慢性粒细胞白血病K562细胞株侧群细胞的分选及体外生物学性状的初步研究

摘要

背景及目的：研究表明，慢性粒细胞白血病（Chronic myeloid leukemia，CML）的发生、发展以及复发与CML干细胞有着密切的关系。干细胞的研究为CML的靶向治疗提供了新的思路。因此，如何寻找、分离、得到较高纯度的CML干细胞，就显得尤为重要。侧群（Side population，SP）细胞最初是在分离小鼠造血干细胞时发现的。研究提示，SP细胞具有干细胞的生物学特性，从肿瘤细胞中分选出的SP细胞富含肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）。本研究旨在了解人慢性粒细胞白血病细胞株K562中是否存在SP细胞，并分选出K562细胞株的SP及非侧群（Non-side population，NSP）细胞亚群，初步研究SP细胞是否具有干细胞的特性，认识CML SP细胞与CML干细胞的关系。并探讨人重组干扰素α2b（IFNα2b）对K562细胞株SP细胞的作用。
　　方法：以人慢性粒细胞白血病K562细胞株为研究对象，利用干细胞高效能泵出Hoechst33342荧光染料的特性，采用流式细胞术检测K562细胞株中是否存在SP细胞。分选出SP和NSP细胞，通过细胞周期、软琼脂克隆形成实验、生长曲线法、细胞培养观察不对称分裂等方法对SP细胞进行初步的体外生物学特性研究。并用IFNα2b处理亲本K562细胞株及分选的SP细胞，初步探讨IFNα2b对K562细胞株SP细胞的作用。
　　结果：K562细胞经过Hoechst33342荧光染料染色后，在荧光显微镜的明场视野及紫外光视野同一视野下观察，可见绝大多数的细胞被染色和激发而发出强蓝色的荧光，仅可见极少数的细胞呈现很弱的蓝色荧光或者不发光，这部分淡染或拒染的细胞即SP细胞。流式细胞仪进一步检测发现，在K562细胞株中检测到比例为6.47±0.57％的SP细胞，位于红色和蓝色荧光强度均较弱的区域。加了SP细胞抑制剂维拉帕米（Verapamil）的对照组，该细胞群的比例明显下降或完全消失。应用流式细胞仪分选出的SP细胞和NSP细胞再次上机检测，分选的细胞纯度均在80%以上。分选的细胞周期检测发现大部分的SP细胞处于静止期，G0/G1期比例为61.09±6.01%，明显高于NSP细胞中的比例（33.96±5.69%）。细胞生长曲线提示分选的SP和NSP生长均较缓慢，细胞的增殖速度无明显差异。软琼脂克隆形成实验提示SP细胞相对于NSP具有更高的克隆形成能力(P<0.05)。分选的SP细胞培养1周后再次用Hoechst33342染色检测，SP细胞可以产生SP和NSP细胞，其比例分布与亲本K562细胞相似，而NSP细胞只能产生很少的SP细胞。K562细胞经过IFNα2b处理后，SP细胞比例明显下降。分选的K562细胞的SP细胞经过IFNα2b处理后比例也较对照组明显下降。
　　结论：人慢性粒细胞白血病K562细胞株中存在SP细胞, K562细胞株的SP和NSP细胞在细胞周期、软琼脂克隆形成能力及不对称分裂上均存在显著的差异（P<0.05），研究表明K562细胞株的SP细胞具有CML干细胞的特征。此外，IFNα2b能够特异性的降低白血病K562细胞株中的SP细胞比例，该特性可能提示IFNα能特异性杀伤CML干细胞，为CML的治疗提供依据。

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第1章 前言

1.1肿瘤及肿瘤干细胞

1.2慢性粒细胞白血病

1.3慢性粒细胞白血病干细胞

1.4侧群细胞

1.5 IFNα在治疗CML中的角色

第2章 材料和方法

2.1 细胞株

2.2主要试剂及器材

2.3 实验方法

2.4 统计学处理

第3章 实验结果

3.1 Hoechst33342染色后在荧光显微镜下观察

3.2 流式细胞术检测K562细胞株中SP细胞的比例

3.3 分选细胞纯度的检测

3.4 SP、NSP及K562细胞的细胞周期检测

3.5 SP细胞及NSP细胞生长曲线

3.6 软琼脂克隆形成实验

3.7 细胞培养检测细胞不对称分裂能力

3.8 IFNα2b对K562细胞株SP细胞比例的影响

3.9 IFNα2b对SP细胞的作用

第4章 讨论

第5章结论和展望

参考文献

综述:慢性粒细胞白血病干细胞的研究进展

致谢

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