双环铂在制备抗病毒药物和抗菌药物中的应用

摘要

本发明提供了双环铂在制备抗病毒药物和/或抗菌药物中的应用，以及双环铂在制备抗病毒辅助药物和/或抗菌辅助药物中的应用。本发明所述病毒为RNA病毒，例如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、流感病毒等，所述抗菌药物为抗结核分枝杆菌药物和/或抗非结核分枝杆菌药物。本发明的研究结果证明：双环铂具有抗多种细菌及病毒功效，特别是对耐药菌的抑制效果显著，并且其无明显的细胞毒性，用药安全。

说明书

技术领域

本发明涉及双环铂的应用，特别涉及双环铂在制备抗病毒药物和抗菌药物中的应用。

背景技术

双环铂(Dicycloplatin)是由卡铂与环丁烷二酸通过四个氢键组成的相对稳定的超分子化合物，其化学结构为1,1-环丁烷二羧酸，二氨配铂(Ⅱ)合1,1-环丁烷二羧酸(Bis-[1,1-cyclobutane dicarboxylic acid diaminoplatin(Ⅱ)]complex)。研究表明双环铂具有广谱、高效、低毒、低耐药、低交叉耐药以及穿透性好等特点，是新一代超分子抗癌药物。例如，公开号为CN1311183A的发明专利对双环铂进行过多次急毒、药效实验及临床检验，结果表明双环铂抗癌活性高，对泌生癌、头颈癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、肠癌、淋巴癌等均有显著疗效。

病毒是由一个核酸分子与蛋白质构成的非细胞形态的营寄生生活的生命体，病毒感染引起多种疾病，其严重危害人类的健康和生命。早期的病毒性传染病例如天花、脊髓灰质炎、麻疹、乙型脑炎等的发病率已日趋减少，近年来发病率最高、危害性最大的是人类免疫缺陷病毒(HIV)所致的艾滋病(AIDS)和乙型肝炎病毒(HBV)引起的乙型病毒性肝炎。随着这些发病率高、危害性大、难于治愈的病毒性疾病在全球广泛蔓延，以及流感病毒、冠状病毒等呼吸道病毒基因的变异所出现新的变种病毒或病毒变异株多次暴发，迫切需要采取相应的预防和治疗措施。

近年来，各类抗病毒药物发展突飞猛进，为治疗病毒引起的感染发挥了重大作用。目前，抗HIV药物主要有核苷类逆转录酶抑制剂例如齐多夫定(AZT)、拉米夫定等(3TC)等；非核苷类逆转录酶抑制剂例如依非韦伦(EFV)、奈韦拉平(NEV)等；蛋白酶抑制剂例如利托那韦(RTV)、安普那韦(APV)等，这些药物的作用靶点主要针对的是HIV复制过程中的关键酶。抗HBV药物主要有干扰素α(IFN)、拉米夫定、恩替卡韦(ETV)等，这些药物主要针对慢性活动性肝炎(CHB)，以持续降低病毒载量，维持谷丙转氨酶(ALT)正常，改进肝病理及清除乙型肝炎E抗原(HBeAg)，进而肝硬化、肝功失代偿等的发生。抗流感病毒药物主要有金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦及奥塞米韦(达菲)，前两者主要作用于病毒四聚体穿膜蛋白M2离子通道，后两者为流感病毒神经氨酸酶(NA)慢结合抑制剂，对甲、乙型流感病毒均有抑制活性。这些抗病毒药物虽在一定程度上有效，但长期应用易产生耐药性，从而降低药物疗效，使病情复发，其成为抗病毒临床治疗及新药开发的重要问题。

除由病毒感染引起的上述多种疾病外，由结核分枝杆菌(简称结核杆菌)感染引起的结核病也是是我国重点控制的重大疾病之一。结核病是一种慢性和缓发的传染病，传染方式为人与人之间的呼吸道传播，特别是随着环境污染和艾滋病的传播，结核病发病率也越发强烈。目前的抗结核分枝杆菌药物主要包括异烟肼(INH)、硫酸链霉素(SM)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)等，然而许多病人对这些抗结核药物产生了耐药性，从而发展成为耐药结核病，其治疗困难并且疗程长，对社会的危害性极大。

尽管双环铂在抗癌方面疗效显著，然而需要通过给患者摄入较大剂量(每单位制剂含双环铂20～50mg)的双环铂才能达到杀死癌细胞的目的。此外，为了杀死癌细胞，通常需要在一定时间内进行连续给药，并维持周期性治疗，但大剂量且长时间的治疗在杀死癌细胞的过程中对患者身体伤害也较大。目前还没有报道显示双环铂可作为抗菌和抗病毒药物或抗菌和抗病毒药物的辅助药物。

发明内容

本发明提供了双环铂在制备抗病毒药物和/或抗菌药物中的应用，本发明还提供了双环铂在制备抗病毒辅助药物和/或抗菌辅助药物中的应用。

本发明人经研究发现，双环铂在抗菌和/或抗病毒方面表现出良好的疗效，其机理可能是双环铂的氢键在细菌和病毒DNA复制时被打开，从而与DNA解旋后的碱基氮原子孤对电子(G-N7、C-N3)结合形成加合物，从而导致DNA复制终止而凋亡。

本发明提供的双环铂在制备抗病毒药物中的应用，所述病毒为RNA病毒。经本发明研究发现，双环铂对多种RNA病毒均具有明显的抑制作用，例如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、流感病毒、肠道病毒等，其具有相对广谱的抗病毒作用。

本发明提供的双环铂在制备抗菌药物中的应用，所述抗菌药物为抗结核分枝杆菌药物和/或抗非结核分枝杆菌药物。特别是，双环铂对耐药性结核分枝杆菌具有显著的抑制作用。

在本发明中，所述抗病毒药物和/或抗菌药物中包含治疗有效量的双环铂和制药学上可接受的药物辅剂。具体地，所述药物每单位制剂可含双环铂0.1～10mg，进一步为0.1～1mg；所述单位制剂为满足一次给药所需有效成分的制剂，常见的单位制剂如一单位片剂、一单位针剂等，其中作为有效成分的双环铂含量为一次给药所需的量。更小剂量的双环铂也具有一定的抗病毒和/或抗菌作用，例如每单位制剂可含双环铂0.001～0.1mg，进一步为0.01～0.1mg，本领域技术人员可以根据患者的严重程度来选择合适的药物规格(即含有的双环铂的量)。

进一步地，对于成人(体重在正常范围)给药剂量为每天一至三次，每次一单位剂量(0.1～10mg)，其远低于双环铂通常在癌症治疗中使用的剂量。治疗过程为连续服药7天作为一个疗程，间隔一至两周后，进行下一疗程治疗，连续治疗2至3个疗程。

本发明提供的双环铂在制备抗病毒辅助药物和/或抗菌辅助药物中的应用，所述抗病毒辅助药物包括抗乙型肝炎病毒、抗丙型肝炎病毒、抗人类免疫缺陷病毒和抗流感病毒的辅助药物中的一种或多种，所述抗菌辅助药物为抗结核分枝杆菌和抗非结核分枝杆菌的辅助药物中的一种或多种。

在本发明中，双环铂可以作为常规抗病毒药物和/或抗菌药物的辅助药物进行应用，例如其可作为抗乙型肝炎病毒药物如拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦、阿德福韦等，抗人类免疫缺陷病毒药物如齐多夫定、拉米夫定、依非韦伦等以及抗流感病毒药物如奥塞米韦、扎那米韦等的辅助药物。

进一步地，所述药物可以为口服制剂、注射制剂或局部给药制剂。其中，口服制剂可为口服固体制剂，例如常规的片剂、胶囊剂、颗粒剂等，也可以是缓释片或分散片等；注射制剂可以是注射水针剂、注射粉针(冻干粉针)等；局部给药制剂可以是外用凝胶剂等。

本发明的研究结果表明，将双环铂作为抗菌和抗病毒的药物，尤其是在低剂量下给药，不仅不产生细胞毒性、用药安全，并且相对于现有的常规的抗菌和抗病毒的药物，双环铂表现出更好的抗菌和抗病毒效果，特别是对耐药性细菌的抑制效果显著。

附图说明

图1为双环铂对乙型肝炎病毒的抑制效果图；

图2为双环铂对人类免疫缺陷病毒的抑制效果图；

图3为双环铂对流感病毒的抑制效果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图和实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1双环铂抗噬菌体试验

一、试验材料

噬菌体：噬菌体E13，由军科院五所提供；

双环铂注射液：10mg/mL，由北京市兴大科学系统公司提供；

指示菌：大肠杆菌；

指示菌培养基：LB培养基；

阳性对照药：病毒唑，10mg/mL。

二、双环铂对指示菌的抑制

用无菌蒸馏水对双环铂注射液进行梯度稀释，分别制成浓度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9的双环铂稀释液(浓度单位：mg/mL)；用蒸馏水对双环铂进行稀释可以避免培养基或溶液中的Cl^-、EDTA、酸碱值对双环铂的抗病毒和/或抗菌效果产生不利影响，从而使试验结果更加精确。

分别取各稀释度的双环铂稀释液0.9mL，与0.1mL经过夜培养的大肠杆菌菌液混合后置于37℃的恒温箱中孵育24h，随后各取0.1mL菌液涂平板并计菌落数；同时，以不添加双环铂稀释液的大肠杆菌菌液作为空白对照。

结果表明：双环铂对大肠杆菌的抑制浓度为10^-3mg/mL，在该抑制浓度下平板上基本未出现大肠杆菌菌落，大肠杆菌被完全抑制；而双环铂浓度在低于10^-4mg/mL时，对大肠杆菌的抑制作用不明显，即双环铂浓度低于10^-4mg/mL时能够基本排除双环铂对指示菌的影响，从而能够更加精确地对噬菌体的感染能力进行评价。

三、双环铂对噬菌体感染能力的影响

向培养至对数期的大肠杆菌菌液中加入一定量的噬菌体E13，于37℃摇床培养24h后，10000rpm离心5min，硝酸纤维膜过滤后得到噬菌体。

将上述各稀释度的双环铂稀释液分别与等量的噬菌体混合后分别对大肠杆菌进行感染，在37℃摇床培养16h后采用双层平板法对噬菌体的效价进行测定；同时，以浓度分别为10mg/mL、1mg/mL和10^-1mg/mL的病毒唑作为阳性对照。

结果表明：双环铂对噬菌体的抑制浓度为10^-6mg/mL，在该抑制浓度下双层平板基本未出现噬菌斑，噬菌体被完全抑制；而病毒唑对噬菌体的抑制浓度为10mg/mL。由此可见，双环铂对细菌(例如大肠杆菌)和噬菌体均具有良好的抑制作用，并且抑制效果显著优于常规的广谱抗病毒药物病毒唑。

实施例2双环铂抗双枝杆菌试验

一、试验材料

菌株：结核分枝杆菌H₃₇Rv、耐药性结核分枝杆菌(即耐异烟肼、硫酸链霉素、利福平和乙胺丁醇的耐药结核分枝杆菌菌株)、速生型非结核分枝杆菌，均来自病毒学国家重点实验室(武汉大学)；

双环铂溶液：5mg/mL，由北京市兴大科学系统公司提供；

各菌株培养基：改良的罗氏培养基；

阳性对照药：利福平，5mg/mL。

二、双环铂抗分枝杆菌

分别培养上述结核分枝杆菌H₃₇Rv、耐药性结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌后，制成1mg/mL的菌液。

用无菌蒸馏水对双环铂溶液(5mg/mL)进行稀释，分别制成稀释度为1：X的双环铂稀释液(即双环铂溶液被稀释X倍)。

将上述各稀释度的双环铂稀释液分别等量加入到同体积的灭菌固体培养基中制成含双环铂的斜面培养基；

将上述制备的各菌液(1mg/mL)等量接种于各稀释度的含双环铂的斜面培养基上，于37℃培养40天，定期观察；同时以不含双环铂的斜面培养基作为空白对照，并以各稀释度的利福平稀释液作为阳性对照，结果见表1至表4。

在表1至表4中：“-”表示无肉眼可见菌落；“+”表示肉眼可见菌落面积小于斜面培养基面积的1/3；“++”表示肉眼可见菌落面积占斜面培养基面积的1/3～2/3；“+++”表示肉眼可见菌落面积大于斜面培养基面积的2/3；“++++”表示肉眼可见菌落面积基本占满整个斜面培养基。

表1双环铂对结核分枝杆菌H₃₇Rv的抑制

表2双环铂(DCP)与利福平(RFP)对结核分枝杆菌H₃₇Rv的抑制

表3双环铂对多耐药结核分枝杆菌的抑制

表4双环铂对速生型非结核分枝杆菌的抑制

表1至表4结果表明：双环铂对结核分枝杆菌和速生型非结核分枝杆菌均有明显的抑制作用；特别是，双环铂对耐受多种传统药物的耐药性结核分枝杆菌同样具有明显的抑制作用。相对于传统药物利福平，双环铂表现出更加优异的抑制效果。

实施例3双环铂抗乙型肝炎病毒试验

一、试验材料

细胞：HepG2.2.15，由病毒学国家重点实验室(武汉大学)提供；

双环铂注射液：10mg/mL，由北京市兴大科学系统公司提供；

阳性对照药：拉米夫定。

二、双环铂抗乙型肝炎病毒

用无菌蒸馏水对双双环铂注射液进行梯度稀释，分别制成浓度为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的双环铂稀释液(浓度单位：mg/mL)。

将HepG2.2.15细胞培养至对数生长期后，用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，稀释至10⁵个/mL后接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，每个浓度三个复孔，于37℃培养24小时后向各孔中分别加入上述各稀释度的双环铂稀释液200μL，于37℃培养并定期更换等体积培养基(含相同浓度的双环铂)，培养至第8天时用HBV DNA定量PCR试剂盒测定培养基中的HBV DNA浓度；同时以未添加双环铂的培养基作为空白对照，并以相同稀释度的拉米夫定作为阳性对照，结果如图1所示。

由图1可知：不同稀释度的双环铂均能够抑制细胞内HBV DNA的合成，抑制效果与双环铂的浓度成正相关，并且各稀释度的双环铂的抑制效果均显著优于传统药物拉米夫定；此外，双环铂在抑制细胞内HBV DNA合成时所需剂量小，双环铂浓度在10^-2mg/mL即可达到80％左右的抑制率。

实施例4双环铂抗人类免疫缺陷病毒试验

一、试验材料

pNL4-3、MT4细胞：均由病毒学国家重点实验室(武汉大学)提供；

双环铂注射液：10mg/mL，由北京市兴大科学系统公司提供；

阳性对照药：齐多夫定；

p24ELISA试剂盒：购自武汉病毒研究所。

二、双环铂细胞毒性

用无菌蒸馏水对双环铂注射液进行梯度稀释，分别制成浓度为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9的双环铂稀释液后(浓度单位：mg/mL)；采用MTT法检测上述各梯度的双环铂稀释液对MT4细胞的毒性，结果表明各梯度的双环铂稀释液均没有明显的细胞毒性，是较为安全的给药范围。

三、双环铂抗人类免疫缺陷病毒

将上述各稀释度的双环铂稀释液加入96孔细胞培养板，每孔50μL；并且，将MT4细胞培养至对数生长期后制成密度为10⁵个/mL的细胞悬液，加入pNL4-3进行感染，感染1小时后，离心细胞，去除上清并用新鲜的培养液重悬细胞至密度为10⁵个/mL，加入96孔细胞培养板，每孔100μL感染的细胞悬液，培养72小时后，每孔取上清50μL，加入50μL浓度为1％的TritonX-100，37℃放置1小时裂解病毒，使用p24ELISA试剂盒检测p24抗原含量；同时以未添加双环铂的稀释液作为空白对照，以相同稀释度的阳性药物齐多夫定作为阳性对照，各稀释度的双环铂稀释液对HIV病毒复制的抑制效果如图2所示。

MT4细胞被病毒感染后，培养过程中会释放病毒颗粒，测定培养上清中的病毒核心结构蛋白(即p24抗原)可反映上清中病毒的含量。由图2可知：不同稀释度的双环铂均能够抑制HIV病毒的复制，抑制效果与双环铂的浓度成正相关性，并且抑制效果显著优于传统药物齐多夫定；此外，双环铂在抑制HIV病毒复制时所需剂量小，浓度在10^-1mg/mL即可达到85％左右的抑制率。

实施例5双环铂抗流感病毒试验

一、试验材料

MDCK细胞、H3N2病毒：均由病毒学国家重点实验室(武汉大学)提供；

双环铂注射液：10mg/mL，由北京市兴大科学系统公司提供。

二、双环铂的细胞毒性

用无菌蒸馏水对双环铂注射液进行梯度稀释，分别制成浓度为10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的双环铂稀释液(浓度单位：mg/mL)。

将MDCK细胞按5000个/孔(100μL)接种于96孔细胞培养板中，等细胞贴壁后，加入上述各梯度的双环铂稀释液，每梯度作3个复孔，培养48小时后于每孔中加入20μL的MTT(5mg/mL)，继续培养4小时后，弃上清，每孔加入100μL三联溶解液(每100mL含SDS10g、异丁醇5mL、10M盐酸0.1mL)，37℃过液后用酶联检测仪检测570nm处吸光值，计算各稀释度双环铂的细胞存活率，结果表明各梯度的双环铂稀释液均没有明显的细胞毒性，是较为安全的给药范围。

三、双环铂抗流感病毒

将MDCK细胞按2×10⁴个/孔接种于96孔细胞培养板，于37℃培养16小时左右后弃去孔板中培养基，PBS清洗两遍后加入H3N2病毒感染细胞，同时向每孔中加入上述各梯度的双环铂稀释液100μL，37℃培养48小时后取上清进行神经氨酸酶活性检测；同时以未添加双环铂的稀释液作为空白对照，结果如图3所示。

由图3可知：不同稀释度的双环铂均能够抑制流感病毒的复制，抑制效果与双环铂的浓度成正相关性；此外，双环铂在抑制流感病毒复制时所需剂量小，浓度在10^-4mg/mL即可达到75％左右的抑制率。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。