋白纳米球中目标投递物注入量的增加，抑制肿瘤效果越 好，相对于对照组，实验组7最终使肿瘤完全消失，可以看出，本发明先用Ce6的光动力治疗 在肿瘤部位产生炎症，能促使以ICG在肿瘤部位进一步的富集，再采用ICG光动力和光热同时 治疗，可以大大抑制了肿瘤的生长。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。