一种以苹果渣为原料的细菌纤维素发酵培养基及利用该培养基生产细菌纤维素的方法

摘要

本发明公开了一种以苹果渣为原料的细菌纤维素发酵培养基及利用该培养基生产细菌纤维素的方法，属于生物技术领域。本发明的细菌纤维素发酵培养基中含有蔗糖、牛肉膏、磷酸氢二钠、柠檬酸、乙醇及苹果渣水解液。利用该培养基生产细菌纤维素的方法，包括：1)将木糖葡糖酸醋杆菌进行活化、扩培，得木糖葡糖酸醋杆菌种子液，将木糖葡糖酸醋杆菌种子液接入细菌纤维素发酵培养基进行发酵，得细菌纤维素发酵液；2)取细菌纤维素发酵液中的细菌纤维素膜，处理后即得细菌纤维素。该方法具有成本低、工艺简单、便于工业化生产等优点，稳定性及重现性都较好，发酵所得细菌纤维素产量大于15g/L，适宜进行大规模生产。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以苹果渣为原料的细菌纤维素发酵培养基及利用该培养基生产细菌纤维素的方法。 

背景技术

细菌纤维素是由生长在液态含糖基质中的细菌产生的，并分泌到基质中的纤维素成分，是由葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的高分子聚合物，在生物医学材料、药学材料、渗透气化膜、燃料电池、造纸及其纤维素衍生物等领域具有广泛应用前景。然而细菌纤维素培养基成本高、产量和产率低等问题却是其工业化生产和推广应用的瓶颈。利用各种废渣、废液进行细菌纤维素的生产，降低其生产成本，是促进其工业化生产及应用的有效途径。 

发明内容

本发明的目的在于一种以苹果渣为原料的细菌纤维素发酵培养基及利用该培养基生产细菌纤维素的方法，该方法工艺简单，稳定性好，能够批量工业化生产。 

本发明是通过以下技术方案来实现： 

一种以苹果渣为原料的细菌纤维素发酵培养基，每升该培养基中含有蔗糖10～20g，牛肉膏4～5g，磷酸氢二钠4～5g，柠檬酸0.8～1.0g，乙醇8～10g，其余为苹果渣水解液，该培养基的pH值为5.5～6.5； 

所述的苹果渣水解液是将苹果渣干燥、粉碎后进行再生，然后加水充分混匀，再加入终浓度为20～25EGU/g的纤维素酶进行水解后制得； 

所述的再生是取干燥、粉碎后的苹果渣，加入离子液体至苹果渣的质量浓度为3％～7％，然后在90～120℃、80～120r/min的条件下，搅拌处理60～120min，得到苹果渣溶液，再加入苹果渣溶液4～8倍体积的水，在 150～200r/min搅拌处理30～60min后，在3000～5000r/min下，离心10～20min，收集沉淀，将沉淀在40～60℃真空干燥3～5h，得到再生苹果渣。 

所述的离子液体为氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、氯化1-丁基-3-甲基咪唑、氯化1-乙基-3-甲基咪唑或醋酸1-乙基-3-甲基咪唑。 

按照1g：(4～7)mL的料液比，向再生后的苹果渣中加水。 

所述的水解是在pH值为4.5～5.5，温度为55～65℃的条件下，水解10～12h。 

水解后还包括升温、灭酶的操作，具体操作是将水解得到的苹果渣水解液升温至90～100℃，灭酶10～15min。 

所述的干燥、粉碎是取新鲜苹果渣，在100～110℃下干燥处理10～12h，然后粉碎过60～80目筛网。 

一种利用以苹果渣为原料的细菌纤维素发酵培养基生产细菌纤维素的方法，包括以下步骤： 

1)将木糖葡糖酸醋杆菌活化，得活化的木糖葡糖酸醋杆菌，将活化的木糖葡糖酸醋杆菌扩大培养，得到木糖葡糖酸醋杆菌种子液，按照每100mL接种3～6mL的接种量将木糖葡糖酸醋杆菌种子液接种至细菌纤维素发酵培养基中，在28～32℃下，发酵8～10d，得到细菌纤维素发酵液； 

2)将细菌纤维素发酵液液面上层的细菌纤维素膜取出，水洗后，于80～90℃下，在碱性溶液中浸泡20～40min，然后取出，反复冲洗至细菌纤维素膜呈透明状，吸干水分，干燥至恒重，得到细菌纤维素。 

步骤1)所述的活化是将木糖葡糖酸醋杆菌接种于活化培养基中，在28～32℃下，一次培养28～32h，得到木糖葡糖酸醋杆菌一次培养菌株，将该木糖葡糖酸醋杆菌一次培养菌株再次接种于活化培养基中，在28～32℃下，二次培养28～32h，得到活化的木糖葡糖酸醋杆菌； 

其中，所述的活化培养基中含有蔗糖40～50g/L，牛肉膏10～15g/L，磷酸氢二钠4～5g/L，柠檬酸0.8～1.0g/L，乙醇8～10g/L，琼脂15～20g/L，pH值为 5.5～6.5。 

步骤1)所述的扩大培养是将活化的木糖葡糖酸醋杆菌接种于扩培培养基中，在温度为28～32℃，转速为150～200rpm的条件下，振荡培养18～22h，得到木糖葡糖酸醋杆菌种子液； 

其中，所述的扩培培养基中含有蔗糖40～50g/L，牛肉膏10～15g/L，磷酸氢二钠4～5g/L，柠檬酸0.8～1.0g/L，乙醇8～10g/L，pH值为5.5～6.5。 

步骤2)所述的碱性溶液为质量浓度为1.0～1.5％的NaOH溶液；所述的干燥是在100～110℃下进行；冲洗是用蒸馏水反复进行冲洗。 

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果： 

本发明公开的细菌纤维素发酵培养基以苹果渣为原料，原料经预处理后，采用纤维素酶水解苹果渣中纤维素为还原糖，作为木糖葡糖酸醋杆菌发酵生产细菌纤维素的营养基质。苹果渣中主要含有纤维素、还原糖等成分。在对苹果渣原料处理过程中，本发明首次提出了利用咪唑类离子液体对苹果渣进行再生。咪唑类离子液体对苹果渣中的纤维素具有良好的溶解性能及较低的降解作用，且合成工艺简单，热稳定性好。与纤维素作用过程中，其阴离子具有很强的氢键接受能力，可以和纤维素大分子链中羟基上的氢形成氢键，从而破坏了纤维素中大分子链间存在的大量氢键，最终导致纤维素的溶解。溶解后的纤维素溶液加水之后可使纤维素沉淀析出，实现纤维素的再生。再生过程可去除木质素成分，降低对后续酶水解过程的抑制作用。同时再生过程可使纤维素分子中部分氢键断裂，聚合度、结晶度降低，使纤维素晶型由Ⅰ型转变为更利于酶水解的Ⅱ型，同时使纤维素的表面形态发生改变，表面积增大，进而与酶的接触面积增大。因此咪唑类离子液体应用于苹果渣纤维素的预处理可显著提高纤维素酶水解效率，提高水解液中还原糖产率，降低生产成本。 

本发明以苹果渣为原料的细菌纤维素发酵培养基的利用减少了传统工艺中蔗糖等培养基原料用量，节省了发酵培养基制备成本，同时能够有效解决果汁生产过程中产生的大量苹果渣引起的环境污染问题，为苹果渣的综合利用、附加值的提升和开展果汁清洁生产提供了一条新的途径。 

本发明还公开了利用以苹果渣为原料的细菌纤维素发酵培养基生产细菌纤维素的方法，该方法操作简便，便于工业化生产，稳定性及重现性都较好，通过该方法生产的细菌纤维素产量大于15g/L，适宜进行大规模生产。 

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。 

实施例1 

本发明所述的菌种：木糖葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株号accc10215。 

一种生产细菌纤维素的方法，包括以下步骤： 

(1)木糖葡糖酸醋杆菌的活化 

制备木糖葡糖酸醋杆菌活化培养基，活化培养基的配方包括蔗糖40g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钠4g/L，柠檬酸0.8g/L，乙醇8g/L，琼脂15g/L，调节pH值为5.5。接种木糖葡糖酸醋杆菌accc10215于活化培养基，在28℃培养28h，将培养后的菌种再次接种于相同的、新的活化培养基中，于28℃培养28h，制得活化的木糖葡糖酸醋杆菌； 

(2)木糖葡糖酸醋杆菌的扩培 

制备木糖葡糖酸醋杆菌扩培培养基，扩培培养基的配方包括蔗糖40g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钠4g/L，柠檬酸0.8g/L，乙醇8g/L，调节pH值为 5.5，接种活化的木糖葡糖酸醋杆菌于扩培培养基中，在150r/min、28℃下培养18h，得到木糖葡糖酸醋杆菌种子液； 

(3)细菌纤维素发酵培养基的制备 

取新鲜苹果渣，100℃干燥处理10h，辗槽粉碎后过60～80目筛网，得粉碎苹果渣，加入离子液体AMIMCl(氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑)至苹果渣终质量浓度为3％(g/g，此处终浓度指苹果渣在离子液体中的质量分数)然后在90℃、80r/min处理60min，使苹果渣完全溶解，得到苹果渣溶液，之后加入苹果渣溶液4倍体积自来水，150r/min剧烈搅拌30min，3000r/min离心10min，收集沉淀，40℃真空干燥3h，得到再生苹果渣，按照1g：4mL的料液比，向再生后苹果渣中加自来水充分混匀后，加纤维素酶至终浓度为20EGU/g，在pH值为4.5、温度为55℃的条件下水解10h，反应结束后升温至90℃维持10min灭纤维素酶，得苹果渣水解液； 

按照每升该培养基中含有蔗糖10g，牛肉膏4g，磷酸氢二钠4g，柠檬酸0.8g，乙醇8g，其余为苹果渣水解液，调节pH值为5.5，得细菌纤维素发酵培养基； 

(4)细菌纤维素的发酵 

取种龄为18h的木糖葡糖酸醋杆菌种子液，按照每100mL接种3mL的接种量，将木糖葡糖酸醋杆菌种子液接入细菌纤维素发酵培养基中，在28℃静态发酵8d后结束发酵，得细菌纤维素发酵液； 

(5)细菌纤维素膜的处理 

取细菌纤维素发酵液中的细菌纤维素膜，蒸馏水冲洗，于80℃下，在质量浓度为1％的NaOH溶液中浸泡20min，然后将细菌纤维素膜取出后，用蒸馏水反复冲洗至凝胶膜透明无色，用干燥滤纸吸干表面水分，100℃干燥至 恒重，得细菌纤维素产品，细菌纤维素发酵产量为15.31g/L。 

实施例2 

一种生产细菌纤维素的方法，包括以下步骤： 

(1)木糖葡糖酸醋杆菌的活化 

制备木糖葡糖酸醋杆菌活化培养基，活化培养基的配方包括蔗糖45g/L，牛肉膏13g/L，磷酸氢二钠4.5g/L，柠檬酸0.9g/L，乙醇9g/L，琼脂17g/L，调节pH值为6.0。接种木糖葡糖酸醋杆菌accc10215于活化培养基，在28℃培养28h，将培养后的菌种再次接种于相同的、新的活化培养基中，于28℃培养28h，制得活化的木糖葡糖酸醋杆菌； 

(2)木糖葡糖酸醋杆菌的扩培 

制备木糖葡糖酸醋杆菌扩培培养基，扩培培养基的配方包括蔗糖45g/L，牛肉膏13g/L，磷酸氢二钠4.5g/L，柠檬酸0.9g/L，乙醇9g/L，调节pH值为6.0，接种活化的木糖葡糖酸醋杆菌于扩培培养基中，在180r/min、30℃下培养20h，得到木糖葡糖酸醋杆菌种子液； 

(3)细菌纤维素发酵培养基的制备 

取新鲜苹果渣，105℃干燥处理11h，辗槽粉碎后过60～80目筛网，得粉碎苹果渣，加入离子液体BMIMCl(氯化1-丁基-3-甲基咪唑)至苹果渣终浓度为5％(g/g，此处终浓度指苹果渣在离子液体中的质量分数)，110℃、100r/min处理90min，使苹果渣完全溶解，得到苹果渣溶液，之后加入苹果渣溶液6倍体积自来水，200r/min剧烈搅拌40min，4000r/min离心10～0min，收集沉淀，50℃真空干燥4h，得到再生苹果渣，按照1g：5mL的料液比，向再生后的苹果渣中加自来水充分混匀后，加纤维素酶至终浓度为23EGU/g，在pH值为6.0、温度为60℃的条件下水解11h，反应结束后升温至95℃维持 12min灭纤维素酶，得苹果渣水解液； 

按照每升该培养基中含有蔗糖15g，牛肉膏4.5g，磷酸氢二钠4.5g，柠檬酸0.9g，乙醇9g，其余为苹果渣水解液，调节pH值为6.0，得细菌纤维素发酵培养基； 

(4)细菌纤维素的发酵 

取种龄为20h的木糖葡糖酸醋杆菌种子液，按照每100mL接种4mL的接种量，将木糖葡糖酸醋杆菌种子液接入细菌纤维素发酵培养基中，在30℃静态发酵9d后结束发酵，得细菌纤维素发酵液； 

(5)细菌纤维素膜的处理 

取细菌纤维素发酵液中的细菌纤维素膜，蒸馏水冲洗，于85℃下，在质量浓度为1.3％的NaOH溶液中浸泡30min，然后将细菌纤维素膜取出后，用蒸馏水反复冲洗至凝胶膜透明无色，用干燥滤纸吸干表面水分，105℃干燥至恒重，得细菌纤维素产品，细菌纤维素发酵产量为17.41g/L。 

实施例3 

一种生产细菌纤维素的方法，包括以下步骤： 

(1)木糖葡糖酸醋杆菌的活化 

制备木糖葡糖酸醋杆菌活化培养基，活化培养基的配方包括蔗糖50g/L，牛肉膏15g/L，磷酸氢二钠5g/L，柠檬酸1.0g/L，乙醇10g/L，琼脂20g/L，调节pH值为6.5。接种木糖葡糖酸醋杆菌accc10215于活化培养基，在32℃培养32h，将培养后的菌种再次接种于相同的、新的活化培养基中，于32℃培养32h，制得活化的木糖葡糖酸醋杆菌； 

(2)木糖葡糖酸醋杆菌的扩培 

制备木糖葡糖酸醋杆菌扩培培养基，扩培培养基的配方包括蔗糖 50g/L，牛肉膏15g/L，磷酸氢二钠5g/L，柠檬酸1.0g/L，乙醇10g/L，调节pH值为6.5，接种活化的木糖葡糖酸醋杆菌于扩培培养基中，在200r/min、32℃下培养22h，得到木糖葡糖酸醋杆菌种子液； 

(3)细菌纤维素发酵培养基的制备 

取新鲜苹果渣，110℃干燥处理12h，辗槽粉碎后过60～80目筛网，得粉碎苹果渣，加入离子液体EMIMCl(氯化1-乙基-3-甲基咪唑)至苹果渣终浓度为7％(g/g，此处终浓度指苹果渣在离子液体中的质量分数)，120℃、120r/min处理120min，使苹果渣完全溶解，得到苹果渣溶液，之后加入苹果渣溶液8倍体积自来水，200r/min剧烈搅拌60min，5000r/min离心20min，收集沉淀，60℃真空干燥5h，得到再生苹果渣，按照1g：7mL的料液比，向再生后的苹果渣中加自来水充分混匀后，加纤维素酶至终浓度为25EGU/g，在pH值为6.5、温度为65℃的条件下水解12h，反应结束后升温至100℃维持15min灭纤维素酶，得苹果渣水解液； 

按照每升该培养基中含有蔗糖20g，牛肉膏5g，磷酸氢二钠5g，柠檬酸1g，乙醇10g，其余为苹果渣水解液，调节pH值为6.5，得细菌纤维素发酵培养基； 

(4)细菌纤维素的发酵 

取种龄为22h的木糖葡糖酸醋杆菌种子液，按照每100mL接种6mL的接种量，将木糖葡糖酸醋杆菌种子液接入细菌纤维素发酵培养基中，在32℃静态发酵10d后结束发酵，得细菌纤维素发酵液； 

(5)细菌纤维素膜的处理 

取细菌纤维素发酵液中的细菌纤维素膜，蒸馏水冲洗，于90℃下，在质量浓度为1.5％的NaOH溶液中浸泡40min，然后将细菌纤维素膜取出后，用 蒸馏水反复冲洗至凝胶膜透明无色，用干燥滤纸吸干表面水分，110℃干燥至恒重，得细菌纤维素产品，细菌纤维素发酵产量为16.12g/L。 

实施例4 

一种生产细菌纤维素的方法，包括以下步骤： 

(1)木糖葡糖酸醋杆菌的活化 

制备木糖葡糖酸醋杆菌活化培养基，活化培养基的配方包括蔗糖45g/L，牛肉膏15g/L，磷酸氢二钠4.5g/L，柠檬酸0.89g/L，乙醇9g/L，琼脂18g/L，调节pH值为6.0。接种木糖葡糖酸醋杆菌accc10215于活化培养基，在30℃培养28h，将培养后的菌种再次接种于相同的、新的活化培养基中，于30℃培养28h，制得活化的木糖葡糖酸醋杆菌； 

(2)木糖葡糖酸醋杆菌的扩培 

制备木糖葡糖酸醋杆菌扩培培养基，扩培培养基的配方包括蔗糖45g/L，牛肉膏15g/L，磷酸氢二钠4.5g/L，柠檬酸0.9g/L，乙醇9g/L，调节pH值为6.0，接种活化的木糖葡糖酸醋杆菌于扩培培养基中，在170r/min、30℃下培养18h，得到木糖葡糖酸醋杆菌种子液； 

(3)细菌纤维素发酵培养基的制备 

取新鲜苹果渣，105℃干燥处理10h，辗槽粉碎后过60～80目筛网，得粉碎苹果渣，加入离子液体EMIMAc(醋酸1-乙基-3-甲基咪唑)至苹果渣终浓度为5％(g/g，此处终浓度指苹果渣在离子液体中的质量分数)，110℃、100r/min处理100min，使苹果渣完全溶解，得到苹果渣溶液，之后加入苹果渣溶液7倍体积自来水，200r/min剧烈搅拌40min，4000r/min离心20min，收集沉淀，50℃真空干燥5h，得到再生苹果渣，按照1g：6mL的料液比，向再生后的苹果渣中加自来水充分混匀后，加纤维素酶至终浓度为23EGU/g， 在pH值为5.0、温度为60℃的条件下一级水解11h，反应结束后升温至95℃维持10min灭纤维素酶，得苹果渣水解液； 

按照每升该培养基中含有蔗糖15g，牛肉膏4.5g，磷酸氢二钠4.5g，柠檬酸0.9g，乙醇9g，其余为苹果渣水解液，调节pH值为6.0，得细菌纤维素发酵培养基； 

(4)细菌纤维素的发酵 

取种龄为18h的木糖葡糖酸醋杆菌种子液，按照每100mL接种4mL的接种量，将木糖葡糖酸醋杆菌种子液接入细菌纤维素发酵培养基中，在30℃静态发酵8d后结束发酵，得细菌纤维素发酵液； 

(5)细菌纤维素膜的处理 

取细菌纤维素发酵液中的细菌纤维素膜，蒸馏水冲洗，于85℃下，在质量浓度为1.0％的NaOH溶液中浸泡20min，然后将细菌纤维素膜取出后，用蒸馏水反复冲洗至凝胶膜透明无色，用干燥滤纸吸干表面水分，105℃干燥至恒重，得细菌纤维素产品，细菌纤维素发酵产量为16.60g/L。 

实施例5 

一种生产细菌纤维素的方法，包括以下步骤： 

(1)木糖葡糖酸醋杆菌的活化 

制备木糖葡糖酸醋杆菌活化培养基，活化培养基的配方包括蔗糖40g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钠4g/L，柠檬酸0.8g/L，乙醇8g/L，琼脂15g/L，调节pH值为5.5。接种木糖葡糖酸醋杆菌accc10215于活化培养基，在28℃培养32h，将培养后的菌种再次接种于相同的、新的活化培养基中，于28℃培养32h，制得活化的木糖葡糖酸醋杆菌； 

(2)木糖葡糖酸醋杆菌的扩培 

制备木糖葡糖酸醋杆菌扩培培养基，扩培培养基的配方包括蔗糖40g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钠4g/L，柠檬酸0.8g/L，乙醇8g/L，调节pH值为5.5，接种活化的木糖葡糖酸醋杆菌于扩培培养基中，在150r/min、28℃下培养22h，得到木糖葡糖酸醋杆菌种子液； 

(3)细菌纤维素发酵培养基的制备 

取新鲜苹果渣，100℃干燥处理12h，辗槽粉碎后过60～80目筛网，得粉碎苹果渣，加入离子液体AMIMCl(氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑)至苹果渣终浓度为4％(g/g，此处终浓度指苹果渣在离子液体中的质量分数)，100℃、90r/min处理100min，使苹果渣完全溶解，得到苹果渣溶液，之后加入苹果渣溶液5倍体积自来水，200r/min剧烈搅拌60min，3500r/min离心20min，收集沉淀，60℃真空干燥5h，得到再生苹果渣，按照1g：4mL的料液比，向再生后的苹果渣中加自来水充分混匀后，加纤维素酶至终浓度为20EGU/g，在pH值为4.5、温度为55℃的条件下水解10h，反应结束后升温至90℃维持15min灭纤维素酶，得苹果渣水解液； 

按照每升该培养基中含有蔗糖10g，牛肉膏4g，磷酸氢二钠4g，柠檬酸0.8g，乙醇8g，其余为苹果渣水解液，调节pH值为5.5，得细菌纤维素发酵培养基； 

(4)细菌纤维素的发酵 

取种龄为22h的木糖葡糖酸醋杆菌种子液，按照每100mL接种3mL的接种量，将木糖葡糖酸醋杆菌种子液接入细菌纤维素发酵培养基中，在28℃静态发酵10d后结束发酵，得细菌纤维素发酵液； 

(5)细菌纤维素膜的处理 

取细菌纤维素发酵液中的细菌纤维素膜，蒸馏水冲洗，于80℃下，在质 量浓度为1.0％的NaOH溶液中浸泡40min，然后将细菌纤维素膜取出后，用蒸馏水反复冲洗至凝胶膜透明无色，用干燥滤纸吸干表面水分，100℃干燥至恒重，得细菌纤维素产品，细菌纤维素发酵产量为15.78g/L。 

综上所述，本发明利用苹果渣发酵生产细菌纤维素，一方面可以解决苹果渣大量产生而引起的环境污染问题，为苹果渣的综合利用、附加值的提升和果汁的清洁化生产提供新途径，同时也为细菌纤维素的大规模生产找到一种廉价原料，为其生产成本的降低及大规模生产提供可能，因此该技术具有重要意义。