一种贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法

摘要

本发明属于细胞生物学领域，涉及肿瘤干细胞研究，具体涉及一种贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法。本发明方法简化了卵巢肿瘤SP细胞分选过程，采用改良的孵育液，可有效的用于贴壁培养的卵巢肿瘤细胞系的SP细胞分选；不需要酶解消化过程，细胞直接在贴壁的状态下进行孵育染色，完成染色后再将细胞酶解成单细胞，在悬浮状态上机分选，可以提高分选时的细胞活性。本方法能简便、快速、有效分选得到SP细胞，可明显节省实验流程操作时间，获得的SP细胞可用作肿瘤干细胞的表面标志物，对后续的实验研究具有明显的实用价值。

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及肿瘤干细胞研究，具体涉及一种贴壁 分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法。该方法从卵巢肿瘤细胞系中分选出一群具有 干细胞样特性的细胞，即侧群细胞(SP cells，side population cells)， 能够简化实验过程和节约时间，提高分选时的细胞活性。

背景技术

现有技术公开了肿瘤干细胞是一群具有自我更新和分化能力的具有干 样特性的细胞，目前，公认的肿瘤干细胞的分选方法包括表面标志物的分选， 如CD133+、CD44+CD117+以及ALDHbr(aldehyde dehydrogenase bright) 等，另外还有侧群细胞的分选，即SP细胞分选。肿瘤干细胞中高表达ABC 转运蛋白的细胞能够通过流式鉴定。卵巢肿瘤的SP细胞分选方法的基础就 在于这一小群细胞高表达ABC转运蛋白，能够拒染Hoechst33342。上述两 种方法中，其中的表面标志物的分选方法，迄今尚未发现有较为明确的肿瘤 干细胞的表面标志物的报道；所述的侧群细胞的分选方法，作为传统的实验 方法存在有如下缺陷：实验操作较为繁琐，耗时耗力。因此，本研究领域迫 切需要简化卵巢肿瘤SP细胞分选的方法以达到提高实验效率的目的。

与本发明相关的现有技术有：

1.Dou J，Jiang C，Wang J，Zhang X，Zhao F，Hu W，He X，Li X，Zou D，Gu N.Using ABCG2-molecule-expressing side population cells to identify cancer stem-like cells in a human ovarian cell line.Cell Biol Int2011；35：227-234.

2.Hiraga T，Ito S，Nakamura H.Side population in MDA-MB-231human breast cancer

cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.Oncol Rep2011；25：289-296.

3.Goodell MA.Stem cell identification and sorting using the Hoechst33342side population(SP).Curr Protoc Cytom2005；9：18.

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种简化的从卵巢肿瘤细 胞系中分选具有干细胞样特性细胞的新方法，尤其涉及一种贴壁分选卵巢肿 瘤侧群细胞的方法。

本发明方法，可明显节省实验流程操作时间(30分钟左右)，且随着分 选细胞总数的增加相应节约的时间更多，效率提高，存活细胞比例增加，使 劳动力成本明显下降。

具体的，本发明的一种贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法，其特征在于， 不需要酶解消化过程，细胞直接在贴壁的状态下进行孵育染色，完成染色后 再将细胞酶解成单细胞，在悬浮状态上机分选，获得与传统方法无差异的SP 细胞比例。

本发明对传统分选SP细胞的方法进行了改进，现有技术的分选SP细胞 的方法的技术方案中(Goodell等在2005年公开的SP细胞分选方法)，对贴 壁培养的细胞进行染色时，需要先采用胰酶消化，使细胞悬浮后再进行染色， 且所采用的Hoechst33342染色后孵育至少需要90分钟，每10-15分钟需要 振荡混匀一次等的技术方案；

本发明中，简化了卵巢肿瘤SP细胞分选过程，贴壁生长的细胞不需消 化悬浮，也不必在孵育过程中不停地振荡混匀，最后洗弃培液直接重悬无需 反复洗涤离心，减少了对细胞活性损害。

本发明中，实验所采用的孵育液为改良的孵育液，该孵育液可有效的用 于贴壁培养的卵巢肿瘤细胞系的SP细胞分选；所述的改良的人卵巢肿瘤细 胞系SP细胞分选孵育液由如表1所述的成分组成。

表1显示了改良的人卵巢肿瘤细胞系SP细胞分选孵育液的成分与配比。 表1

更具体的，本发明的贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法，其特征在于， 其包括步骤：

1)分别进行人卵巢肿瘤细胞系ES-2、OVCAR-3细胞培养，

其中，培养ES-2细胞系使用含10％胎牛血清(Hyclone)的RPIM1640 培养基(Hyclone)，OVCAR-3使用含20％胎牛血清(Hyclone)、0.01ng/μl 胰岛素的RPIM1640(Hyclone)培养基，培养条件为37℃，5％CO₂，细胞每两 天传代一次；

2)培养的细胞按一定密度接种于培养器皿中，使其贴壁生长，直接染 色孵育90分钟，无需每15分钟振荡混匀，采用的孵育液由如表1所述的成 分组成，其PH值须调整到7.0；

本发明的实施例中，在分选前一天根据细胞生长速度以一定密度培养细 胞，使其贴壁，各细胞系贴壁两个培养皿，卵巢肿瘤细胞系以5×10⁵/L的密 度接种，第二天细胞数约为1×10⁶/L，

3)孵育后用预冷HBSS液洗涤并酶解成单细胞悬液，离心弃去上清液后 重悬浓缩细胞，在悬浮状态上机分选，获得侧群细胞；

本发明的实施例中，弃去上清液，用预温PBS洗涤一遍，加入孵育液和 维拉帕米(Verapamil)，放置培养箱20min，加入Hoechst33342液，继续培 养90min(此步骤无需振荡混匀)，孵育完成后，用预冷HBSS液洗涤，0.25％ 胰酶(Hyclone)消化，使用含10％胎牛血清的培养液终止消化，4℃1200rpm 离心5分钟，移去上清液，加入1ml HBSS液重悬，流式分选前加入PI(终 浓度2μg/ml)，在悬浮状态上机分选，获得侧群细胞。

使用本发明方法获得的SP细胞可用作肿瘤干细胞的表面标志物，有利 于后续肿瘤干细胞基础研究。

本发明方法与现有技术比较，在分选卵巢肿瘤侧群细胞过程中对细胞损 伤更小，活细胞比例比更高(如图2中所示)，结果表明了本方法的可行性， 操作简便，节约劳动力，提高分选效率。

本发明方法的优点在于：

本发明的贴壁分选卵巢肿瘤侧群细胞的方法，利用肿瘤细胞贴壁生长的 特性，不需要酶解消化，细胞直接在贴壁的状态下进行孵育染色，完成染色 后再将细胞酶解成单细胞，在悬浮状态上机分选，简化了染色过程中的步骤， 在保证分选效率的前提下，对SP细胞分选流程进行优化，整个过程可节省 时间30分钟，因为在洗弃孵育液时不需要重复离心、重悬细胞，可以提高 分选时的细胞活性。利用本发明的方法能简便、快速、有效分选得到SP细 胞，获得的SP细胞可用于肿瘤干细胞的表面标志物，对后续的实验研究具 有明显的实用价值。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描 述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通 技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修 正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公 开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文 进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

图1显示了本发明阐述的简化的实验流程对比图，

图中：1、孵育90分钟后用预冷HBSS洗涤并酶解成单细胞悬液；2、离 心；3、重悬；4、酶解成单细胞；5、孵育90分钟，振荡混匀每15分钟一 次再离心。

图2显示了人卵巢肿瘤细胞系ES-2和OVCAR-3中SP细胞分选过程中存 活细胞比例的传统悬浮法与本发明的贴壁法的对比。

具体实施方式

实施例1

人卵巢肿瘤细胞系ES-2、OVCAR-3(购自上海生命科学院)，细胞培养 ES-2细胞系使用含10％胎牛血清(Hyclone)的RPIM1640培养基(Hyclone)， OVCAR-3使用含20％胎牛血清(Hyclone)、0.01ng/μl胰岛素的RPIM 1640(Hyclone)培养基，在Corning35mm dish细胞培养皿中培养，培养条 件为37℃，5％CO₂。细胞每两天传代一次；在分选前一天根据细胞生长速度 以一定密度培养细胞，使其贴壁，各细胞系贴壁两个培养皿，例如本发明实 验中采用的卵巢肿瘤细胞系以5×10⁵/L的密度接种下细胞，第二天细胞数约 为1×10⁶/L，弃去上清液，用预温PBS洗涤一遍，加入孵育液(配方)1ml， 5mM维拉帕米(Verapamil)0、30μl，放置于培养箱(37℃，5％CO₂)20min， 加入1mg/ml>2)90min (此步骤无需振荡混匀)，孵育完成后，用预冷HBSS(GIBCO)液洗涤，0.25％ 胰酶(Hyclone)消化，使用含10％胎牛血清的培养液终止消化，4℃1200rpm 离心5分钟，移去上清液，加入1ml>

表1是人卵巢肿瘤细胞系SP细胞分选孵育液的成分与配比。

表1

本实施例进一步验证该方法的实用价值，因此，同时对这些肿瘤细胞系 进行了与现有技术分选方法的对比，结果显示，本发明贴壁法的过程中对细 胞损伤更小，活细胞比例比传统的悬浮法提高(如图2中所示)。结果表明 了本方法的可行性，操作简便，节约劳动力，提高分选效率。