一种由两种高分子共修饰的生物相容性磁性微球的制备方法

摘要

本发明涉及一种适合于药物或者基因载带的两种生物相容性高分子协同修饰的磁性微球的制备方法，本发明制备方法简单，实验重复性高，可以在制备过程中原位实现两种高分子对磁性微球的修饰。针对药物或者基因载带需求，材料同时具备以下特性：高磁性物质含量；表面生物相容性高分子修饰；磁性微球由纳米晶粒组装而成，且晶粒间具有明显的空隙，有利于药物或者基因物质的载带；以及良好的在水及PBS中的胶体稳定性。磁性微球的粒径在100nm至250nm之间，原生晶粒大小及组装后微球的尺寸均可调节，高分子包覆量可调节，以及晶粒组装的紧密程度也可调节，从而为制备具有生物相容性和能有效载带药物或基因的磁性微纳材料提供一种新的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及复合磁性纳米载体制备技术领域，具体涉及一种可用于载带microRNA（miRNA）的由两种高分子共修饰的生物相容性磁性微球的制备方法。

背景技术

近些年，由于生物技术的飞速发展，超顺磁性纳米粒子在分离DNA、蛋白、多肽、细菌等生物分子、磁性活体标记、磁共振成像、靶向药物、磁过热治疗癌症等领域展现出广阔的应用前景，磁性纳米粒子在生物领域的应用成为目前国际上最引人注目和最具活力的研究领域之一。

在基因治疗中，由于病毒载体存在着诸多缺陷，因此非病毒载体如阳离子脂质体和阳离子共聚物越来越受到重视，阳离子多聚体具有多样性的结构，如线性、树形或者枝化形，它们都带有大量的正电荷，可以和 DNA 相结合。阳离子多聚体的多样化为设计和合成低毒、稳定高效的基因载体提供了可能性。聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI) 是目前研究较多的聚阳离子型基因载体，因其独特的“质子海绵效应”，而被公认为阳离子聚合物基因载体性能评价的参照标准。通过静电作用将PEI与DNA形成聚电解质复合物，聚合物结构中含有的大量叔胺基团有助于提高聚合物的缓冲能力，有利于复合物实现内涵体逃逸，并表达相关蛋白。同时具有良好的生物相容性和高的转染效率（张智军，刘敏，沈贺，中国专利，公开号：CN 103509182）。

PEI与生物可降解高分子（如壳聚糖）形成阳离子聚合物，可以同时运载基因药物与沙坦类药物，基因也有较高转染效率（周建平，王伟，鲍秀丽，王玉，丁学芳，丁杨，中国专利，CN 103396557）。Cheng等制备了一种聚合物miRNA载体，载体主要由生物可降解的聚合物poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)构成，表面包裹细胞穿透肽，此载体可以有效输送化学修饰的寡核苷酸，从而实现基因调控（Cheng, C.J. and W.M. Saltzman, Polymer Nanoparticle-Mediated Delivery of MiRNA Inhibition and Alternative Splicing. Molecular Pharmaceutics, 2012. 9(5): p. 1481-1488.）。

以聚合物纳米粒子作为载体进行基因治疗，对miRNA的研究以及未来发展方向具有较为重要的意义。若要使得miRNA载体具备更多功能性，需实现其与磁性粒子的结合。Gustav Steinhoff等将聚乙烯亚胺（PEI）修饰在氧化铁磁性纳米粒子上，细胞实验证明，相比较于PEI体系，该体系有很好的基因传染效率，有望探寻出一条输送miRNA的新途径（Schade, A., et al., Innovative Strategy for MicroRNA Delivery in Human Mesenchymal Stem Cells via Magnetic Nanoparticles. International Journal of Molecular Sciences, 2013. 14(6): p. 10710-10726.）。

目前，以生物可降解高分子和PEI两种高聚物共同稳定磁性颗粒制备复合基因载体尚未报道，用一步法制备复合磁性基因载体并用于药物/基因载带的研究的技术领域仍处于空白。磁性纳米材料在生物体内造影及磁热治疗方面的研究较为成熟，将磁性复合微球应用于药物/基因载体，探索一种多功能载体，集靶向输送、体内成像以及药物可控释放等多功能于一体，将为未来生物体内药物/基因输送体系的研究提供一定的理论支撑及参考数据。

发明内容

本发明的目的是提供一种由两种高分子共修饰的生物相容性磁性微球的制备方法。

本发明提出的由两种高分子共修饰的生物相容性磁性微球的制备方法，具体步骤如下：

(1)、准确称量0.1～0.5g生物可降解高分子或聚阳离子高分子于三口烧瓶中，加入有机溶剂，在加热套内40～80℃加热搅拌10～30min；所述的生物相容性高分子为聚谷氨酸(γ-PGA)、聚丙烯酸（PAA）或聚乙二醇（PEG）中任一种；所述聚阳离子高分子为壳聚糖(Chitosan)或聚乙烯亚胺（PEI）；

(2)、准确称量0.1～0.5g分子量800～50000的PEI于离心管中，加入有机溶剂，超声至完全溶解；

(3)、准确称量0.3～0.8g无机铁盐和1.0～3.0g铵盐溶解于有机溶剂中，超声分散均匀，加入步骤(2)中的混合物后，继续超声分散均匀；

(4)、将步骤(3)中的混合溶液加入步骤(1)的体系中，通入氮气，80～200℃条件下，搅拌1～3h；

(5)、步骤(4)结束后，迅速将混合溶液加入反应釜中，加热温度180～220℃，反应时间为10～72h，得到复合磁性微球溶液；

(6)、将步骤(5)得到的无机磁性微球溶液分散在醇中，超声作用5～20min利用磁场分离，共洗涤3～5次，然后分散在去离子水中，超声作用2～10min，再利用磁铁分离，共洗涤3～5次，最后冷冻干燥12～36h，得到复合磁性纳米粒子。

本发明中，所述无机铁盐选自硝酸铁、硫酸铁或三氯化铁中任一种。

本发明中，所述铵盐选自碳酸铵、醋酸铵或硫酸铵中任一种。

本发明中，步骤(1)、(2)和(3)中所述有机溶剂选自甲醇、乙二醇或丙三醇中一至几种。

本发明中，步骤(6)中所述醇为乙醇。

本发明的有益效果在于：该方法简便、成本低、可控性强。本发明通过一步法合成表面包覆有聚阳离子高分子或生物相容性高分子的磁性材料，制备方法简便，成本低，材料粒径分布均匀，在100-250nm之间，可满足药物/基因载体在生物体内应用的要求。聚阳离子高分子表面带有较高的正电荷，可以吸附RNA，DNA分子实现核酸的转染。材料表面的生物相容性高分子可以大大降低材料的细胞毒性，同时提高材料的水溶性；材料由原始晶粒组装而成，晶粒间形成疏松孔道结构，可以提高吸附效率。

附图说明

图1为复合材料的典型透射电子显微镜照片，

图2为复合材料的磁性能曲线，

图3为复合材料的典型TGA热分析图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。

实施例1

1、准确称量0.32g γ-PGA于三口烧瓶中，加入乙二醇，在加热套内70℃加热搅拌20min；

2、准确称量0.15g分子量10000的PEI于离心管中，加入乙二醇，超声至完全溶解；

3、准确称量0.579g FeCl₃·6H₂O、1.5g醋酸铵 溶解于乙二醇中，超声分散均匀，加入步骤2中的混合物后，继续超声分散均匀。

4、将步骤3中的混合溶液加入步骤1的体系中，通入氮气，160℃条件下，搅拌1h；

5、步骤4结束后，迅速将混合溶液加入反应釜中，加热温度220℃，反应时间为16.5h，得到复合磁性微球溶液；

6、将步骤5得到的无机磁性微球溶液分散在醇中，超声作用10min，利用磁场分离，共洗涤3次，然后分散在去离子水中，超声作用10min，再利用磁铁分离，共洗涤5次，最后冷冻干燥12h，得到复合磁性纳米粒子。产物粒子的平均粒径为150nm。

实施例2

1、准确称量0.214g壳聚糖于三口烧瓶中，加入乙二醇，在加热套内60℃加热搅拌30min；

2、准确称量0.15g分子量1800的PEI于离心管中，加入乙二醇剂，超声至完全溶解；

3、准确称量0.579g Fe(NO₃)₃、1.5g碳酸铵溶解于乙二醇中，超声分散均匀，加入步骤2中的混合物后，继续超声分散均匀。

4、将步骤3中的混合溶液加入步骤1的体系中，通入氮气，120℃条件下，搅拌1.5h；

5、步骤4结束后，迅速将混合溶液加入反应釜中，加热温度200℃，反应时间为24h，得到复合磁性微球溶液；

6、将步骤5得到的无机磁性微球溶液分散在醇中，超声作用15min，利用磁场分离，共洗涤4次，然后分散在去离子水中，超声作用10min，再利用磁铁分离，共洗涤4次，最后冷冻干燥24h，得到复合磁性纳米粒子。产物粒子的平均粒径为220nm

实施例3

1、准确称量0.214 γ-PGA于三口烧瓶中，加入乙二醇，在加热套内60℃加热搅拌20min；

2、准确称量0.15g分子量1800的PEI于离心管中，加入乙二醇，超声至完全溶解；

3、准确称量0.579g FeCl₃·6H₂O、1.5g醋酸铵溶解于乙二醇中，超声分散均匀，加入步骤2中的混合物后，继续超声分散均匀。

4、将步骤3中的混合溶液加入步骤1的体系中，通入氮气，160℃条件下，搅拌1h；

5、步骤4结束后，迅速将混合溶液加入反应釜中，加热温度190℃，反应时间为12h，得到复合磁性微球溶液；

6、将步骤5得到的无机磁性微球溶液分散在醇中，超声作用5min利用磁场分离，共洗涤3次，然后分散在去离子水中，超声作用5min，再利用磁铁分离，共洗涤3次，最后冷冻干燥24h，得到复合磁性纳米粒子。产物的平均粒径为180nm。