基于纳米金等离子激元的直接竞争酶免疫分析方法

摘要

本发明公开了一种基于纳米金等离子激元的直接竞争酶免疫分析方法，可实现小分子化合物的免疫分析可视化检测，包括：可能含有小分子化合物的测试样品与过氧化氢酶标记的半抗原可竞争结合固相上包被的小分子化合物抗体，结合的酶标抗原分解过氧化氢，在一定的缓冲条件下，过氧化氢还原氯金酸为纳米金，通过观测显色液的颜色或光吸收强度，实现对样品中所含小分子化合物的检测。本发明方法具有灵敏度高、操作简便、成本低、可用肉眼分辨结果等优点，弥补了现有的小分子化合物酶联免疫检测技术的不足。

说明书

技术领域

本发明涉及一种小分子化合物的检测方法，特别是一种基于纳米金等离子激元的直接竞争酶联免疫分析方法，属于免疫学检测分析领域。

背景技术

酶联免疫分析技术是一种非常成熟的固相免疫分析模式，在临床诊断分析中已经获得了多年的应用，同时，近十年来，也在环境监测、食品安全危害物检测等领域中获得了广泛的应用。在对小分子化合物的检测，酶联免疫分析主要采用两种模式，间接竞争法和直接竞争法。在两种检测模式中，分别需要酶标记的第二抗体和酶标记的半抗原，它们是作为免疫吸附分析的信号放大的作用。在环境监测和食品危害物检测中，酶联免疫分析最常用的的酶分子为辣根过氧化物（HRP）酶，其最常用的底物为四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢（H₂O₂），在HRP的催化下，它们转变为蓝色物质，在强酸的作用下，蓝色产物可转变为黄色，通过酶标仪检测产物的光吸收强度，可以实现对目标小分子化合物的检测。

目前，在环境监测、食品危害物分析等许多领域，都对更高灵敏度的免疫分析方法具有迫切的需求，因此，提高传统的酶联免疫分析方法的检测性能，具有重要的应用价值。许多研究采用新的检测模式，如化学发光、电化学发光，与传统酶联免疫分析方法相比，它们具有更灵敏的检测能力，但是这些免疫分析方法需要较昂贵的设备和试剂，因此，检测成本显著提高，这极大地阻碍了其在环境监测、食品危害物分析等许多领域的应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提出一种基于纳米金等离子激元的直接竞争酶联免疫分析方法，以实现对小分子化合物的高灵敏、低成本的检测。

为实现前述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

一种基于纳米金等离子激元的直接竞争酶免疫分析方法，包括：

将测试样品与过氧化氢酶标记的半抗原混合，并使所述测试样品中可能含有的小分子化合物和过氧化氢酶标记的半抗原与包被在固相载体上的小分子化合物抗体竞争性结合，

移除未与所述小分子化合物抗体结合的小分子化合物及过氧化氢酶标记的半抗原，并加入过氧化氢、氯金酸及用以形成选定缓冲体系的辅助试剂，再观察或检测所形成的混合反应体系的颜色或光吸收强度，实现对测试样品中所含小分子化合物的检测；

其中，在所述选定缓冲体系中，结合于所述小分子化合物抗体上的所述过氧化氢酶标记的半抗原能够分解过氧化氢，并且过氧化氢能够还原所述氯金酸形成纳米金粒子。

进一步的，所述基于纳米金等离子激元的直接竞争酶免疫分析方法具体可包括如下步骤：

（1）将小分子化合物的抗体溶于包被缓冲液内，并施加到固相载体上，在37℃孵育，再以封闭液封闭，从而将小分子化合物抗体包被在固相载体上；

（2）将过氧化氢酶标记的半抗原和可能含有小分子化合物的测试样品于磷酸盐缓冲液中混合，施加到经步骤（1）处理后的所述固相载体上，于37℃孵育后洗涤；

（3）在经步骤（2）处理后的所述固相载体上施加过氧化氢；

（4）向经步骤（3）处理后的所述固相载体上施加含有氯金酸的显色液，在室温下充分反应后，再观察或检测所形成的混合反应体系的颜色或光吸收强度，实现对测试样品中所含小分子化合物的检测。

在一较佳实施方案中，是通过检测所述混合反应体系对于可见光的光吸收强度，实现对测试样品中所含小分子化合物的检测。

其中，所述可见光的波长优选为540 nm。

更进一步的，所述基于纳米金等离子激元的直接竞争酶免疫分析方法具体可包括如下步骤：

（1）包被抗体

将小分子化合物的抗体用包被缓冲液分别稀释后，加入酶标板（亦作为固相载体）的各个孔中， 37℃孵育一段时间（例如2h），用封闭液封闭；

（2）竞争反应

将酶标抗原（过氧化氢酶标记的半抗原，亦可简称CAT酶标抗原）稀释后，加入酶标板的各个孔中，再分别加入不同浓度的小分子化合物， 37℃孵育一段时间（例如1h），然后用洗涤液置洗涤 2次以上，用水洗涤一次以上；

（3）加过氧化氢

加入H₂O₂，25℃反应一段时间（例如1h）；

（4）显色

向上述步骤（3）中的酶标板各孔中分别加入 显色液，振荡混匀，反应一段时间（例如15min）后，观测混合反应体系的颜色或检测可见光吸收强度。

进一步的，所述包被缓冲液可以采用浓度为 0.05 M、pH值为 9.6的碳酸钠缓冲液。

进一步的，所述封闭液可以采用添加0.2wt％ BSA、浓度为0.01M的磷酸盐(PBS)缓冲溶液。

进一步的，所述酶标抗原可以是采用碳化二亚胺法、重氮法、戊二醛法等方法偶联过氧化氢酶（CAT）与小分子化合物或其衍生物得到的的复合物。

进一步的，在每升前述浓度为0.01M 的PBS缓冲液中，可包含氯化钠8 g、磷酸二氢钾0.24 g、磷酸氢二钠3.62 g、氯化钾0.2g。

进一步的，所述洗涤液 (PBST) 可采用添加0.05wt% 吐温-20的、浓度为0.01M、pH值为7.4 的磷酸盐缓冲液。

进一步的，所述显色液可由过氧化氢溶液、5mM氯金酸溶液、2mM柠檬酸钠溶液以及2mM  MES（2-(N-吗啡啉)乙磺酸）溶液等混合形成。

进一步的，所述基于纳米金等离子激元的直接竞争酶免疫分析方法还包括：

a、取一系列不同浓度的小分子化合物标准样品分别与固定用量的过氧化氢酶标记的半抗原混合后，与包被在固相载体上的小分子化合物抗体竞争性结合，移除未与所述小分子化合物抗体结合的小分子化合物及过氧化氢酶标记的半抗原，并加入过氧化氢、氯金酸及用以形成选定缓冲体系的辅助试剂，再观察或检测每一小分子化合物标准样品最终所形成的混合反应体系的颜色或光吸收强度，进而依据所述小分子化合物标准样品的浓度与最终所获的相应混合反应体系的颜色或可见光吸收强度之间的对应关系建立标准比色卡或标准曲线；

b、将待测试样品与过氧化氢酶标记的半抗原混合后，与包被在固相载体上的小分子化合物抗体竞争性结合，移除未与所述小分子化合物抗体结合的过氧化氢酶标记的半抗原及可能存在的小分子化合物，并加入过氧化氢、氯金酸及用以形成选定缓冲体系的辅助试剂，再观察或检测最终所形成的混合反应体系的颜色或光吸收强度，并与所述标准比色卡或标准曲线比对，进而定性或定量测得待测试样品中所含小分子化合物的浓度。

该基于纳米金等离子激元的直接竞争酶免疫分析方法是一种基于纳米金等离子激元的酶联免疫形成的可视化检测小分子化合物的方法，其依据过氧化氢酶标记的半抗原（简称CAT酶标抗原或酶标抗原）与小分子化合物竞争性结合包被在固相载体上的小分子化合物抗体（简称固相抗体），其中，在小分子化合物不存在或较少存在时，多数酶标抗原与固相抗体结合而被固定，并可较多分解后续加入的过氧化氢中，在小分子化合物存在或较多存在时，较少酶标抗原与固相抗体结合，并仅可分解少量后续加入的过氧化氢，而未被降解的过氧化氢可还原后续加入的氯金酸形成金纳米粒子，因过氧化氢残留量的不同，可产生得到颜色不同或深浅不同的金纳米粒子，进而，通过观测显色液的颜色或光吸收强度，即可以实现对小分子化合物的定性或定量检测。

与现有技术相比，本发明至少具有如下优点：该基于纳米金等离子激元的直接竞争酶免疫分析方法可实现对样品中所含小分子化合物的高灵敏检测，测试结果可采用肉眼或酶标仪、分光光度计等普通设备检测，成本低廉，易于操作，弥补了现有的检测小分子化合物技术的不足。

附图说明

图 1是本发明一典型实施方案中一种 基于纳米金等离子激元的直接竞争酶免疫分析方法的工作原理图；

图2是本发明实施例1中浓度梯度分别为0 ng/mL，0.03 ng/mL，0.1 ng/mL，0.3 ng/mL，1 ng/mL，3ng/mL，10 ng/mL，30ng/mL的甲基睾酮标准品的反应显色图；

图3 是本发明实施例1中浓度梯度分别为0 ng/mL，0.03 ng/mL ，0.1 ng/mL，0.3 ng/mL，1 ng/mL，3ng/mL，10 ng/mL，30ng/mL的甲基睾酮标准品的反应光吸收强度标准曲线图。

具体实施方式

本发明主要提供了一种基于纳米金等离子激元的直接竞争酶免疫分析方法，其技术方案主要包括：测试样品可能含有的小分子化合物与过氧化氢酶标记的半抗原（以下简称酶标抗原）可竞争的结合固相载体上包被的小分子化合物抗体（简称固相抗体），固相载体结合的酶标抗原分解过氧化氢，在一定的缓冲条件下，过氧化氢还原氯金酸为纳米金（亦称金纳米粒子），通过观测显色液的颜色或光吸收强度，实现对测试样品中所含小分子化合物的检测。

在一典型实施方案中，一种基于纳米金等离子激元的直接竞争酶免疫分析方法可以 包括以下步骤：

（1） 制备半抗原–CAT酶标抗原；

（2）固相载体（例如微孔板）的小分子化合物抗体包被 ；

（3）竞争反应 ；

（4）加过氧化氢 ；

（5）显色 。

其中，所述小分子化合物可选自但不限于甲基睾酮、克伦特罗、庆大霉素等。

参阅图1所示系本发明中一种典型基于纳米金等离子激元的直接竞争酶免疫分析方法的工艺原理图。

进一步的，在一典型实施案例之中，该方法可以包括如下步骤：

（1）包被抗体

将免疫制备的小分子化合物抗体用0.05 M、pH 9.6的碳酸钠缓冲液分别稀释至2-10μg/mL，加入酶标板中，每孔加100μL，37℃孵育2h，用添加有0. 2％ 牛血清白蛋白（BSA）的0.01M、pH7.4 的磷酸盐缓冲液作为封闭液封闭；

（2）竞争反应

将用碳化二亚胺法、重氮法、戊二醛法偶联的酶标抗原用酶标稀释液稀释，稀释至5-20μg/mL，加入到酶标板中，每孔加 50μL，同时加入小分子化合物标准品，如浓度分别为0 ng/mL，0.03 ng/mL ，0.1 ng/mL，0.3 ng/mL，1 ng/mL，3ng/mL，10 ng/mL，30ng/mL，每孔加入 50μL，37℃孵育 1h，然后用 PBST洗涤液置于摇床上洗涤 2次，用超纯水洗涤一次，每次 3min ；

所述洗涤液 PBST ：为含有 0.05% 吐温-20 的 0.01M、pH7.4 的磷酸盐缓冲液 ；

所述酶标稀释液 ：含 0.1% 明胶的 PBST 溶液 ；

（3）加过氧化氢

加入浓度为400μM的H₂O₂，每孔加入100μL，25℃反应1h。

（4）显色

向上述（3）中的酶标板各孔中分别加入 6μL 5mM氯金酸、6μL 2mM柠檬酸钠、88μL MES缓冲溶液（2mM），振荡混匀，反应15min后，观察显色结果，或检测540 nm 处光吸收强度(A₅₄₀)。

如下结合前述典型实施案例简要说明本发明的工作原理：

以相同量的抗体包被到酶标板的各个孔中，加入待测含小分子化合物样品和酶标记抗原后，待测样品中的小分子化合物与酶标抗原相互竞争有限的固相表面包被的抗体，并与之结合。由于每个孔中的抗体和加入的酶标抗原含量均相同，所以当待测样品所含的小分子化合物浓度高时，与固相抗体结合的酶标抗原就会减少。反应达到平衡时，将上清液倾倒出，并用洗涤液洗涤，故只有与固相抗体结合的酶标抗原和小分子目标物结合在酶标板微孔中，然后加入过氧化氢，酶标板中的酶标抗原分解过氧化氢，反应后再加入底物（氯金酸、柠檬酸钠、MES缓冲液）。当待测物浓度高时，反应显色较深，呈红色，用酶标仪检测540nm处的吸光值（OD值），吸光值较高；反之，当待测物浓度低时，反应显色较浅，呈浅蓝色，则所测的OD值低。根据所作的标准曲线，可以推算出待测样品中所含小分子化合物的浓度高低。

以下结合实施例及附图对本发明的技术方案作更为详细的解释说明。

实施例 1  本实施例涉及甲基睾酮的检测方法，包括如下步骤：

（1）制备甲基睾酮衍生物–CAT酶标抗原

将甲基睾酮通过羧甲基羟胺半盐酸盐肟化，得到衍生物3-羧甲基肟-甲基睾酮（3-CMO-MT），然后采用碳化二亚胺法将3-CMO-MT与CAT酶偶联。具体如下：

取3-CMO-MT 2.5mg、NHS 1.5mg、EDC·HCl 2.5mg，加入到 1mL DMF 中，室温避光震荡 2 h。另取27mg过氧化氢酶，溶于 1.5mL 含 20% DMF 液的 PBS中，4℃预冷。将3-CMO-MT活化液逐滴加入到 CAT溶液中，并不断搅拌，4℃ 反应2 h；反应结束后将反应液先用 20% DMF的 PBS透析，最后用0.01M PBS透析 2 天，-20℃冷冻保存。

（2）包被板的制备

采用0.05M pH 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被稀释液稀释甲基睾酮抗体，抗体浓度约为2-10μg/mL，然后向包被板的每个孔中加入100μL包被液，37℃烘箱放置2h或4℃过夜，用PBST洗涤液洗涤3min，每次在吸水纸上拍干，重复3次。然后加入含0.2％BSA的磷酸盐缓冲液作为封闭液封闭，37℃烘箱温育 2h或4℃过夜，取出用上述洗涤液洗涤3次。

（3）竞争反应

分别将一系列浓度梯度的甲基睾酮标准溶液，如 0 ng/mL，0.03 ng/mL，0.1 ng/mL，0.3 ng/mL，1 ng/mL，3 ng/mL，10 ng/mL，30ng/mL，或经前处理过的样品溶液分别加入到包被板各自的微孔中，每孔 50μL。再将甲基睾酮衍生物-CAT酶标抗原用酶标抗原稀释液（含0.1% 明胶、含 0.05% 吐温-20、pH  7.4 的磷酸盐缓冲溶液，PBST）分别稀释至5-20μg/mL，加入酶标板中，每孔加入50μL，37℃恒温箱孵育1h，然后用 PBST洗涤液洗涤 2次，用超纯水洗涤一次，每次 3min 。

（4） 加过氧化氢

加入过氧化氢，用2mM pH 6.5 MES缓冲溶液稀释至400μM，每孔加入100μL，置于不透光恒温箱25℃中反应1h 。

（5） 显色

向上述（4）中的酶标板各孔中分别加入 6μL 5mM氯金酸、6μL 2mM柠檬酸钠、88μL 2mM MES缓冲溶液，在25℃恒温振荡器上振荡混匀，反应15min后，观察显色结果并拍照，或检测540 nm 处光吸收强度(A₅₄₀)。

检测结果显示，采用本实施例的方法，肉眼可分辨0.1 nM的甲基睾酮（图2），而利用分光光度计对甲基睾酮的检测限可达到0.03 nM（图3）。

实施例 2  本实施例涉及克伦特罗的检测方法，包括如下步骤：

（1）制备克伦特罗–CAT酶标抗原

采用重氮法将盐酸克伦特罗（CL）与CAT酶偶联，具体如下：

用0.1 mol/L HCl溶液溶解2.5mg盐酸克伦特罗，放置于 4℃冰箱内搅拌。20min 以后，向烧杯内连续三次加入 0.2mol/L 的 NaNO₂溶液，每次 20uL，间隔25s。4℃低速搅拌约 1 小时至溶液无色。亚硝酸钠是否过量可用淀粉碘化钾试纸测试。称取39.4mg 的CAT 溶解于 20mM 的硼酸盐缓冲液中。在冰浴的条件下，将活化好的 CL 逐滴加入到CAT溶液中，滴加过程中要不断搅拌并用1mol/L  NaOH 调节 pH 值维持在 8.0~8.5 之间。滴加完成后于 4℃、300r/min 搅拌下反应6 小时。最后用0.01M PBS透析 2 天。透析完成后，4℃、5000rpm 离心 10min除去沉淀，将上清分装保存于-20℃备用。

（2）包被板的制备

采用浓度为0.05M、pH 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被稀释液稀释克伦特罗抗体，抗体浓度约为2-10μg/mL，然后向包被板的每个孔中加入100μL包被液，37℃烘箱放置2h或4℃过夜，用PBST洗涤液洗涤3min，每次在吸水纸上拍干，重复3次。然后加入含0.2％BSA的磷酸盐缓冲液作为封闭液封闭，37℃烘箱温育 2h或4℃过夜，取出用上述洗涤液洗涤3次。

（3）竞争反应

分别将一系列浓度梯度的克伦特罗标准溶液，如 0 ng/mL，0.03 ng/mL，0.1 ng/mL，0.3 ng/mL，1 ng/mL，3 ng/mL，10 ng/mL，30ng/mL，或经前处理过的样品溶液分别加入到包被板各自的微孔中，每孔 50μL。再将克伦特罗-CAT酶标抗原用酶标抗原稀释液（含0.1% 明胶、含 0.05% 吐温-20、pH  7.4 的磷酸盐缓冲溶液，PBST）分别稀释至5-20μg/mL，加入酶标板中，每孔加入50μL，37℃恒温箱孵育1h，然后用 PBST洗涤液洗涤 2次，用超纯水洗涤一次，每次 3min 。

（4） 加过氧化氢

加入过氧化氢，用2mM pH 6.5 MES缓冲溶液稀释至400μM，每孔加入100μL，置于不透光恒温箱25℃中反应 1h 。

（5） 显色

向上述（4）中的酶标板各孔中分别加入 6μL 5mM氯金酸、6μL 2mM柠檬酸钠、88μL 2mM MES缓冲溶液，在25℃恒温振荡器上振荡混匀，反应15min后，观察显色结果并拍照，或检测540 nm 处光吸收强度(A₅₄₀)。

测试结果与实施例1中类似，证明本实施例方法的灵敏度远远高于传统的酶联免疫分析方法。

实施例3本实施例涉及庆大霉素的检测方法，包括如下步骤：

（1）制备庆大霉素–CAT酶标抗原

采用戊二醛法将庆大霉素与CAT酶偶联。具体如下：

取庆大霉素3mg用0.5 mL 0.01M PBS溶解，取2.0%的戊二醛0.1 mL加入到上述溶液中，活化反应30min。取CAT 38.7 mg用1.2mL 0.01M PBS溶解后，将活化好的溶液逐滴加入到CAT溶液中，搅拌反应过夜。最后用0.01M PBS透析 2 天。透析完成后，4℃、5000rpm 离心 10min除去沉淀，将上清分装保存于-20℃备用。

（2）包被板的制备

采用0.05M pH 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被稀释液稀释庆大霉素抗体，抗体浓度约为2-10μg/mL，然后向包被板的每个孔中加入100μL包被液，37℃烘箱放置2h或4℃过夜，用PBST洗涤液洗涤3min，每次在吸水纸上拍干，重复3次。然后加入含0.2％BSA的磷酸盐缓冲液作为封闭液封闭，37℃烘箱温育 2h或4℃过夜，取出用上述洗涤液洗涤3次。

（3）竞争反应

分别将一系列浓度梯度的庆大霉素标准溶液，如 0 ng/mL，0.03 ng/mL，0.1 ng/mL，0.3 ng/mL，1 ng/mL，3 ng/mL，10 ng/mL，30ng/mL，或经前处理过的样品溶液分别加入到包被板各自的微孔中，每孔 50μL。再将庆大霉素-CAT酶标抗原用酶标抗原稀释液（含0.1% 明胶、含 0.05% 吐温-20、pH  7.4 的磷酸盐缓冲溶液，PBST）分别稀释至5-20μg/mL，加入酶标板中，每孔加入50μL，37℃恒温箱孵育1h，然后用 PBST洗涤液洗涤 2次，用超纯水洗涤一次，每次 3min 。

（4） 加过氧化氢

加入过氧化氢，用2mM pH 6.5 MES缓冲溶液稀释至400μM，每孔加入100μL，置于不透光恒温箱25℃中反应 1h 。

（5） 显色

向上述（4）中的酶标板各孔中分别加入 6μL 5mM氯金酸、6μL 2mM柠檬酸钠、88μL 2mM MES缓冲溶液，在25℃恒温振荡器上振荡混匀，反应15min后，观察显色结果并拍照，或检测540 nm 处光吸收强度(A₅₄₀)。

测试结果与实施例1中类似，证明本实施例方法的灵敏度远远高于传统的酶联免疫分析方法。

以上实施例仅用于说明本发明的内容，除此之外，本发明还有其他实施方式，但凡本领域技术人员因发明所涉及之技术启示，而采用等同替换或等效形式形成的技术方案均落在本发明的保护范围内。