一种山羊精液玻璃化冷冻和解冻配方与方法

摘要

本发明公开了一种山羊精液玻璃化冷冻和解冻配方与方法，其中山羊精液玻璃化冷冻配方包括：1)基础液：含20mg/ml牛血清白蛋白的MEM培养基；2)平衡液：基础液添加20％乙二醇；3)玻璃化冷冻液：于基础液中添加70％乙二醇、0.8mol/ml海藻糖、10％聚乙烯吡咯烷酮。解冻配方包括解冻液1(TS1)：基础液添加0.4mol/L海藻糖解冻；解冻液2(TS2)：基础液。本发明还选择了合适的冷冻及解冻方法，提高了解冻后精子活力，具有冷冻过程简单易于操作，冷冻效果好的特点。

说明书

技术领域

本发明动物生殖生理与繁殖技术领域，具体涉及一种山羊精液玻璃化冷冻和解冻配方与方法。

背景技术

羊冷冻精液的研究国外起始于20世纪30年代，我国起始于1978年，但到目前为止仍未形成成熟稳定的程序化冷冻技术。羊的精子和鸡、牛精子相比更加脆弱，在冷冻、解冻过程极易形成损伤，从而失去受精能力；虽然用于冷冻的精液要求冷冻前活率达到0.8以上，但因不同公羊个体差异所产生的精子活力不同，精子冷冻效果很不稳定。同时，现有羊冷冻精液解冻后活率低于0.35且存在很多“衰老”精子和弱死精子，有效精子少，活力低，质量差。羊冷冻精液在我国辽宁、贵州有少量生产，2008年山西省岢岚县引进部分羊冷冻精液，人工授精后妊娠率不足30％，无法进行批量生产。

授权公告号为CN102657149B，发明名称为“一种超高活力羊细管精液冷冻方法”的中国专利中公开了其制备方法：“吸取羊新鲜精液注入装有清洗液的第一离心管底部，在CO₂培养箱中静置30-60min，高活力精子上游至上清液，吸取上清液，注入第二离心管中离心，离心管底部获得高浓度、高活力的精液；吸取该浓缩的高活力精液加入冷冻稀释液中，混合均匀后灌装细管，程序冷冻，液氮保存，输精前解冻”，羊细管冷冻精液冷冻前的活率为0.8以上，解冻后活率为0.45-0.60。但是这种方法冷冻过程繁琐，冷冻效率还有提升空间。

发明内容

针对这一问题，本发明提供一种山羊精液玻璃化冷冻方法，采用了玻璃化冷冻方法并优化了冷冻液的配方，通过于基础液中添加70％乙二醇、0.8mol/ml海藻糖、10％聚乙烯吡咯烷酮的玻璃化冷冻液进行保存，然后通过解冻液解冻，提高其解冻后的活率，具有冷冻过程简单易于操作，冷冻效果好的特点。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：

山羊精液的冷冻保存，包括冷冻配方的选择，选择合适的冷冻方法，选择合适的解冻配方及方法。具体如下：

山羊精液玻璃化冷冻配方，包括：1)基础液：含20mg/ml牛血清白蛋白的MEM培养基；2)平衡液：基础液添加20％乙二醇；3)玻璃化冷冻液：于基础液中添加70％乙二醇、0.8mol/ml海藻糖、10％聚乙烯吡咯烷酮。

山羊精液玻璃化冷冻的方法，包括如下步骤：

(1)用上述的山羊精液玻璃化冷冻配方——基础液、平衡液、玻璃化冷冻液在常温下平衡；

(2)按照常规方法获取羊精液，液化后进行CASA分析；

(3)将平衡液与等量的羊精液混合，平衡5～10分钟；

(4)将等量的玻璃化冷冻液加入到混合液中；

(5)立即将混入了玻璃化冷冻液的精液装入500μl冷冻脉管中；

(6)冷冻脉管投入液氮罐中保存；

(7)记录本次冷冻结果，保存位置等信息。

山羊精液玻璃化解冻配方，其特征在于，包括解冻液1(TS1)：基础液添加0.4mol/L海藻糖解冻；解冻液2(TS2)：基础液。

山羊精液玻璃化解冻方法，包括如下步骤：

(1)将权利要求3中的解冻液1和解冻液2常温下平衡；

(2)冷冻脉管从液氮中取出，于37度水浴60sec；

(3)剪去脉管塞一端，从管中吹出冷冻精液到TS1中，300g混匀离心，去上清；

(4)沉淀用TS2稀释到需要浓度，显微镜分析，备用。

具体步骤见图1。

有益效果：

减少程序冷冻时间，使冷冻过程简单化，便于在畜牧生产中过程中操作。

附图说明

本发明图1是山羊精液保存过程示意图。

具体实施方式

选择8月龄波杂山羊(公)作为试验对象，试验前对山羊精液进行常规分析，达到精液质量要求的进入实验，剔除精液质量较差的山羊。对其进行如下处理：

配备好山羊精液玻璃化冷冻配方，包括：1)基础液：含20mg/ml牛血清白蛋白的MEM培养基；2)平衡液：基础液添加20％乙二醇；3)玻璃化冷冻液：于基础液中添加70％乙二醇、0.8mol/ml海藻糖、10％聚乙烯吡咯烷酮。然后将上述的基础液、平衡液、玻璃化冷冻液在常温下平衡；按照常规方法获取羊精液，液化后进行CASA分析；将平衡液与等量的羊精液混合，平衡5分钟；将等量的玻璃化冷冻液加入到混合液中；立即将混入了玻璃化冷冻液的精液装入500μl冷冻脉管中；然后将冷冻脉管投入液氮罐中保存；记录本次冷冻结果，保存位置等信息。

在使用时对其进行解冻处理：

首先配制好山羊精液玻璃化解冻配方，包括解冻液1(TS1)：基础液添加0.4mol/L海藻糖解冻；解冻液2(TS2)：基础液，然后将解冻液1和解冻液2常温下平衡；再将冷冻脉管从液氮中取出，于37度水浴60sec；剪去脉管塞一端，从管中吹出冷冻精液到TS1中，300g混匀离心，去上清；沉淀用TS2稀释到需要浓度，冻后活力检查，精子图像计算机辅助分析仪进行活力的检查，重复检查两次结果取平均值。

本实验共采用10只山羊进行实验，玻璃化冷冻组(实验组)和常程序冷冻组(对照组)各5只，每只羊进行3次取精、冷冻，取平均值，其比较结果见表1。

表1玻璃化冷冻与程序冷冻对于山羊精液保存效果的影响

试验组与对照组在冷冻前精子活率差异不显著(p<0.5)，解冻后在精子活率、顶体完整率、情期受胎率三个衡量指标上，试验组与对照组差异不显著(p<0.5)。但试验组花时间少，使用方便。