一种早期胚胎体外植入子宫内膜模型的制备方法

摘要

一种早期胚胎体外植入子宫内膜模型的制备方法，首先在培养皿中制作细胞生长附着物，然后在细胞生长附着物上面培养子宫内膜细胞来源细胞及滋养细胞来源细胞。接着将生长有细胞的其中一种细胞生长附着物转移至另一个生长有另一种细胞的培养皿中，使不同细胞面相互接触，从而模拟早期胚胎植入时胚胎滋养细胞与子宫内膜细胞相互接触，发生植入时的状态。24小时后，将相互接触的细胞生长附着物破碎，分别提纯子宫内膜细胞及滋养细胞，分别用于分子生物学检测。本发明解决了研究胚胎植入目标细胞数量少的瓶颈问题，为有效研究早期胚胎植入提供了方便有效的技术和工具。

说明书

技术领域

本发明专利涉及一种早期胚胎体外植入子宫内膜模型的制备方法，该模型模拟胚胎植入子宫内膜的早期过程，用于胚胎植入研究。

背景技术

近年，由于全球范围内不孕人群数量持续增加，使辅助生殖技术的应用不断推广、生殖医学临床的快速发展，但是临床妊娠率提高并不明显，这就对生殖医学研究提出了新的要求。胚胎植入子宫内膜是妊娠建立的关键步骤，因此胚胎植入子宫内膜已经成为生殖医学研究的热点。由于植入时与内膜相互作用的胚胎细胞数量少、变化迅速，对植入相关生物分子进行检测困难，有关胚胎植入子宫内膜的具体机制仍不清楚。因此，建立有效的体外胚胎植入子宫内膜模型，方便地对目标细胞中生物活性分子进行检测是研究胚胎植入子宫内膜的关键。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种早期胚胎体外植入子宫内膜模型的制备方法，旨在应用生物工程技术建立一种新型的体外胚胎植入模型，即胚胎植入子宫内膜过程中滋养细胞与子宫内膜细胞相互作用的模型，解决胚胎植入过程中胚胎来源细胞数量少，又无从有效分离的难题，为胚胎植入子宫内膜的研究提供有效的方法和工具。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种早期胚胎体外植入子宫内膜模型的制备方法，包括以下步骤：

（1）在培养皿A、B中制作两个细胞生长附着物：将凝胶点为30度的琼脂糖溶解在TAE缓冲液中，琼脂糖的质量百分比浓度为0.5%；溶解后将其铺在两个直径为10cm的培养皿A、B中，凝胶厚度为0.5cm，在4℃下凝固，使用前置室温复温1h。

（2）向培养皿A中加入5ml RPMI1640培养基，培养皿B中加入8ml囊胚培养液，RPMI1640培养基用于子宫内膜培养；囊胚培养液用于滋养细胞培养，置入37^oC，体积百分比浓度为5%CO₂培养箱培养浸洗平衡3次，每次1个小时。

（3）子宫内膜蜕膜化处理：将分离纯化的个数在5×10⁶的子宫内膜原代上皮细胞或高分化子宫内膜细胞接种于培养皿A，加入含有β-雌二醇（E₂）200pg/mL、孕酮（P）20ng/mL的、体积百分比为10%胎牛血清的RPMI1640培养液8ml进行培养，进行子宫内膜分泌化培养，使其转变为分泌期上皮。将分离纯化的个数在5×10⁶的滋养层细胞接种于培养皿B进行培养至滋养层细胞面积占整个培养皿面积50%-80%。

（4）将长满细胞的其中一种细胞生长附着物转移至另一个生长有另一种细胞的培养皿中，使细胞面两两相扣，建立胚胎植入时的两种细胞相互作用的状态。

（5）24小时后将两两相扣的细胞生长附着物取出置于冰块上，用PBS缓冲液洗涤后剪碎至直径小于1 mm的小块(肉眼呈糊状)。

（6）加入D/F培养基洗涤1次后，依次通过100目(150)和400目(38)筛网。

（7）400目筛网上主要为内膜细胞和滋养细胞或二者形成的细胞团，翻转筛网后，用D/F培养基冲洗，所有冲洗液合并后，1000r/min离心5 min。

（8）用2 ml含体积百分比为0.02%EDTA和体积百分比为0.25%胰蛋白酶消化5-10 min，使细胞团分散成为单个细胞。立即加入2ml含体积百分比为10%胎牛血清的滋养层培养基终止消化，1000 r/min离心5 min后，应用免疫磁珠法（已有专用技术）分别分离子宫内膜细胞和滋养细胞，用于后续的分子生物学检测。

本发明的有益效果在于：应用琼脂糖制作子宫内膜细胞和滋养细胞生长附着物，建立胚胎植入时的子宫内膜面和胚胎滋养细胞面，两两相互接触建立胚胎植入时的细胞相互作用状态，破碎后分别分离纯化两种细胞，用于早期胚胎植入研究，从而解决研究胚胎植入目标细胞数量少的瓶颈，为有效研究早期胚胎植入提供了方便有效的技术和工具。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1，一种早期胚胎体外植入子宫内膜模型的制备方法，包括以下步骤：

（1）在培养皿A、B中制作两个细胞生长附着物：将凝胶点为30度的琼脂糖溶解在TAE缓冲液中，琼脂糖的质量百分比浓度为0.5%；溶解后将其铺在两个直径为10cm的培养皿A、B中，凝胶厚度为0.5cm，在4℃下凝固，使用前置室温复温1h。

（2）向培养皿A中加入5ml RPMI1640培养基，培养皿B中加入8ml囊胚培养液，RPMI1640培养基用于子宫内膜培养；囊胚培养液用于滋养细胞培养，置入37^oC，体积百分比浓度为5%CO₂培养箱培养浸洗平衡3次，每次1个小时。

（3）子宫内膜蜕膜化处理：将分离纯化的个数在5×10⁶的子宫内膜原代上皮细胞或高分化子宫内膜细胞接种于培养皿A，加入含有β-雌二醇（E₂）200pg/mL、孕酮（P）20ng/mL的、体积百分比为10%胎牛血清的RPMI1640培养液8ml进行培养，进行子宫内膜分泌化培养，使其转变为分泌期上皮。将分离纯化的个数在5×10⁶的滋养层细胞接种于培养皿B进行培养至滋养层细胞面积占整个培养皿面积50%-80%。

（4）将长满细胞的其中一种细胞生长附着物转移至另一个生长有另一种细胞的培养皿中，使细胞面两两相扣，建立胚胎植入时的两种细胞相互作用的状态。

（5）24小时后将两两相扣的细胞生长附着物取出置于冰块上，用PBS缓冲液洗涤后剪碎至直径小于1 mm的小块(肉眼呈糊状)。

（6）加入D/F培养基洗涤1次后，依次通过100目(150)和400目(38)筛网。

（7）400目筛网上主要为内膜细胞和滋养细胞或二者形成的细胞团，翻转筛网后，用D/F培养基冲洗，所有冲洗液合并后，1000r/min离心5 min。

（8）用2 ml含体积百分比为0.02%EDTA和体积百分比为0.25%胰蛋白酶消化5-10 min，使细胞团分散成为单个细胞。立即加入2ml含体积百分比为10%胎牛血清的滋养层培养基终止消化，1000 r/min离心5 min后，应用免疫磁珠法（已有专用技术）分别分离子宫内膜细胞和滋养细胞，用于后续的分子生物学检测。