一种水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器

摘要

本发明公开了一种水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器，其是由以下方法获得：（1）将β-双酮溶于漆酶溶液A中，得到溶液C；（b）向三口烧瓶中加入烯类共聚单体、交联剂和溶液C；（c）向三口烧瓶中通入惰性气体反应10-20min，后置于15℃~65℃恒温水浴30-90min，获得水凝胶；（d）将水凝胶水洗4-8遍，置于-50℃~-80℃冷冻干燥至恒重，即获得水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器；本发明获得的水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器，具有吸附与降解功能，可促进水体中的污染物与酶促反应体系的接触，提高降解效率，且避免了因漆酶被动适应载体所导致的酶构型变化甚至活性的降低，漆酶固载率高于90%，酶活回收率达11.2%。

说明书

 

技术领域

本发明属于聚合物水凝胶、生物技术与环境功能复合材料领域，特别是一种水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器。

背景技术

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，能催化氧化多种难降解的有机污染物（李阳，蒋国翔、牛军峰，王颖，呼丽娟.漆酶催化氧化水中有机污染物.化学进展，2009 ,21（10）,2028-2036.），具有降解底物广泛、能耗低、易操作、环境友好等优点，已经在有机废水处理领域显示出良好的应用前景（Philippe Demarche，Charles Junghanns，Rakesh R.Nair，Spiros N.Agathos. Harnessing the power of enzymes for environmental stewardship. Biotechnology Advances，2012,30（5），933-953.）。然而，漆酶的水溶性及随环境条件而变性失活的不稳定性限制了漆酶在废水处理中的应用。

酶的固定化是实现酶重复连续使用和稳定性改善的有效手段，目前已发展出多种制备固定化酶的方法，主要有吸附法、包埋法、共价结合法以及交联法，这些方法各有优缺点，其中包埋法是将酶物理包埋于高聚物网格或微囊内的一种固定化方法，一般反应条件温和，对酶自身的结构改变少，酶活性损失较小，固定化效率较高，应用相对较为成熟；微囊包埋法主要用于医学治疗，不适合废水处理工程的应用；采用合成高分子的凝胶包埋法一般需要使用引发剂或交联剂，而试剂的残留会影响到凝胶的性质；此外，包埋法的缺点是高聚物网格会对大分子物质产生扩散阻力，导致固定化酶动力学行为改变，使酶活力降低，因此，载体（包埋剂）的选择是酶固定化技术中的一个关键问题。

一种理想的固定化酶载体需要满足如下要求：维持酶的催化活性和专一性；与酶的结合牢固；机械强度好；有最小的空间位阻；稳定，不与底物和产物反应；廉价、环境友好，在研究较多的凝胶包埋法中，常用的包埋剂主要有天然高分子类物质（如琼脂、海藻酸钠、卡拉胶、明胶、几丁质）和合成类高分子物质（如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等）。研究表明，琼脂强度较差；明胶内部结构密实、传质性能差；卡拉胶稳定性较差、易降解；聚丙烯酰胺凝胶的单体对生物有毒性；聚乙烯醇凝胶的机械强度和传质性能均较好，对生物无毒，且耐生物分解。但是，单用聚乙烯醇与硼酸交联成球困难，易成絮状体，且成球后，球体机械强度较差。

壳聚糖因其在自然界中资源丰富、来源经济、具有良好的生物相容性、与其它天然材料相比更抗拒微生物分解、具有良好的热稳定性和机械操作性、诸多基团可以修饰的独特性能，倍受广大国内外研究者的关注，已有多种通过物理或化学手段制备壳聚糖水凝胶的方法。近年来，由天然高分子与合成高分子共混制备的水凝胶显示出良好的应用前景。但是，目前为止真正可用于实际废水处理的酶固定化载体并不多。究其原因，在于现有的方法局限于将酶被动负载在载体表面或包裹在载体内部的技术思路，被束缚的酶在被动适应其存在的固定化空间时被迫发生构象甚至化学结构的改变，从而使酶活力降低。

此外，漆酶虽然具有宽泛的底物专一性，但除酚类化合物外，漆酶对底物的氧化降解需要借助中间介体的作用（Kumarasamy Murugesan, Yoon-Young Chang, Young-Mo Kim, Jong-Rok Jeon, Eun-Ju Kim, Yoon-Seok Chang. Enhanced transformation of triclosan by laccase in the presence of redox mediators. Water Research，2010，44，298-308.）。酶的固定化虽然为酶的重复和连续使用提供了解决方案，但是，长期以来在酶的固定化研究中，介体的选择和使用这一关键问题却被忽略了，至今未见将漆酶与介体同时固定于某一载体的相关文献报道，因此，如何研制一种新型的使酶能够自主选择固定化空间的漆酶-介体体系复合材料，是本领域一个亟需解决的关键科学问题。

发明内容

   针对上述问题，提供一种具有吸附与降解功能的水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器，以促进水体中污染物与酶促反应体系的接触，提高降解效率，本发明是这样实现的：

一种水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器，其特征在于，所述水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器是通过以下步骤获得的：

a）将β-双酮溶于漆酶溶液A中，得到溶液C，溶液C即为自由基引发体系；溶液C中漆酶酶活为3~10 U/ml，β-双酮浓度为50~500 mM；

b）向三口烧瓶中加入烯类共聚单体、交联剂和漆酶总酶活不低于20U的溶液C，形成水凝胶前驱体溶液，水凝胶前驱体溶液中交联剂的质量为烯类共聚单体质量的3.0%-20.0%；

c）向三口烧瓶中通入惰性气体反应10-20min，后将三口烧瓶置于15℃~65℃恒温水浴30-90min发生聚合反应，获得水凝胶；

d）将步骤c获得的水凝胶水洗4-8遍，置于-50℃ ~ -80℃冷冻干燥至恒重，即获得一种新型复合材料，定义为水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器。

优选的，本发明中，步骤a中所述漆酶溶液A是将漆酶溶于醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH为3.6~5.8）、醋酸溶液（pH为3.6~5.8）、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液（pH为5.8~7.0）、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（pH为3.6~7.0）、纯水中的一种获得的。

优选的，本发明中，步骤a中所述β-双酮为乙酰丙酮，改变乙酰丙酮的浓度可以控制复合材料的机械强度。

优选的，本发明中，步骤b中，所述烯类共聚单体为丙烯酰胺，交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。

优选的，本发明中，步骤c中，所述惰性气体为氮气或氩气。

    优选的，本发明中，步骤b中，步骤b中，所述水凝胶前驱体溶液中还包括溶液B；所述溶液B是将壳聚糖溶于乙酸溶液而获得壳聚糖浓度为5-25 g/L的溶液；水凝胶前驱体溶液中烯类共聚单体与壳聚糖的质量比为30:1 ~ 3:1 ，交联剂的质量为烯类共聚单体和壳聚糖质量总和的3.0%-20.0%。

优选的，本发明中，所述乙酸溶液浓度为0.5% ~ 1.0%。

本发明针对漆酶被动适应载体空间所导致构型变化甚至酶活性降低的问题，通过漆酶-介体体系引发原位组装合成水凝胶，将漆酶和介体同时原位组装于具有三维网状结构的水凝胶中，使漆酶能够自主选择固定化空间，与现有的漆酶固定化技术相比，本发明提供的水凝

胶固定化漆酶-介体酶促反应器具有以下优点：

（1）本发明制备的水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器是通过漆酶-介体体系引发原位组装而成，避免了因漆酶被动适应载体所导致的酶构型变化甚至活性的降低，反应条件温和，漆酶固定化效率高于90%，酶活回收率达11.2%，漆酶固载稳定，漆酶析出率低于1%。

（2）本发明制备的水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器中，壳聚糖接枝丙烯酰胺水凝胶为三维网状结构，其在为漆酶提供附着支撑的同时，对水体中的部分污染物具有良好的吸附作用，可促进污染物与酶促反应体系的接触，提高降解效率。

（3）本发明通过漆酶-介体体系启动和调控壳聚糖与丙烯酰胺的聚合反应，将漆酶和介体同时原位组装于具有三维网状结构的水凝胶中，形成了完备的漆酶-介体酶促反应器，克服了漆酶在降解具有较高氧化还原电位污染物时，需要外部投加氧化还原介体的难题。

附图说明

图1为实施例3、4、5中水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器的红外光谱；

图2为实施例9中灭活前后水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器吸附降解橙黄II染料溶液的HPLC图；

图3为实施例10中灭活前后水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器吸附降解孔雀石绿染料溶液的HPLC图；

图4为实施例11水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器平行样吸附降解橙黄II染料溶液循环实验效果图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体的实施例，对本发明作详细描述。

实施例1

（1）        配制漆酶-介体自由基引发剂：将0.08 g漆酶溶于pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，得到漆酶溶液A，使用紫外分光光度计测量其酶活。将乙酰丙酮溶于总酶活为80 U的溶液A中，乙酰丙酮浓度为50 mM，静置10 min，得到溶液C，即自由基引发体系；

（2）        配制水凝胶前驱体溶液：称取1.420 g丙烯酰胺、0.1 g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺于250 ml三口烧瓶中，再将10 ml的蒸馏水加入到三口烧瓶中，形成水凝胶前驱体溶液；

（3）        水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器的制备:将步骤1制备的溶液C（自由基引发体系）加入到步骤2制备的水凝胶前驱体溶液中，然后向三口烧瓶通入高纯氮气10 min以排除混合体系中的氧气，再将三口烧瓶密闭静置于45℃的恒温水浴30 min，得到浅白色透明水凝胶；将获得的水凝胶使用纯水反复清洗后，置于冷冻干燥机中干燥至恒重，即形成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器。

实施例2

（1）        配制漆酶-介体自由基引发剂：将0.08 g漆酶溶于pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，得到漆酶溶液A，使用紫外分光光度计测量其酶活；将乙酰丙酮溶于总酶活为20 U的溶液A中，乙酰丙酮浓度为50 mM，静置10 min，得到溶液C，构成自由基引发体系。

（2）        配制水凝胶前驱体溶液：将0.5 g壳聚糖溶于100 ml 0.5%的醋酸溶液中，得到溶液B；称取1.420 g丙烯酰胺、0.1 g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺于250 ml三口烧瓶中，再将8 ml的溶液B加入到三口烧瓶中，形成水凝胶前驱体溶液；

（3）        水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器的制备：将步骤1获得的溶液C（自由基引发体系）加入到步骤2获得的水凝胶前驱体溶液中，然后向三口烧瓶通入高纯氮气15 min以排除混合体系中的氧气，再将三口烧瓶密闭静置于45℃的恒温水浴中并计时，60 min得到浅黄色透明水凝胶；将水凝胶使用纯水反复清洗后，置于冷冻干燥机中干燥至恒重，即形成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器。

实施例3

（1）        配制漆酶-介体自由基引发剂：将0.08 g漆酶溶于pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，得到漆酶溶液A，使用紫外分光光度计测量其酶活；将乙酰丙酮溶于总酶活为80 U的溶液A中，其中乙酰丙酮浓度为150 mM，静置10 min，得到溶液C，构成自由基引发体系；

（2）        配制水凝胶前驱体溶液：将0.5 g壳聚糖溶于100 ml 1%的醋酸溶液中，得到溶液B；称取1.420 g丙烯酰胺、0.1 g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺于250 ml三口烧瓶中，再将8 ml的溶液B加入到三口烧瓶中，形成水凝胶前驱体溶液；

（3）        水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器的制备：将步骤1获得的溶液C（自由基引发体系）加入到步骤2获得的水凝胶前驱体溶液中，然后向三口烧瓶通入高纯氮气15 min以排除混合体系中的氧气，再将三口烧瓶密闭静置于45℃的恒温水浴中并计时，60 min得到浅黄色透明水凝胶；将水凝胶使用纯水反复清洗后，置于冷冻干燥机中干燥至恒重，即形成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器。

实施例4

（1）  配制漆酶-介体自由基引发剂：将0.08 g漆酶溶于pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，得到漆酶溶液A，使用紫外分光光度计测量其酶活，将乙酰丙酮溶于总酶活为80 U的溶液A中，其中乙酰丙酮浓度为150 mM，静置10 min，得到溶液C，构成自由基引发体系；

（2）  配制水凝胶前驱体溶液：将1 g壳聚糖溶于100 ml 1%的醋酸溶液中，得到溶液B；称取1.420 g丙烯酰胺、0.1 g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺于250 ml三口烧瓶中，再将8 ml的溶液B加入到三口烧瓶中，形成水凝胶前驱体溶液；

（3）  水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器的制备：将步骤1获得的溶液C（自由基引发体系）加入到步骤2获得的前驱体溶液中，然后向三口烧瓶通入高纯氮气10 min以排除混合体系中的氧气，再将三口烧瓶密闭静置于65℃的恒温水浴中并计时，60 min得到浅黄色透明水凝胶，将水凝胶使用纯水反复清洗后，置于冷冻干燥机中干燥至恒重，即形成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器。

实施例5

（1）  配制漆酶-介体自由基引发剂：将0.08 g漆酶溶于pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，得到漆酶溶液A，使用紫外分光光度计测量其酶活。将乙酰丙酮溶于总酶活为80 U的溶液A中，其中乙酰丙酮浓度为150 mM，静置10 min，得到溶液C，即自由基引发体系；

（2）  配制水凝胶前驱体溶液：将2.5 g壳聚糖溶于100 ml 1%的醋酸溶液中，得到溶液B；称取1.420 g丙烯酰胺、0.1 g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺于250 ml三口烧瓶中，再将8 ml的溶液B加入到三口烧瓶中，形成水凝胶前驱体溶液；

（3）  水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器的制备：将步骤1获得的溶液C（自由基引发体系）加入到步骤2获得的前驱体溶液中，然后向三口烧瓶通入高纯氮气10 min以排除混合体系中的氧气，再将三口烧瓶密闭静置于45℃的恒温水浴中并计时，60 min得到浅黄色透明水凝胶，将水凝胶使用纯水反复清洗后，置于冷冻干燥机中干燥至恒重，形成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器。

将实施例3、4、5所获得的水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器进行傅里叶红外光谱检测，检测结果如图1所示，其中A为实施例3检测结果（丙烯酰胺与壳聚糖质量为30:1），B为实施例4检测结果，（丙烯酰胺与壳聚糖质量为15:1），C为实施例5检测结果，（丙烯酰胺与壳聚糖质量为7:1）由图中的官能团红外特征吸收频率可以看出，丙烯酰胺与壳聚糖均发生了不同程度的接枝聚合反应。

实施例6

（1）  配制漆酶-介体自由基引发剂：将0.08 g漆酶溶于pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，得到漆酶溶液A，使用紫外分光光度计测量其酶活，将乙酰丙酮溶于总酶活为80 U的溶液A中，其中乙酰丙酮浓度为500 mM，静置10 min，得到溶液C，构成自由基引发体系；

（2）  配制水凝胶前驱体溶液：将1 g壳聚糖溶于100 ml 1%的醋酸溶液中，得到溶液B，称取1.420 g丙烯酰胺、0.1 g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺于250 ml三口烧瓶中，再将8 ml的溶液B加入到三口烧瓶中，形成水凝胶前驱体溶液；

（3）  水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器的制备：将步骤1获得的溶液C（自由基引发体系）加入到步骤2获得的前驱体溶液中，然后向三口烧瓶通入高纯氮气20 min以排除混合体系中的氧气，再将三口烧瓶密闭静置于15℃的恒温水浴中，90 min得到浅黄色水凝胶，将水凝胶使用纯水反复清洗后，置于冷冻干燥机中干燥至恒重，形成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器。

实施例7

（1）  配制漆酶-介体自由基引发剂：将0.08 g漆酶溶于pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，得到漆酶溶液A，使用紫外分光光度计测量其酶活，将乙酰丙酮溶于总酶活为80 U的溶液A中，其中乙酰丙酮浓度为150 mM，静置10 min，得到溶液C，即自由基引发体系；

（2）  配制水凝胶前驱体溶液：将1 g壳聚糖溶于100 ml 1%的醋酸溶液中，得到溶液B；称取1.420 g丙烯酰胺、0.05 g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺于250 ml三口烧瓶中，再将8 ml的溶液B加入到三口烧瓶中，形成水凝胶前驱体溶液；

（3）  水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器的制备：将步骤1获得的溶液C（自由基引发体系）加入到步骤2获得的前驱体溶液中，然后向三口烧瓶通入高纯氮气10 min以排除混合体系中的氧气，再将三口烧瓶密闭静置于45℃的恒温水浴中并计时，60 min得到浅黄色透明水凝胶，将水凝胶使用纯水反复清洗后，置于冷冻干燥机中干燥至恒重，形成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器。

实施例8

（1）  配制漆酶-介体自由基引发剂：将0.08 g漆酶溶于pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，得到漆酶溶液A，使用紫外分光光度计测量其酶活。将乙酰丙酮溶于总酶活为80 U的溶液A中，其中乙酰丙酮浓度为150 mM，静置10 min，得到溶液C，构成自由基引发体系。

（2）  配制水凝胶前驱体溶液：将2 g壳聚糖溶于100 ml 1%的醋酸溶液中，得到溶液B；称取1.420 g丙烯酰胺、0.32 g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺于250 ml三口烧瓶中，再将8 ml的溶液B加入到三口烧瓶中，形成水凝胶前驱体溶液；

（3）  水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器的制备：将步骤1获得的溶液C（自由基引发体系）加入到步骤2获得的前驱体溶液中，然后向三口烧瓶通入高纯氮气10 min以排除混合体系中的氧气，再将三口烧瓶密闭静置于45℃的恒温水浴中并计时，60 min得到浅黄色透明水凝胶，将水凝胶使用纯水反复清洗后，置于冷冻干燥机中干燥至恒重，形成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器。

实施例9

按照以下步骤合成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器：

（1）        配制漆酶-介体自由基引发剂：将0.08 g漆酶溶于pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，得到漆酶溶液A，使用紫外分光光度计测量其酶活；将乙酰丙酮溶于总酶活为80 U的溶液A中，其中乙酰丙酮浓度为150 mM，静置10 min，得到溶液C，构成自由基引发体系；

（2）        配制水凝胶前驱体溶液：将2.0 g壳聚糖溶于100 ml 1%的醋酸溶液中，得到溶液B；称取0.533 g丙烯酰胺、0.1 g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺于250 ml三口烧瓶中，再将8 ml的溶液B加入到三口烧瓶中，形成水凝胶前驱体溶液；

（3）        水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器的制备：将步骤1获得的溶液C（自由基引发体系）加入到步骤2获得的前驱体溶液中，然后向三口烧瓶通入高纯氮气10 min以排除混合体系中的氧气，再将三口烧瓶密闭静置于45℃的恒温水浴中，90 min得到浅黄色透明水凝胶，将水凝胶使用纯水反复清洗后，置于冷冻干燥机中干燥至恒重，形成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器。

分别称取本实施例合成的水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器各0.17 g，分别置于纯水中溶胀平衡后，再分为灭活组与未灭活组，灭活用甲醇灭活8 h后使用纯水将甲醇清洗干净，未灭活组不做其他处理；将两组材料分别置于100 ml浓度为25 μM、pH为 3.6的橙黄II染料溶液中，在35℃恒温下反应20 h。

实验结果如图2所示，其中图2A为未灭活组，图2B为灭活组，可见灭活组只依靠吸附功能使染料溶液脱色率达83.2%，未灭活组依靠吸附与降解功能，使染料溶液脱色率达91.3% 。

实施例10

按照以下步骤合成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器：

（1）        配制漆酶-介体自由基引发剂：将0.08 g漆酶溶于pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，得到漆酶溶液A，使用紫外分光光度计测量其酶活；将乙酰丙酮溶于总酶活为80 U的溶液A中，其中乙酰丙酮浓度为150 mM，静置10 min，得到溶液C，构成自由基引发体系；

（2）        配制水凝胶前驱体溶液：将1 g壳聚糖溶于100 ml 1%的醋酸溶液中，得到溶液B；称取0.530 g丙烯酰胺、0.1 g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺于250 ml三口烧瓶中，再将8 ml的溶液B加入到三口烧瓶中，形成水凝胶前驱体溶液；

（3）        水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器的制备：将步骤1获得的溶液C（自由基引发体系）加入到步骤2获得的前驱体溶液中，然后向三口烧瓶通入高纯氮气20 min以排除混合体系中的氧气，再将三口烧瓶密闭静置于45℃的恒温水浴中，90 min得到浅黄色透明水凝胶，将水凝胶使用纯水反复清洗后，置于冷冻干燥机中干燥至恒重，形成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器。

分别称取两份本实施例合成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器各0.20 g，分别将其置于纯水中溶胀平衡后，再分为灭活组与未灭活组，将灭活组使用甲醇灭活8 h后使用纯水将甲醇清洗干净，未灭活组不做其他处理；将灭活组与未灭活组分别置于100 ml浓度为10μM、pH 4.2的孔雀石绿染料溶液中，在35℃恒温下反应15 h。

结果如图3所示，其中图3A为未灭活组，图3B为灭活组，水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器对于底物带正电荷的孔雀石绿染料废水几乎不存在吸附作用，可见单独依靠反应器的降解功能，使孔雀石绿染料溶液的脱色率达88.4%。    

实施例11

按照以下步骤合成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器：

（1）        配制漆酶-介体自由基引发剂：将0.08 g漆酶溶于pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，得到漆酶溶液A，使用紫外分光光度计测量其酶活；将乙酰丙酮溶于总酶活为80 U的溶液A中，其中乙酰丙酮浓度为150 mM，静置10 min，得到溶液C，构成自由基引发体系；

（2）        配制水凝胶前驱体溶液：将2 g壳聚糖溶于100 ml 1%的醋酸溶液中，得到溶液B；称取0.530 g丙烯酰胺、0.1 g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺于250 ml三口烧瓶中，再将8 ml的溶液B加入到三口烧瓶中，形成水凝胶前驱体溶液；

（3）        水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器的制备：将步骤1获得的溶液C（自由基引发体系）加入到步骤2获得的前驱体溶液中，然后向三口烧瓶通入高纯氮气10 min以排除混合体系中的氧气，再将三口烧瓶密闭静置于45℃的恒温水浴中，90 min得到浅黄色透明水凝胶，将水凝胶使用纯水反复清洗后，置于冷冻干燥机中干燥至恒重，形成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器。

分别称取三份质量为0.15 g的本实施例获得的水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器，分别置于纯水中溶胀平衡后，将三份材料分别置于100 ml浓度为25 μM、pH 3.6的橙黄II染料溶液中，在35℃恒温下反应20 h后，将三份材料从染料溶液中滤出，再次分别置于100 ml浓度为25 μM的橙黄II染料溶液中，在35℃恒温下反应20 h，以此方式共进行六次循环实验。

   结果如图4所示，三份样品的第一批次循环实验的脱色率分别为92.6%、90.2%、92.0%，第一批次至第六批次染料溶液脱色率均呈递减趋势，第六批次脱色率分别为60.5%、62.4%、68.1% 。

实施例12

按照以下步骤合成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器：

（1）        配制漆酶-介体自由基引发剂：将0.08 g漆酶溶于pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，得到漆酶溶液A，使用紫外分光光度计测量其酶活。将乙酰丙酮溶于总酶活为80 U的溶液A中，其中乙酰丙酮浓度为75 mM，静置10 min，得到溶液C，构成自由基引发体系；

（2）        配制水凝胶前驱体溶液：将1 g壳聚糖溶于100 ml 1%的醋酸溶液中，得到溶液B；称取0.530 g丙烯酰胺、0.1 g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺于250 ml三口烧瓶中，再将8 ml的溶液B加入到三口烧瓶中，形成水凝胶前驱体溶液；

（3）        水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器的制备：将步骤1获得的溶液C（自由基引发体系）加入到步骤2获得的前驱体溶液中，然后向三口烧瓶通入高纯氮气10 min以排除混合体系中的氧气，再将三口烧瓶密闭静置于45℃的恒温水浴中，90 min得到浅黄色透明水凝胶，将水凝胶使用纯水反复清洗后，置于冷冻干燥机中干燥至恒重，形成水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器。

取江苏某印染厂污水处理工艺生化池入水口实际废水，测得其COD值为290 mg/L、pH值为7.8、悬浮物含量为122 mg/L 。将该废水过滤，除去悬浮物，并将废水pH调至4.2。

称取质量为0.25 g的本实施例合成材料并于纯水中溶胀平衡，然后将材料置于100 ml上述实际废水中，在35℃恒温下反应24 h。

    经本材料吸附降解后，实际废水脱色率达79.5%，COD值降至65 mg/L，达到国家纺织染整工业水污染物排放标准。

     以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些改进都属于本发明的保护范围。