一种二维、高分辨测定湿地土壤和沉积物中活性磷分布的方法

摘要

一种二维、高分辨测定湿地土壤和沉积物中活性磷分布的方法，将改进型ZrO

说明书

技术领域

本发明属于环境科学和地球科学领域，涉及一种对土壤、沉积物等环境介质中活性磷 的二维、高分辨测定技术，该技术能够简易地在毫米和亚毫米尺度上获取湿地土壤、沉积 物剖面中活性磷(DRP)的二维分布特征。

背景技术

磷是水生生物生长的重要营养元素，是水体初级生产力和富营养化的主要限制性因子。 外源磷进入湿地和湖泊水体后，大部分积累于湿地土壤和沉积物中，并在一定条件下重新 释放进入上覆水，维持水体的富营养状态。在外源磷输入得到遏制的情况下，湿地土壤或 沉积物磷污染是造成水体富营养化的主要原因。湿地土壤和沉积物中磷的释放潜力与其在 水-土和沉积物-水界面的分布有密切的关系。通常，由于界面处物理、化学和生物性质上的 巨大差异，造成磷在该界面附近可能存在强烈的浓度梯度分布，由此驱动磷在湿地土壤与 上覆水或沉积物与上覆水之间进行交换。所以获取磷在沉积物-水微界面间的分布信息，是 评价沉积物磷活性及其向水体释放的重要依据。活性磷或溶解态反应性磷(Dissolved  reactive phosphorus，DRP)是用钼蓝比色法测定得到的磷，绝大部分为磷酸根磷，还包括 少量能在酸性条件下发生水解的有机磷和多聚磷化合物。活性磷是沉积物中最具活性的磷， 其在沉积物剖面中的含量和分布直接影响着水体的营养状态。获取活性磷在沉积物中的含 量和空间分布信息，对于研究和评价水体营养状态具有十分重要的意义。

由于分析方法的限制，通常只能得到活性磷在沉积物剖面中的一维垂向分布信息。然 而，沉积物性质在横向空间上同样存在着非常大的差异，依据一维活性磷数据已不能满足 对水体科学研究和评价的需要，迫切需要发展活性磷的二维获取技术，同时获取活性磷在 沉积物剖面中的横向和垂向分布信息。另一方面，常规分辨率(1mm-1cm)的活性磷数据 不能准确反映其在沉积物中的空间变化，迫切需要提高分辨率，在100μm-1mm尺度获取活 性磷的空间分布信息。

薄膜扩散梯度(Diffusive gradients in thin films，DGT)测定技术是一种非破坏性、原位 获取沉积物中污染物分布和活性的新技术。该技术装置主要由固定膜和扩散膜叠加组成(图 1)，两者均由凝胶配置而成，其中固定膜通过向凝胶加入能吸附污染物离子的固定剂配置 而成。当DGT装置放入沉积物中，污染物离子以扩散方式穿过扩散膜，随即被固定膜捕获， 并在扩散膜上形成线性梯度分布，扩散膜与固定膜接触一端的离子浓度维持为零，与介质 接触一端的浓度(C_DGT)为：

$C_{\mathrm{DGT}}=\frac{\mathrm{M\Delta g}}{D_g\mathrm{tA}}$

上式中M为固定膜上目标离子的积累量(μg)，Δg为扩散层厚度(cm)，D_g为离子在 扩散膜中的扩散速率(cm²/s)，A为固定膜的面积(cm²)，t为扩散时间(s)，C_DGT即是通 过DGT分析得到的沉积物中离子的含量(10³μg/L)。

对于溶解态活性磷二维分布的获取，中国专利申请2011103235556通过采用改进型二 氧化锆磷固定膜，结合比色分析技术，已实现沉积物活性磷(DRP)二维分布的获取。

基于DGT，现有的溶解态活性磷二维分布的获取方法包括LA ICP-MS分析技术和切 片-提取-测定的方法。LAICP-MS是将激光束聚焦于样品表面，使之熔蚀气化，由载气将样 品微粒送入等离子体中电离，再经质谱系统进行质量过滤，最后用接收器分别检测不同质 荷比的离子。该技术具有较高的空间分辨率(＜10μm)。切片-提取-测定方法是对固定膜沉 积物-水界面上下部分进行二维、亚毫米切片，用NaOH提取各切片中的活性磷，采用微量 比色方法测定提取液中活性磷含量，换算成各切片中的活性磷固定量，通过Fick第一扩散 定律计算得到沉积物剖面中对应位置的活性磷浓度，并作出二维分布图。

切片-提取-测定方法操作麻烦，耗时耗力，效率低下，易丢失部分切片造成信息丢失， 造成对湿地土壤或沉积物磷空间分布信息的错误判断。LA ICP-MS技术仪器非常昂贵，绝 大多数实验都不具备，同时样品前处理程序繁琐，需要具备一定的专业技能。

基于DGT技术获取沉积物中污染物的空间分布，提高DGT技术的空间分辨率和操作 的简易性一直是人们期望解决的技术问题。电脑密度成像(Computer-Imaging Densitometry， CID)技术是一种利用扫描仪将固定膜表面扫描成图像，图像经ImageJ等软件处理后，转 换成灰度的技术。该技术能高效快速地获取特定离子的二维、高分辨分布特征，大大提高 工作效率，同时技术实施的难度大大降低，因此可以很好的弥补上述方法的不足，具有广 阔的应用前景。

CID技术已在研究硫(S^2-)二维含量分布领域得到了快速发展，Teasdale等(1999)结 合DGT和电脑成像密度计量技术(CID)来分析溶解态硫的二维含量分布，且分辨率最高 可以达到100μm(Teasdale et al.，1999)。利用CID对S^2-的分析，主要利用了沉淀的原理， 事先制作含AgI颗粒的凝胶固定膜，当组装有该固定膜的DGT装置暴露于S^2-溶液时，溶 液中的S^2-以扩散的方式穿过扩散膜，随即与固定膜上的AgI反应生成Ag₂S沉淀。由于Ag₂S 是黑色，固定膜表面颜色将加深，颜色深浅可反映S^2-在固定膜上的积累量，因此可根据固 定膜表面的颜色变化(或灰度变化)对固定膜上S^2-的积累量进行定量分析。

目前，还没有CID分析磷的公开报道。相比硫的测定，发展CID磷测定的难度要大很 多，这是因为不能利用类似于硫沉淀的原理建立用于测磷的CID技术。溶液中磷的测定一 般采用比色的方法，最为经典的方法是钼蓝法，其次是孔雀绿法，但两种方法的显色反应 均在强酸性条件下进行，如按照溶液的显色原理建立CID技术，必须要解决两个问题：凝 胶固定膜在强酸性条件下保持稳定的形状，同时固定剂不会溶解；其次，固定膜表面磷与 显色剂发生反应时，磷和生成的有色物质不会扩散。现有用于DGT测定磷的商业化固定膜 主要以氢氧化铁为固定剂，氢氧化铁在强酸性条件下将发生溶解，因此不适合发展CID技 术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结合DGT和CID技术，简易地获取沉积物或湿地土壤中溶 解态活性磷二维分布的方法。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

一种二维、高分辨测定湿地土壤和沉积物中活性磷分布的方法，其特征在于，所述的 方法将薄膜扩散梯度(DGT)技术与电脑成像密度计量(CID)技术结合，将包含ZrO₂的磷 固定膜组装成DGT装置，垂直放置在土壤或沉积物中提取土壤或沉积物剖面中的活性磷， 取出磷固定膜后将磷固定膜置于去离子水中热处理，加入磷显色剂显色；利用CID技术扫描 显色后的磷固定膜并得到表面灰度值，根据建立的磷固定膜表面磷累积量与表面灰度值的 校正曲线，将得到的表面灰度值转化成磷累积量，通过Fick第一扩散定律计算得到沉积物剖 面中对应位置的活性磷浓度，并作出活性磷二维分布图。

本发明方法基于DGT技术原理，采用二氧化锆磷固定膜提取沉积物中的活性磷，并结 合CID技术，对固定膜进行灰度扫描，再用事先建立的ZrO₂磷固定膜表面磷累积量与表面 灰度的校正曲线，将得到的灰度转化成磷累积量，实现高分辨地获取沉积物活性磷的二维 分布。本发明使用ZrO₂固定膜，由于ZrO₂耐酸性非常强，在钼蓝显色等强酸性环境下ZrO₂颗粒不会溶解，同时固定膜能够保持稳定的形状，因此，利用该膜可发展用于磷测定的CID 技术。

所述的磷固定膜优选为改进型ZrO₂聚丙烯酰胺凝胶薄膜，所述的磷固定膜表面均匀分 布粒径≤5μm的二氧化锆颗粒。该磷固定膜的制备方法可参见2011103235556。

所述的DGT装置包括固定膜和厚度仅有0.1-0.13mm的微孔滤膜(孔径优选为0.45微 米)，微孔滤膜作为扩散层。

所述方法中，DGT装置在土壤或沉积物中放置时间为1天，保持上覆水3-5cm。

取出磷固定膜后，将磷固定膜热处理。由于磷固定膜中的ZrO₂固定剂对磷的吸附能力 随着温度上升而增加，对固定膜进行热处理，可促使磷在固定膜中被进一步吸附和固定， 避免显色过程中磷和有色物质的扩散，这对于保持CID分析的高分辨优势是必要的。反之， 如果不进行热处理，显色过程中磷和有色物质不能持续被固定到原有位置，甚至有部分扩 散到溶液，造成CID分析获得的信息失真。

进行热处理的方法是将磷固定膜置于去离子水中，85℃恒温处理120h以上。热处理 的效果可以从图2至图4中看出来。将已吸收磷的固定膜与未吸收磷的固定膜用双面胶固 定到一起(图2)，放入显色剂中进行着色。已吸收磷固定膜未进行热处理时，在着色30至 90分钟后，空白膜与已吸收磷固定膜接触的边缘灰度明显升高，随着距离延长降低，但空 白膜的整体灰度值与着色前相比有明显的增加，说明在已吸收磷固定膜着色时，有磷和有 色物质扩散，对空白膜产生了污染(图3、4)。当对已吸收磷固定膜进行热处理后，随着处 理时间的延长，空白膜边缘灰度降低，梯度变缓。当热处理时间延长至120h后，空白膜的 灰度与着色前相比未有明显的增加，说明已吸收磷固定膜在着色时，没有出现磷和有色物 质的扩散。

热处理后再将薄膜再放入显色剂中进行显色，显色剂可采用磷钼蓝比色法中所使用的 显色剂，由钼酸铵储备液加抗坏血酸(100mL∶1.5g)稀释10倍后制得。优选地，显色温度控 制在35℃，显色时间为45min。

基于CID技术，利用扫描仪对着色后的薄膜进行扫描，利用软件，如ImageJ等将扫描 获得图像的颜色转成灰度，再利用事先建立的ZrO₂膜表面的磷累积量与表面灰度的校正曲 线，将得到的灰度转化成磷累积量。

更为详细地描述所述的技术方案，具体包括如下步骤：

(1)改进型磷固定膜制备：将含水率为45-55％的二氧化锆粉末和丙烯酰胺溶液按质 量体积比1∶3～1∶6混匀，研磨后超声破碎，静置除去沉淀物后，加入丙烯酰胺溶液体积的 1/1600～1/1400的四甲基二乙胺和1/40～1/60的10％(wt)的过硫酸铵溶液，混合均匀后将混合 液注入玻璃模具中，低于室温下水平放置，待锆粉自由沉降后，升温至40～60℃，直至混 合液形成凝胶膜，在去离子水中浸泡12小时以上，得到改进型磷固定膜；

(2)DGT装置组装：将改进型磷固定膜、微孔滤膜依次叠加后组装成DGT装置；

(3)充氮：将DGT装置放入盛有去离子水的容器中，向水中充纯氮12h以上以保证去 除DGT装置中含有的氧；

(4)DGT装置放置：将DGT装置垂直插入土壤或沉积物中，保留3-5cm暴露于上覆水 中，放置1天后，取出磷固定膜并标记土壤界面或沉积物-上覆水界面；

(5)膜热处理：磷固定膜接触磷溶液一面朝上置于装有去离子水的玻璃容器中，放入 85℃恒温烘箱中，5天后取出；

(6)膜显色：将热处理后的磷固定膜取出，加入磷显色剂，35℃恒温显色45min；

(7)扫描和灰度获取：利用扫描仪将着色后的磷固定膜进行扫描，分辨率设置为300 dpi(相当于0.169mm×0.169mm)～600dpi(相当于0.0423mm×0.0423mm)，将扫描获 得的表面图像转成灰度；

(8)建立所述的磷固定膜表面磷累积量与表面灰度的校正曲线；

(9)数据处理：根据磷固定膜表面磷累积量与表面灰度的校正曲线，将灰度值换算成 单位面积磷累积量；

再根据Fick第一定律将磷固定膜表面累积量换算成对应位置土壤或沉积物中活性磷的 含量：

$C_{\mathrm{DGT}}=\frac{\mathrm{M\Delta g}}{D_{g}t}\times {10}^3$

上式中，M为膜单位面积的累积量，单位为μg/cm²，Δg为扩散膜厚度，单位为cm；D_。为磷酸根离子在扩散膜中的扩散系数，单位为cm²/s；t为放置时间，单位为s，C_DGT为活 性磷浓度，单位为μg/L；

最后，作出C_DGT的二维分布图。

本发明方法结合CID技术，实现对DGT固定膜上磷积累量的二维、高分辨的快速测定， 再将获得的磷积累量换算成湿地土壤或沉积物中对应位置的活性磷含量。本发明的优点及 有益效果包括：

1)直接采用厚度更薄的滤膜作为扩散层，简化了DGT装置，同时提高了单位时间DGT 的吸收量，缩短了放置时间，节省了材料。

2)能够快速获取活性磷的二维空间分布信息。2011103235556中对沉积物中活性磷空 间分布信息的获取采用切片-提取-测定的方法，本发明比现有技术简单快速，利用CID技 术直接扫描灰度值，不需测定，节约了大量时间。

3)获得活性磷空间信息的分辨率高。本发明的空间分辨率可达0.0423mm×0.0423mm， 比切片-提取-测定方法得到的0.45mm×0.45mm高将近一个数量级。通过热处理可避免着色 过程中磷和有色物质的扩散，这使得空间分辨率进一步提高，扫描所得的精细的活性磷二 维数据能够非常准确的反映活性磷在沉积物中的空间变化。

4)采用CID技术可成批处理样品，快速获得数据信息，提高工作效率，可同时直观获 得不同剖面磷的分布信息。

5)对仪器设备的要求低，有利于推广应用。本发明方法只需增加一台合适的扫描仪和 相应的软件(如ImageJ1.46)，在一般实验室均可配置；所需其他仪器设备均为实验室DGT 技术的常规配置，因此本发明方法在一般实验室均可实现，有利于推广应用。

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。本发明的保护范围并不以具体实施方式 为限，而是由权利要求加以限定。

附图说明

图1是DGT装置示意图。图中1为磷改进型固定膜，2为滤膜。

图2用于测试磷固定膜着色过程是否扩散的装置设计示意图。将已吸收磷的固定膜与 未吸收磷的固定膜用双面胶固定到一起，放入显色剂中进行着色。已吸收磷的固定膜热处 理的时间从0延长至120h，着色时间从30min延长至90min。

图3是按照图2设计获得的已吸收磷固定膜与空白膜着色后的图片。

图4是按照图2设计获得的空白膜灰度变化图。

图5是利用本发明方法获得的太湖沉积物剖面活性磷的分布图。(5a)活性磷剖面分布； (5b)和(5c)为图5a中b和c处局部浓度升高的放大立体图。

具体实施方式

根据本发明方法，获取太湖沉积物中活性磷活性磷的二维分布数据。将DGT装置放入 太湖东太湖沉积物中，1天后取出，运回实验室，取出固定膜进行热处理，然后着色-扫描， 将灰度值换算成磷的累积量，获得沉积物剖面中活性磷含量和空间分布。

具体操作包括：

(1)改进型磷固定膜制备：将含水率为45-55％的二氧化锆粉末和丙烯酰胺溶液按质 量体积比1∶3～1∶6混匀，研磨后超声破碎，静置除去沉淀物后，加入丙烯酰胺溶液体积的 1/1600～1/1400的四甲基二乙胺和1/40～1/60的10％(wt)的过硫酸铵溶液，混合均匀后将混合 液注入玻璃模具中，低于室温下水平放置，待锆粉自由沉降后，升温至40～60℃，直至混 合液形成凝胶膜，在去离子水中浸泡12小时以上，得到改进型磷固定膜；

(2)DGT装置组装：将改进型磷固定膜、微孔滤膜依次叠加后组装成DGT装置；

(3)充氮：将DGT装置放入盛有去离子水的容器中，向水中充纯氮12h以上以保证去 除DGT装置中含有的氧；

(4)DGT装置放置：将DGT装置垂直插入土壤或沉积物中，保留3-5cm暴露于上覆水 中，放置1天后，取出磷固定膜并标记土壤界面或沉积物-上覆水界面；

(5)膜热处理方法：固定膜接触磷溶液一面朝上置于装有去离子水的玻璃容器中，放 入85℃恒温烘箱中，5天后取出。

(6)膜着色方法：将热处理后的固定膜取出，加入40ml1∶10磷显色剂，35℃恒温显色 45min。

(7)扫描和灰度获取：利用扫描仪将着色后的薄膜进行扫描，分辨率设置为300dpi (相当于0.169mm×0.169mm)-600dpi(相当于0.0423mm×0.0423mm)，利用ImageJ软 件将扫描获得的颜色转成灰度。

(8)建立的ZrO₂膜对磷累积量与表面灰度的校正曲线：

y＝-167.3e^-x/6.51+214.6

上式中，x为膜单位面积的累积量，单位为μg/cm²，y为对应的灰度值。

(9)数据处理：根据ZrO₂膜对磷累积量与表面灰度的校正曲线，将灰度值换算成磷单 位面积累积量M(即上式中的x)，单位为μg/cm²；

再根据Fick第一定律将该累积量换算成对应沉积物中活性磷的含量：

$C_{\mathrm{DGT}}=\frac{\mathrm{M\Delta g}}{D_{g}t}\times {10}^3$

上式中，Δg为扩散膜厚度，单位为cm；D_g为磷酸根离子在扩散膜中的扩散系数，单 位为cm²/s；t为放置时间，单位为s，C_DGT为活性磷浓度，单位为μg/L；

最后，作出C_DGT的二维分布图。