一种能够在哺乳动物肌肉组织中特异启动基因表达的启动子序列及其应用

摘要

本发明涉及一种能够在哺乳动物肌肉组织中特异启动基因表达的启动子序列，所述序列包含SEQ ID NO.1的核苷酸序列或者与其互补的核苷酸序列。所述肌肉组织特异启动子序列还包括酶切位点，所述的酶切位点位于SEQ ID NO.1的核苷酸序列或者与其互补的核苷酸序列的两端，所述的酶切位点分别是xhol和hind III。所述序列涉及含有上述肌肉特异启动子序列的表达载体。所述序列涉及上述载体在制备转基因哺乳动物或转染哺乳动物细胞中的应用。该发明技术涉及肌肉组织特异性启动子，通过构建相应的表达载体，基因的表达只限于肌肉组织，在基因工程中起到较好的作用。通过外源基因在动物骨骼肌中的特异性表达可很好的研究肌肉的分化或基因的功能及改善肌肉的风味与质量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够在哺乳动物肌肉组织中特异启动基因表达的启动子序列及其 应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

MRF4(myogenic regulatory factors4)是生肌决定因子MRF(myogenic regulatory  factors)家族的一员，此基因家族在胚胎发育过程中调控肌肉细胞的增殖和分化，与动 物肌肉中肌纤维的数量和粗细有密切关系。MRF4在分化的肌管中表达，调控着成肌细 胞的分化和肌管的融合。在心肌，平滑肌和面部肌肉中不表达，只在分化的骨骼肌中有 表达。MRF4具有高度保守的螺旋-环-螺旋(bHLH)碱性区，是一个骨骼肌特异性的转 录调节因子，bHLH区是执行调控的重要区域，bHLH区可以与普遍存在的蛋白E12和 E47形成异源二聚体，此二聚体可以与靶基因启动子序列的E-box位点结合，调节靶基 因的转录。

在小鼠胚胎发育过程中，在妊娠9天的胚胎中(E9)MRF4瞬时开始表达，启动Myf5 表达后MRF4的表达逐渐减少直到消失，胚胎发生的第16天(E16)时，胎儿体内分 化的肌纤维中MRF4再次表达，直至出生后还一直维持在较高的水平，这就说明MRF4 的功能可能是维持肌肉细胞分化的状态。而且在敲除MRF4基因的情况下，胚胎可以正 常发育，所以MRF4并不是肌肉分化所必需的，但是在分化的肌肉中能够特异性的表达。 肌肉组织特异性启动子，在这类启动子的驱动下，通过构建相应的表达载体，基因的表 达只限于肌肉组织，在基因工程中越来越获得研究者的青睐。通过外源基因在动物骨骼 肌中的特异性表达可很好的研究肌肉的分化或基因的功能及改善肌肉的风味与质量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够在哺乳动物肌肉组织中特异启动基因表达的启动 子序列及其应用，以便更好地表达哺乳动物的基因，便于研究改善哺乳动物肌肉的分化 及改善。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。

一种能够在哺乳动物肌肉组织中特异启动基因表达的启动子序列，所述序列包含 SEQ ID NO.1的核苷酸序列或者与其互补的核苷酸序列。

进一步地，所述肌肉组织特异启动子序列还包括酶切位点，所述的酶切位点位于 SEQ ID NO.1的核苷酸序列或者与其互补的核苷酸序列的两端，所述的酶切位点分别是 xho1和hindIII。

进一步地，所述序列涉及含有上述肌肉特异启动子序列的表达载体。

进一步地，所述序列涉及上述载体在制备转基因哺乳动物或转染哺乳动物细胞中 的应用。

进一步地，所述载体用于小鼠哺乳动物或哺乳动物细胞中特异性的启动基因在肌肉 及分化的肌管中表达。

该发明的有益效果在于：该发明技术涉及肌肉组织特异性启动子，在这类启动子的 驱动下，通过构建相应的表达载体，基因的表达只限于肌肉组织，在基因工程中起到较 好的作用。通过外源基因在动物骨骼肌中的特异性表达可很好的研究肌肉的分化或基因 的功能及改善肌肉的风味与质量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行描述，以便更好的理解本发明。

实施例

一种能够在哺乳动物肌肉组织中特异启动基因表达的启动子序列，为MRF4肌肉特 异启动子序列的合成(根据“肌肉特组织特异性启动子生物信息学设计路线”的最终序 列直接合成)，具体如下：

CCGCTCGAGccatatttgggtgtgcctgggggttataattaacccggacacgtggcgacctcaccccaccaacacctgccccc gcgtccccccagccccagcacctcaggtctcccagaggagatcgcgagcaatgagctctaaaaataaactcccttcccggcatgatta agcaactatttcttgaactggtagtgaaactttatggaatagtgtgtttgtacagtggtgactatttgtcacagtaggctctgacaccggcatt caagcaccaaccaaattgggcaatatgtcataaggagccagttggggggcagtaacaaaatccttggataaccattctataccagaga catctgcttatctttgcagacagtaactccaggcatctctgtaatctcgatattgtaaatatcataattcatctgaaagtcatgtataaccttgg aaggactgtaatggttttatcacaggaatagcatctttttgagaggcaggagagagaaaagacctgaaccactctgcaaatattaaacaa gctattttggagcaatggctattgcctttgaaatctttcatcatgggtctatacttagaattcagatgagcctgggggaggggaacagtgca gtgttaatccccagttgttttgaacttgtcctgtaagcaggttagcctctaaagtgtcccaaattgaagtgttcgatgctttgtttaaatttagg agtccatatattttgttttaacctgtcctgcatataggttgtcacatcattctaaaggtgacacttctcagttttctttcaaactagatgttctaga gagcactgggtgtaatcacattgagagactgatgctccatgacagctaaaagttggattgagtttcaggagctactatatataaagctgg ggcgacttatgtcaccgcactaattaaatgccatctgggtaaccacccagaaccttctgggtttttgagcccatcaccctgttcagaccaa gtcagaggccaaggaagagaacAAGCTTGGG

其中包括MRF4肌肉特异启动子序列和两端的xho1和hind III酶切位点及保护碱基。 将此序列送至takara公司，进行人工合成。检测载体构建过程如下：

(1)质粒提取：将合成的MRF4肌肉特异启动子序列连接到PMD19T-simple载体 中，挑取穿刺菌加入到LB液体培养基中37℃摇菌14-16h。质粒提取方法具体步骤如 下：收集菌液于EP管中，5000rpm离心1min，弃去上清，加入150μl重悬液，充分震 荡；加入250μl裂解液，反复颠倒混匀；加入350μl中和液，反复颠倒混匀；14，000rpm 离心5min；将上清移至吸附柱中，14,000rpm离心1min，弃去废液；加入500μl洗涤 液，14,000rpm离心1min，弃去废液，并重复1次；再次离心离心柱-收集管组合1min， 以使残留的清洗液充分挥发。小心地将小柱转入干净的1.5ml离心管，加50ul无RNA 酶水到小柱中央，室温孵育1min后，14,000rpm离心1min。丢弃小柱，将装有目的片 段的洗脱液保存于-20℃。

(2)MRF4启动子片段回收，MRF4启动子通过xho1和hind III双酶切回收，酶切 体系如表1所示。

表1：

d H₂O 25.6μl 10Xfast buffer 2μ1 FAD3质粒 1.6μg xho1酶(takara) 1μl hind III酶(takara) 1μl 总体积 30μl 酶切温度 37℃ 酶切时间 15min

酶切片段胶回收步骤为：

a.制备0.8％琼脂糖凝胶一块，加入酶切产物及5000bp marker后，80V，电泳50min。

b.将凝胶中目的条带切出，加入对应体积的膜结合液，70℃融胶20min，每隔几分 钟Vortex离心管以加速胶块的融解。室温短暂离心，使溶液集中于管底。

c.将小柱装入收集管中，每份样品准备一套。把融解的凝胶转入以上组合的小柱中， 并在室温下孵育1min。14,000rpm离心上述组合1min。取下小柱，倒掉收集管中的废液， 再把小柱装回收集管上。

d.往小柱中加700ul已用95％乙醇稀释的膜清洗液，14,000rpm离心1min。取下小柱 倒掉收集管中的废液后，将小柱装回收集管上。再加500ul膜清洗液，14,000rpm离心 5min。

e.从离心机中取出离心柱-收集管组合，倒掉收集管中的废液。再次离心离心柱-收 集管组合1min，离心时不要盖上离心机的盖子，以使残留的乙醇充分挥发。小心地将小 柱转入干净的1.5ml离心管，加50ul无RNA酶水到小柱中央，室温孵育1min后， 14,000rpm离心1min。丢弃小柱，将装有目的片段的洗脱液保存于4℃或-20℃。

(3)目的片段与PGL3-basic荧光素酶检测载体连接，连接体系见表2所示：

表2：

载体 1.5μl(36ng/μl) FAD3片段 3.5μl(37ng/μl) Solution1 5μl 总体积 10μl 连接温度 16℃ 连接时间 过夜

(4)转化：将10μl质粒加入到50μl E coli感受态细胞中，冰浴30min，42℃水浴 热激90sec，迅速置于冰上冰浴2min，加入1ml无抗生素的LB培养基，于37℃摇菌 50min，5000rpm离心，弃去1ml上清，剩余少量液体吹吸均匀，将余下的菌液均匀的 涂布在含有AMP抗性的平板上，静置15min后置于37℃温箱中倒置培养14-16h，选取 平板中生长的单独菌落，加入到LB液体培养基中，37℃摇菌14-16h。质粒提取方法具 体步骤如下：

收集菌液于EP管中，5000rpm离心1min，弃去上清，加入150μl重悬液，充分震 荡；加入250μI裂解液，反复颠倒混匀；加入350μl中和液，反复颠倒混匀；14,000rpm 离心5min；将上清移至吸附柱中，14,000rpm离心1min，弃去废液；加入500μl洗涤液， 14,000rpm离心1min，弃去废液，并重复1次；再次采用离心柱-收集管组合1min，以 使残留的清洗液充分挥发。小心地将小柱转入干净的1.5ml离心管，加50ul无RNA酶 水到小柱中央，室温孵育1min后，14,000rpm离心1min。丢弃小柱，将质粒洗脱液保 存于-20℃。

连接正确的载体大小为5840bp，1022bp的MRF4肌肉特异启动子后连有1652bp的 荧光素酶基因，SV40启动子序列连接AMP抗性基因，便于阳性菌落的筛选。

(5)双酶切鉴定：

通过xho1和hind III双酶切，来鉴定得到的质粒中是否含有目的序列，酶切体系如表 3所示：

表3：

d H₂O 25.6μl 10Xfast buffer 2μl FAD3质粒 1.6μg xhol酶(takara) 1μl hind III酶(takara) 1μl

总体积 30μl 酶切温度 37℃ 酶切时间 15min

制备0.8％琼脂糖凝胶一块，加入酶切产物及5000bp marker后，80V，电泳50min。

电泳结果显示所得到的质粒中都连入了目的片段，可以进行下一步实验。

针对上述启动子序列进行细胞转染及启动效率分析：

转染方法参见invitrogen公司LTX转染试剂盒操作说明书，具体步骤如下：

将2μl质粒DNA用100μl opti-MEM稀释，加入2μl Plus液体，混匀后室温静置 5min；在将3μl LTX用100μl opti-MEM稀释，加入DNA液体中，混匀，室温静置30min。 30min后将DNA-LTX复合物添加到培养在24孔板中的C2C12小鼠成肌细胞上(1个孔)， 37℃，培养箱中孵育6h后更换正常细胞培养液。同时转染的还有对照组的小鼠成纤维 细胞。将一部分C2C12小鼠成肌细胞进行肌管分化，一部分正常培养，48小时后检测 荧光素酶的表达情况，具体的检测方法见Promega pGL3Luciferase Reporter Vectors操作 说明。

通过检测发现，在分化的肌管细胞中荧光表达值最高，达到33.6，而未分化的成肌 细胞和对照组的胎儿成纤维细胞中的表达值较低，只有6.4和5.3，差异极显著，说明实 验中使用的MRF4启动子具有良好的组织特异性。(组织特异性检测应增加心肌、平滑 肌，这样会非常完美，如果我们有这两种细胞的话)

针对上述启动子序列进行载体的构建及细胞水平特异性检测，具体步骤为：

(1)MRF4启动子通过xhol和hind III连入载体pDsRed2-1中，构建肌肉特异表达 的红荧光表达载体。构建方法同检测载体构建。连接正确的载体大小为42029bp，其中 包括1022bp的肌肉特异启动子序列启动的677bp的红荧光基因，以及SV40启动子启动 的新霉素抗性基因(便于转基因阳性细胞的筛选)。

(2)外源基因的细胞转染方法同检测载体的转染，转染的细胞为小鼠成肌细胞 C2C12。

(3)转基因细胞中外源基因的DNA水平鉴定，具体步骤为：

1)细胞基因组提取：收集转基因细胞和于EP管中，加600μl细胞裂解液(nuclei lysis  solution，Promega，A7943)，室温震荡20sec，冰浴10min，加入200μl终止液(protein  precipitation solution，Promega，A7953)，14,000rpm离心10min，将上清液转移至新EP 管中，并加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混合均匀，室温静置5min。14,000rpm离 心10min，弃去上清，在白色沉淀中加入70％乙醇700μl，上下颠倒洗涤数次，14,000rpm 离心5min，弃去乙醇。室温干燥50min，加入适量的无酶水溶解沉淀，保存DNA于-20℃。

2)PCR鉴定：

PCR引物：

Sense：5′CCATATTTGGGTGTGCCTGG3′

Anti-sense：5′GTTCTCTTCCTTGGCCTCTGA3′

PCR体系见表4：

表4：

dH2O 33μl 5x Primer STAR buffer 10μl dNTP mix 4μl Prime1 1μl Prime2 1μl 模板 0.5μl 酶 0.5μl 总体积 50μl

PCR条件见表5：

表5：

温度 时间 95℃ 3min 98℃ 10sec 68℃ 15sec 72℃ 10min 4℃ ∞

PCR产物电泳结果显示，转基因细胞的基因组中整合有外源基因MRF4肌肉特异启 动子的序列。

(4)转基因细胞中荧光表达情况检测：

在转基因的未分化的成肌细胞中没有观察到表达红荧光的细胞，将转基因的成肌细 胞进行肌管分化后，在分化的肌管中观察到了红荧光的表达，说明，本发明实施例中所 构建的肌肉特异启动子具有组织特异启动的特性，可以用于后续的肌肉中特异表达外源 基因的实验研究。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视 为本发明的保护范围。

序列表