一种利用柱孢霉属真菌菌株制备壳二孢氯素的方法

摘要

本发明公开了一种利用柱孢霉属真菌菌株制备壳二孢氯素的方法。本发明所利用的菌株是柱孢霉属真菌NCC3746（Cylindrocarponsp.），保藏编号为CGMCCNo.7756。本发明提供的制备壳二孢氯素的方法，壳二孢氯素的发酵单位达到了1600mg/L以上，高于目前已见报道的壳二孢氯素的发酵单位，并开发了简便易行的结晶纯化工艺，收率60%以上，产品纯度达到97.0%以上，可以用于壳二孢氯素的工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种利用柱孢霉属真菌菌株制备壳二孢氯素的方法。>

背景技术

壳二孢氯素是1968年，首次由日本学者Tamura等从丝孢纲壳二孢属真菌蚕豆壳二孢（Ascochyta>）的代谢产物中分离得到的一种异戊烯酚类化合物（Tamura G, et al. J. Antibiot, 21: 539-544, 1968），具有抗病毒、抗肿瘤、抗细菌和镇静活性并且具有降低胆固醇及甘油三酯水平、降低血压，改善I型及II型糖尿病的作用(Hong S, et al.,J. Biol Chem,280(26): 25202-25209, 2005; Tsuruga M, et al., J. Antibiot, 60(1): 20-26,2007; Sakaguchi K, et al., Biochem Bioph Res Commun, 329(1): 46-50, 2005; Tsuruga M, et al., Apoptosis, 9(4): 429-435, 2004)，具有巨大的应用前景。>

壳二孢氯素可由镰刀菌属（Fusarium>Nectria coccinea）（Andridge,>Verticillium>Cylindrocarpon>

发明内容

本发明的目的是提供一种利用柱孢霉属真菌菌株制备壳二孢氯素的方法。>

本发明所利用的柱孢霉属真菌菌株，其保藏名称为NCC3746，其分类命名为柱孢（Cylindrocarponsp.），保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2013年6月19日，保藏编号为CGMCC>

本发明所利用的真菌菌株NCC3746，经宏观及显微形态特征及ITS序列比对分析将其鉴定为柱孢霉属（Cylindrocarpon>

本发明所述的柱孢霉属真菌菌株NCC3746鉴定方法为将菌株NCC3746的孢子液涂布于载玻片上，于400倍显微镜下进行显微形态观察。将菌株NCC3746的孢子液点种于4种通用培养基：CMA（玉米粉琼脂）、PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）、MA（麦芽粉琼脂）、CzA（察氏琼脂）中，26℃下培养14天，进行宏观形态观察。经过宏观及显微形态观察以及ITS序列的比对分析，将NCC3746鉴定为柱孢霉属。>

本发明所述的柱孢霉属（Cylindrocarpon>

本发明所述菌株NCC3746的土壤样品采集方法为用无菌铲铲去靠近植物根部土壤的表层的腐殖土，然后取距离地表深度为5-10cm的土样约30克置于已灭菌的纸袋中保存。>

本发明所述的菌株NCC3746土壤样品的分离方法为取1克该样品加入到10mL无菌水中充分振荡，随后取1mL混悬液加入到另一支装有9mL无菌水的试管中充分振荡，依此类推进行梯度稀释直至10^-10浓度。每个浓度取0.2mL涂布PDA双碟，随后在26℃下进行静置培养，双碟培养周期为3-10天，在此期间从双碟中挑取形态不同的菌落于PDA（北京双旋）斜面中进行培养，斜面培养时间为14天。通过上述方法获得了一株真菌，将其命名为NCC3746。>

采用本发明所述菌株NCC3746，可同时生产壳二孢氯素和二氢壳二孢氯素，其壳二孢氯素的发酵单位达到了1600mg/L以上，二氢壳二孢氯素的发酵单位达到了1300mg/L以上，在结晶过程中，发酵单位高的壳二孢氯素优先结晶出来，从而抑制二氢壳二孢氯素的结晶，将其巧妙的分离，壳二孢氯素收率60%以上，产品纯度达到97.0%以上，可以用于壳二孢氯素的工业化生产。>

本发明所提供的利用柱孢霉属真菌菌株制备壳二孢氯素的方法，包括以下步骤：>

a、制备柱孢霉属真菌NCC3746的种子液：

将菌株NCC3746的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，22-30 ℃、转速100-220 rpm培养48-72 h获得种子液；其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉10.0-30.0克、葡萄糖10.0-30.0克、热榨黄豆饼粉0.5-2.0克、麦芽粉3.0-6.0克、酵母粉1.0-3.0克、氯化钠0.5-2.0克、七水硫酸镁0.5-2.0克，加水定容至1000 mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。

b、制备柱孢霉属真菌NCC3746的发酵液：>

将上述种子液以体积百分比3-10 %的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵温度22 -30 ℃、发酵时间120-180 h，得到发酵液；其中所述的发酵培养基按以下方法制得：葡萄糖20.0-40.0克、可溶性淀粉20.0-40.0克、热榨黄豆饼粉4.0-20.0克、棉籽粉4.0-20.0克、磷酸钾1.0-10.0克、氯化钠0.5-2.0克、七水硫酸镁0.5-2.0克，加自来水定容至1000 mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30 min。

c、将上述发酵液离心10-20 min，弃去上清液，获得菌丝体。>

d、用有机溶剂水溶液对菌丝体浸提2-4次，每次2-4小时，弃去第一次浸提液，合并之后浸提液，减压浓缩，除去有机溶剂，得到浓缩液。>

e、浓缩液加入甲醇，溶解，得溶液。>

f、将上述溶液静置，析出结晶，过滤除去母液，得到壳二孢氯素粗品。>

g、将壳二孢氯素粗品加入甲醇和丙酮的混合溶剂中，溶解，静置重结晶，滤除母液，得到壳二孢氯素纯品。>

所述步骤b中的摇瓶发酵，其转速为100-220 rpm；>

所述步骤b中的发酵罐发酵，发酵条件为其罐压为0.05±0.01Mpa、通气量为10-30 L/min，搅拌速度为400-500 rpm。

所述步骤d中第一次浸提用有机溶剂水溶液的体积百分浓度为30-60%，之后浸提用有机溶剂水溶液的体积百分浓度为90-100%；所述有机溶剂水溶液为乙醇水溶液或丙酮水溶液。>

所述步骤c中离心转速为4000 rpm。>

所述步骤d中减压浓缩在30-50 ℃进行。>

所述步骤f、g中的结晶，壳二孢氯素浓度在90-130 mg/mL，温度为室温10-25℃，结晶时间在24-48 h之间，过滤后用少量有机溶剂洗涤或母液洗涤滤饼。>

所述步骤e、g中的溶解，为超声溶解或搅拌溶解，可以超声加热或用其它方式搅拌情况下加热，加热温度为40-50 ℃。>

所述步骤g中甲醇和丙酮的体积比为1:1至3:1。>

上述优选条件，其所获得壳二孢氯素产量更高。>

本发明中柱孢霉属真菌NCC3746为野生菌株，利用其制备壳二孢氯素，发酵单位达到了1600 mg/L以上，高于目前已见报道的壳二孢氯素发酵产量，采用结晶方法分离纯化发酵液中两个结构非常相似的主要组分壳二孢氯素和二氢壳二孢氯素，壳二孢氯素总收率达到60%以上，产品纯度达到97.0%以上，制备工艺简便易行、适于工业化生产。>

附图说明

图1为菌株的分生孢子的显微形态。>

图2为菌株在CMA上14天的菌落形态。>

图3为菌株在PDA上14天的菌落形态。>

图4为菌株在MA上14天的菌落形态。>

图5为菌株在CzA上14天的菌落形态。>

图6为50L罐发酵液HPLC分析色谱图。>

图7为壳二孢氯素HPLC分析色谱图。>

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为工业级原料；分析色谱柱Inertsil ODS-SP, 5μm, 4.6×250 mm购自日本岛津，提取过程所用有机溶剂购自北京化工厂，色谱溶剂购自霍尼韦尔贸易（上海）有限公司。>

实施例1、柱孢霉属菌株NCC3746的分离及鉴定

（1）、菌株NCC3746的分离

真菌菌株NCC3746的分离用培养基为PDA（北京双旋）；

取1克土壤样品（采自中国四川省眉山市洪雅县瓦屋山原始森林的土壤），放入装有9mL无菌水的50mL离心管中，充分振荡。取1mL悬浊液放入装有9mL无菌水的试管中，混匀。依次进行系列梯度稀释直到10^-10。每个梯度下取0.2mL涂板。所涂平板置于26℃下进行培养，从中获得了一株真菌，将其命名为NCC3746。

（2）、菌株NCC3746的鉴定>

将菌株NCC3746的孢子液涂布于载玻片上，于400倍显微镜下进行显微形态观察。将菌株NCC3746的孢子液点种于4种通用培养基：CMA（玉米粉琼脂）PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）MA（麦芽粉琼脂）CzA（察氏琼脂）中，26℃下培养14天，进行宏观形态观察。

菌株NCC3746产生的分生孢子通常具有3或4个横隔，分生孢子呈圆柱形，两端较钝；分生孢子的主体长度为75-95um左右；菌株NCC3746的分生孢子显微形态照片（图1）。>

菌株NCC3746在4种通用培养基中的形态特征如下：>

NCC3746在CMA（玉米粉琼脂）上14天，菌落直径达到47-50mm；菌落光秃，呈灰黑色；表层有稀疏的棉絮状菌丝；菌落中央部位微隆起，并有枫叶状不规则花纹，花纹直径范围在30mm左右；背部呈灰黑色；产孢数量较少，孢子数量约在1.4╳10⁶个，孢子长度范围在45-100um，宽度范围在7.5-10>

NCC3746在PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）上14天，菌落直径达到47-49mm；菌落表面有棉絮状菌丝；菌落中央部位呈紫色，其余部位呈淡黄白色；中央部位隆起，范围约为10mm左右；菌落有较规则的放射状纹路；菌落背部中央呈棕黄色，向边缘逐渐变淡，边缘呈白色；产孢数量较多，孢子数量约在2.25╳10⁷个，孢子长度范围在50-100 um，宽度范围在7.5-10 um，NCC3746菌株在PDA上14天的菌落形态（图3）。>

NCC3746在MA（麦芽粉琼脂）上14天，菌落直径达到42-44mm；菌落表面呈棉絮状；中央部位隆起，范围约5-6mm；隆起部位底部呈淡蓝绿色，顶部为棕色；隆起部位周围覆盖有白色棉絮状菌丝，菌丝由中央至边缘逐渐稀疏；背部中央呈棕黄色，向边缘逐渐变淡，边缘呈白色。产孢数量较多，孢子数量约在4.75╳10⁶个，孢子长度范围在55-85um，宽度范围在7.5-10 um，NCC3746菌株在MA上14天的菌落形态（图4）。>

NCC3746在CzA（察氏琼脂）上14天，菌落直径达到48-50mm；菌落光秃；菌落呈无色；表层有稀疏絮状菌丝；中央部位微隆起；菌落有3-4圈不规则同心环状沟纹；菌落背部无色；产孢数量较少，1.4╳10⁶个，孢子长度范围在50-95 um，宽度范围在5-10 um，NCC3746菌株在CzA上14天的菌落形态（图5）。>

ITS序列经测定含有587bp，测定结果（见说明书序列表）。经过NCBI比对，与柱孢霉属(Cylindrocarpon sp.)亲缘关系最近。>

因此根据宏观及显微形态特征以及ITS序列比对分析结果，将NCC3746鉴定为柱孢霉属(Cylindrocarpon sp.)。>

实施例2、50L罐发酵壳二孢氯素的制备

(a) 制备柱孢霉属真菌NCC3746种子液

将柱孢霉属真菌NCC3746接种于种子培养基，26 ℃、转速200 rpm培养72 h获得种子液。种子培养基的制备方法为：玉米淀粉20.0克、葡萄糖10.0克，热榨黄豆饼粉2.0克、麦芽粉6.0克、酵母粉2.5克，氯化钠 2.0克，七水硫酸镁 1.0克，加自来水溶解定容至1000 mL，pH值6.5-7.0，121 ℃灭菌30 min。

(b) 制备柱孢霉属真菌NCC3746的发酵液>

将种子液以体积百分比5%的接种量接种于装有30 L发酵培养基的发酵罐，罐温26 ℃、罐压0.05±0.01 Mpa、通气量30 L/min，400 rpm搅拌，发酵168 h。发酵培养基的制备方法为：葡萄糖29.0克、可溶性淀粉 30.0克、棉籽粉14.0克、热榨黄豆饼粉14.0克，K₂HPO₄>4·7H₂O>

(c) 发酵完毕后进行HPLC检测（流动相：75% CH₃CN，流速：1.0 mL/min），色谱图见图6，壳二孢氯素发酵单位为1806 mg/L。将柱孢霉属真菌NCC3746的27 L发酵液4000 rpm离心15 min，上清弃去，获得菌丝体约3.3 L。>

（d）菌丝体首先使用10 L 50%乙醇水溶液浸提4 h，浸提完毕后将第一次浸提液舍弃。之后每次用13 L 95%乙醇浸提，浸提两次，每次4 h。合并两次浸提液，40 ℃减压浓缩至无乙醇，得到浓缩液约300 mL。其中壳二孢氯素与二氢壳二孢氯素含量比例为11:9。>

（e）浓缩液加入80mL甲醇，超声同时50℃加热3-5分钟至充分溶解，得到粘稠溶液，其中壳二孢氯素浓度约128 mg/mL。>

（f）上述溶液在室温下静置约40h后得到大量晶状颗粒析出物壳二孢氯素晶体，滤除母液并用30 mL甲醇清洗，清洗两次，减压抽干溶剂，得到壳二孢氯素粗品39.5 g，HPLC分析纯度81%。>

（g）将上述壳二孢氯素粗品加入330mL甲醇与丙酮(v:v=2:1)混合溶液中，50℃水浴加热并超声至溶解，壳二孢氯素浓度为96.9 mg/mL，定性滤纸过滤后室温静置28 h，得到壳二孢氯素结晶，滤除母液后用35 mL甲醇清洗晶体两次，再用50 mL石油醚清洗一次，最后抽干溶剂得壳二孢氯素精品32.1 g（HPLC分析谱图见图7），含量97.5 %，总收率63.9%。>

壳二孢氯素分子式为：C₂₃H₂₉ClO₄，ESI-MS>+，403.17>-；>max>o(c, 0.99, MeOH)。>

¹H-NMR(500MHz,>3) δ(ppm): 0.70(3H, s), 0.81(3H,d, J=6.5Hz), 0.83(3H,d, J=6.5Hz), 1.62 (1H, m), 1.92(3H, s), 1.95(2H, m), 2.35-2.43 (3H, m), 2.60(3H, s), 3.54(2H,d, J=7.5Hz), 5.38(1H,d, J=16.0Hz), 5.52(1H,t, J=7.5Hz), 5.91(1H,d, J=16.0Hz), 6.42(1H, s), 10.14(1H, s), 12.71(1H, s)。>

¹³C-NMR(125MHz,>3)>3),>3),>3),>3),>3), 22.2(C-1′), 31.1(C-8′), 40.8(C-9′), 41.6(C-7′), 48.5(C-6′), 53.6(C-11′), 113.1(C-5), 113.6(C-3), 113.7(C-1), 127.5(C-2′), 133.2(C-4′), 134.1(C-3′), 135.6(C-5′), 137.8(C-6), 156.1(C-4), 162.2(C-2), 193.2(1-CHO), 212.8(C-10′)。>

壳二孢氯素的化学结构式>

实施例3、摇瓶发酵壳二孢氯素的制备

（a）制备柱孢霉属真菌NCC3746的种子液

将柱孢霉属（Cylindrocarpon>

（b）制备柱孢霉属真菌NCC3746的发酵液>

将种子液以体积百分比5%的接种量接种于装有150mL发酵培养基的1000mL摇瓶，28.5 ℃、转速220 rpm，发酵144 h。发酵培养基的制备方法为：葡萄糖29.0克、可溶性淀粉 30.0克、棉籽粉14.0克、热榨黄豆饼粉14.0克，K₂HPO₄>4·7H₂O>

(c) 发酵完毕后经检测壳二孢氯素发酵单位为2115 mg/L。将柱孢霉属真菌NCC3746的4L发酵液4000 rpm离心，上清弃去，获得菌丝体约500 mL。>

（d）菌丝体首先使用2 L 35%丙酮水溶液浸提3 h，浸提完毕后将第一次浸提液舍弃，之后用2 L 工业丙酮浸提，重复浸提三次，每次3 h。合并三次浸提液，50 ℃减压浓缩至无丙酮，得到浓缩液约50 mL。其中壳二孢氯素和二氢壳二孢氯素的质量含量比为9:8。>

（e）浓缩液加入30 mL的甲醇，超声加热2 min至充分溶解。壳二孢氯素浓度为105.8 mg/mL。>

（f）上述溶液在室温下静置约40h得到固体析出物壳二孢氯素晶体，滤除母液并用15mL甲醇清洗，清洗两次，减压抽干溶剂，得到壳二孢氯素粗品6.93g，HPLC分析纯度82%。>

（g）将壳二孢氯素粗品溶于64 mL甲醇和丙酮（v:v=3:1）混合溶液中，45℃水浴加热并超声至全部溶解，壳二孢氯素浓度为90.6 mg/mL，滤纸过滤后静置于室温下。24h后得到壳二孢氯素晶体，滤除母液，晶体用10 mL甲醇清洗两次，再用25 mL石油醚清洗一次，之后抽干溶剂，得到壳二孢氯素精品5.25g，HPLC含量98 %，总收率62 %。>

实施例4、摇瓶发酵壳二孢氯素的制备

（a）制备柱孢霉属真菌NCC3746的种子液

将柱孢霉属（Cylindrocarpon>

（b）制备柱孢霉属真菌NCC3746的发酵液>

将种子液以体积百分比3%的接种量接种于装有40mL发酵培养基的250mL摇瓶，22 ℃、转速100 rpm，发酵180 h。发酵培养基的制备方法为：葡萄糖20.0克、可溶性淀粉40.0克、棉籽粉4.0克、热榨黄豆饼粉4.0克，K₂HPO₄>4·7H₂O>

(c) 发酵完毕后经检测壳二孢氯素发酵单位为1768 mg/L。将柱孢霉属真菌NCC3746的2L发酵液4000 rpm离心，上清弃去，获得菌丝体约200 mL。>

（d）菌丝体首先使用1 L 30%丙酮水溶液浸提4 h，浸提完毕后将第一次浸提液舍弃。之后每次用1L 工业丙酮浸提，浸提两次，每次4 h。合并两次浸提液，30 ℃减压浓缩至无丙酮，得到浓缩液约30 mL。>

（e）浓缩液加入6 mL的甲醇，超声加热4min至充分溶解。壳二孢氯素浓度为98.2mg/mL。>

（f）上述溶液在室温25℃下静置约24h后得到固体析出物壳二孢氯素晶体，滤除母液，固体用10mL甲醇清洗，清洗两次，减压抽干溶剂，得到壳二孢氯素粗品3.31g，HPLC分析纯度80%。>

（g）将壳二孢氯素粗品溶于25 mL甲醇和丙酮（v:v=1:1）混合溶液中，40℃水浴加热并超声至全部溶解，滤纸过滤后静置于室温下，其中壳二孢氯素浓度108.1mg/mL。24h后得到壳二孢氯素晶体，滤除母液，晶体用8mL甲醇清洗两次，再用10 mL石油醚清洗一次，之后抽干溶剂，得到壳二孢氯素精品2.23g，HPLC含量97.9 %，总收率63 %。>

实施例5、摇瓶发酵壳二孢氯素的制备

（a）制备柱孢霉属真菌NCC3746的种子液

将柱孢霉属（Cylindrocarpon>

（b）制备柱孢霉属真菌NCC3746的发酵液>

将种子液以体积百分比10%的接种量接种于装有40mL发酵培养基的250mL摇瓶，30 ℃、转速220 rpm，发酵120 h。发酵培养基的制备方法为：葡萄糖40.0克、可溶性淀粉20.0克、棉籽粉20.0克、热榨黄豆饼粉20.0克，K₂HPO₄>4·7H₂O>

(c) 发酵完毕后经检测壳二孢氯素发酵单位为1961 mg/L。将柱孢霉属真菌NCC3746的2L发酵液4000 rpm离心，上清弃去，获得菌丝体约200 mL。>

（d）菌丝体首先使用1 L 55%乙醇水溶液浸提2 h，浸提完毕后将第一次浸提液舍弃。之后用浸提两次，每次用1L 95%乙醇浸提，每次2 h。合并两次浸提液，50 ℃减压浓缩至无乙醇，得到浓缩液约30 mL。>

（e）浓缩液加入10 mL的甲醇，超声加热2min至充分溶解。壳二孢氯素浓度98mg/mL。>

（f）上述溶液在室温约10℃下静置约48h后得到固体析出物壳二孢氯素晶体，滤除母液并用10mL甲醇清洗，清洗两次，减压抽干溶剂，得到壳二孢氯素粗品3.86g，HPLC分析纯度83%。>

（g）将壳二孢氯素粗品溶于30 mL甲醇和丙酮（v:v=3:1）混合溶液中，50℃水浴加热并超声至全部溶解，滤纸过滤后静置于室温下，其中壳二孢氯素浓度91.4mg/mL。24h后得到壳二孢氯素晶体，滤除母液，晶体用10 mL甲醇清洗两次，再用15 mL石油醚清洗一次，之后抽干溶剂，得到壳二孢氯素精品2.52g，HPLC含量98 %，总收率64%。>