一种提高鸡骨骼肌细胞氧化代谢能力的培养方法

摘要

本发明公开了一种提高鸡骨骼肌细胞氧化代谢能力的培养方法，属于生物技术领域。本发明所提供的方法是将经过分离、纯化的鸡骨骼肌成肌细胞和肌源成纤维细胞分别接种于Transwell培养皿的上室和下室，二者以1μm孔径的PET膜分开但共享添加有H

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高鸡骨骼肌细胞氧化代谢能力的培养方法，属于生物技术领域。

背景技术

骨骼肌的形成是一个连续的生理过程。胚胎期，骨骼肌成肌细胞增殖、分化、融合为初 级肌管并逐步成熟；出生后，肌纤维的数目虽然不再改变，但当肌肉组织受损时，静息的卫 星细胞被激活，进而分裂、融合形成新的肌管，骨骼肌得以再生。依靠现代细胞分离、培养 技术，研究人员能够利用胚胎成肌细胞或成体卫星细胞体外培养获得初级肌管。

动物的各种运动依赖于骨骼肌的收缩，而肌肉收缩所必需的能量均来源于ATP，骨骼肌 肌球蛋白Ca²⁺—ATPase通过控制横桥ATP的分解速率，从而影响肌肉的张力和收缩速度。 Peter等(Peter等，1972)根据肌球蛋白ATPase的活性把骨骼肌纤维分为3种类型：慢收缩氧 化型(I型)、快收缩氧化酵解型(IIa型)和快收缩酵解型(IIb型)：I型肌纤维的线粒体含量丰富， 有氧代谢酶活性高，主要通过有氧代谢获取能量，由于参与肌纤维收缩的ATPase的活性较低， I型肌纤维收缩慢但持久；IIb型肌纤维ATPase和无氧代谢酶的活性较高，线粒体含量较少且 有氧代谢酶的活性很低，主要依靠无氧代谢获取能量，因此IIb型肌纤维收缩快却不持久、 易疲劳；IIa型肌纤维ATPase含量居中，既可以利用有氧代谢供能，又可以依赖糖酵解供能。 肌肉纤维的类型不仅决定着肌肉的代谢及运动特征，还影响其色泽、嫩度、系水力等肉用品 质。目前，对肌肉纤维类型及其代谢机制的的研究涉及农业生产、医疗卫生、运动生理等众 多领域。

尽管骨骼肌的分类及其特征已经明确，但各类型肌纤维的先天形成机制仍不清楚，究其 原因是现有研究结果及手段尚不能解析骨骼肌代谢模式建立的遗传机制。然而越来越多的证 据表明，后天因素也可以影响骨骼肌纤维的构成类型，如神经支配、持久性运动训练、机械 性负重、激素水平改变、肥胖、糖尿病、衰老等生理、病理变化均会导致肌纤维由II型向I 型或者由I型向II型转变(Pette和Staron2001；Zierath和Hawley2004)。体内研究显示， 肌纤维类型的转化受到多条信号通路的共同调控，包括Ras/MAPK信号通路、腺苷酸激活的 蛋白激酶信号通路、PGC-lα/β通路、Myostatin和Wnt信号通路、CaN/NFAT信号通路等(Rockl 等，2007；Takeda等，2009；Hanke等，2011)。

尽管体内实验可以更好地模拟机体的生理状态，但也给相关机制的研究增加了复杂性。 因此建立高效、稳定的骨骼肌细胞分离、培养甚至定向诱导体系将为进一步阐述骨骼肌纤维 形成、转化机制及其能量代谢规律奠定基础。上述问题的阐述也将为畜牧生产中家畜肉质改 良、医疗上骨骼肌功能性再生、竞技体育中运动生理学的研究提供有益参考。

虽然目前研究人员利用胚胎成肌细胞或成体卫星细胞进行体外培养可以获得肌管，但所 得肌纤维类型随机性强，氧化代谢能力普遍较低。并且，现有技术大都借助基因工程手段进 行特定基因的干扰或过表达可以引起动物骨骼肌纤维类型或氧化代谢水平的改变(Semsarian 等，1999；Lin等，2003；Shinichiro等，2008)，尚未欠缺基于骨骼肌细胞非转基因的定向 诱导平台，为了进一步满足未来在医疗、畜牧业生产等领域应用的需要，骨骼肌细胞非转基 因定向诱导平台的建立更具有实际意义。

发明内容

本发明提供了一种提高鸡骨骼肌细胞氧化代谢能力的培养方法，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种提高鸡骨骼肌细胞氧化代谢能力的培养方法，是从鸡胚胎中 分离纯化鸡骨骼肌成肌细胞和肌源成纤维细胞，将成肌细胞接种于Transwell Insert的PET膜上 进行增殖培养，同时将肌源成纤维细胞经过传代培养后接种于Transwell Insert培养皿上培养， 再将经过增殖培养的成肌细胞转接入含有肌源成纤维细胞的Transwell Insert培养皿中，加入含 有H₂O₂的分化培养基进行分化培养。

所述方法的步骤如下：

1)成肌细胞和肌源成纤维细胞的分离纯化：从鸡胚胎中分离纯化骨骼肌成肌细胞和肌源 成纤维细胞；

2)成肌细胞的增殖培养：将步骤1)得到的成肌细胞接种到经过0.1％明胶处理的Transwell Insert的PET膜上，加入增殖培养基，获得增殖成肌细胞；

3)肌源成纤维细胞的培养：将步骤1)所得的肌源成纤维细胞进行3-5代传代纯化培养后， 接种到Transwell Insert培养皿内，37℃下培养1d后，去除培养基并用PBS清洗；

4)将步骤2)所得的增殖成肌细胞转接入步骤3)的Transwell Insert培养皿中，加入含有 H₂O₂的分化培养基，培养期间每隔24-48h半量换液，每隔8-12h，进行1次低温冲击刺激，分 化培养后获得骨骼肌的多核肌管。

步骤1)所述鸡胚胎为孵化11日龄的鸡胚胎。

步骤2)所述成肌细胞，接种密度为5000个/cm²，所述PET膜为1μm孔径的PET膜；所述 增殖培养，所用培养基为含有10％FBS、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素 的高糖DMEM培养基；所述增殖培养，培养温度为37℃，培养时间为3-4d，CO₂体积浓度为 5％。

步骤3)所述接种到Transwell Insert培养皿中37℃下培养1d，成纤维细胞接种密度为2000 个/cm²，所用培养基为含有10％FBS、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的高糖DMEM培养基。

步骤4)所述H₂O₂的浓度为20-80μM；所述分化培养基为含有2％马血清、2mML-谷氨酰 胺、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的高糖DMEM培养基；所述低温冲击刺激是指将培养物 置于16℃低温孵育15-60分钟；所述培养，培养温度为37℃，CO₂体积浓度为5％，培养时间为 7-10d。

所述H₂O₂的浓度优选60μM；所述16℃低温孵育，孵育时间优选30分钟。

所述方法的具体步骤如下：

1)成肌细胞和肌源成纤维细胞的分离纯化：从孵化11日龄的鸡胚胎中分离纯化骨骼肌成 肌细胞和肌源成纤维细胞；

2)成肌细胞的增殖培养：将步骤1)得到的成肌细胞以5000个/cm²的接种密度接种到经 过0.1％明胶处理的Transwell>2体积浓 度为5％的条件下培养3-4d，获得增殖成肌细胞；

3)肌源成纤维细胞的培养：将步骤1)所得的肌源成纤维细胞进行3-5代传代纯化培养后， 以2000个/cm²的接种密度接种到Transwell>

4)将步骤2)所得的增殖成肌细胞转接入步骤3)的Transwell Insert培养皿中，加入含有 60μM的H₂O₂、2％马血清、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的高糖DMEM 分化培养基，培养期间每隔24-48h半量换液，每隔8-12h，将培养物置于16℃低温孵育30分钟， 在37℃，CO₂体积浓度5％下，培养7-10d后获得骨骼肌的多核肌管。

所述方法用于制备高氧化代谢能力的鸡骨骼肌细胞。

本发明有益效果：

肌肉形成过程中，成肌细胞的细胞外基质中存在着大量的成纤维细胞，它们不仅为成肌 提供了可以附着的骨架结构，还通过分泌多种细胞因子调控整个成肌过程，包括抑制成肌细 胞凋亡、促进肌管成熟等。本发明采用了1um孔径PET膜的Transwell细胞培养系统，一方 面可以有效地将骨骼肌细胞和肌源成纤维细胞分开，保证了研究对象的纯度；另一方面提供 了二者旁分泌互作的培养条件，模拟了体内发育过程中的成肌微环境。本发明所使用的成肌 分化培养基中添加了低浓度的H₂O₂。研究表明，低水平H₂O₂可以提高成肌细胞线粒体呼吸 功能，使线粒体ROS保持在一个适宜水平，发挥其促进线粒体重构和成肌分化的效应；高水 平H₂O₂则对细胞有氧化杀伤作用。所以本发明提供的H₂O₂浓度是根据鸡骨骼肌成肌细胞体 外分化效果优化所得，具有针对性强、安全性高的特点。另外，成肌分化培养期间，定期施 以低温冲击刺激，从而达到通过温度应激促进骨骼肌细胞代偿性地提高其氧化代谢水平的目 的。

本发明提供的培养方法在模拟动物体内成肌微环境的基础上，补充了提高骨骼肌细胞氧 化代谢能力的物理及化学激动因素，检测结果显示，本发明提高了鸡骨骼肌细胞的线粒体含 量及跨膜电位，提高了有氧代谢标志酶——琥珀酸脱氢酶的活性，同时降低了肌细胞无氧应 激调节酶——ATPase的活性。本方法所用均为商品化的耗材及试剂，且培养周期短、效果稳 定，为研究鸡骨骼肌能量代谢规律、纤维类型形成及转化机制等奠定了基础，具有良好的研 究及应用价值。

附图说明

图1为进行成肌分化培养时，Transwell培养皿内各组分的分布示意图；

(1，Transwell insert；2，成肌细胞；3，PET膜；4，肌源成纤维细胞；5，上室；6，下室)。 图2为对分化培养3天后的成肌细胞进行Rhodamine123染色的结果；

(放大倍数：200×，其中A、B为明视野；A’、B’为Rhodamine123的线粒体染色；A’’、B’’ 为Hochest33342的细胞核染色)。

图3为对分化培养10天后形成的肌管进行Rhodamine123染色的结果；

(方法倍数：200×，其中A、B为明视野；A’、B’为Rhodamine123的线粒体染色；A’’、B’’ 为Hochest33342的细胞核染色)。

图4为对分化培养10天后形成的肌管进行琥珀酸脱氢酶NBT法检测的结果；

(放大倍数：400×，其中A为对照组；B为实验组)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

下述实施例中试验方法若无特别说明，均为常规操作方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1鸡骨骼肌成肌细胞的分离、纯化及增殖培养

1.鸡骨骼肌成肌细胞的分离及纯化

新鲜的种鸡蛋于38℃，63％湿度的孵化箱内孵化11天。蛋壳经70％的乙醇消毒后，破壳 取出鸡胚至于培养皿中(若鸡胚已死则弃用以防污染)。用镊子将鸡胚胸部皮肤拨开，分离胸 大肌，并在解剖镜下去除韧带、结缔组织及血管。Hank's液清洗胸肌组织3次，充分剪碎后 加入0.1％的胶原酶I于37℃孵育30分钟，期间吹打若干次。离心，加入Hank's吹散细胞后， 用200目的不锈钢滤网过滤细胞以获得单细胞悬液。

配制20％、27.5％和40％的Percoll溶液，将其按浓度由高向低依次加入15ml离心管内(动 作要轻缓)，然后将细胞悬液缓慢铺在20％Percoll液面上。1500g、4℃水平离心8分钟，小 心收集27.5％/40％液面交界处的细胞，用含有10％FBS、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、 100ug/ml链霉素、高糖DMEM的成肌增殖培养基重悬细胞并接种于培养皿，于37℃培养2 小时后收集未贴壁的成肌细胞(通过2小时差速贴壁消除残存的成纤维细胞和内皮细胞，获 得较纯净的成肌细胞)。

2.鸡骨骼肌成肌细胞的增殖培养

为了避免培养过程中成肌细胞和成纤维细胞的物理接触，同时发挥肌源成纤维细胞的促 成肌作用，本实例采用了1um孔径PET膜的Transwell细胞培养系统。其中成肌细胞增殖培 养的操作步骤包括：将纯化的鸡骨骼肌成肌细胞(步骤1)接种于0.1％明胶处理的Transwell Insert的PET膜上，接种密度为5000个细胞/cm²；37℃培养1天后换液，加入含有10％FBS、 2mM>

实施例2鸡骨骼肌肌源成纤维细胞的分离及培养

新鲜的种鸡蛋于38℃，63％湿度的孵化箱内孵化11天。蛋壳经70％的乙醇消毒后，破壳 取出鸡胚至于培养皿中(若鸡胚已死则弃用以防污染)。用镊子将鸡胚胸部皮肤拨开，分离胸 大肌，并在解剖镜下去除韧带、结缔组织及血管。Hank's液清洗胸肌组织3次，充分剪碎后 加入0.1％的胶原酶I于37℃孵育30分钟，期间吹打若干次。离心，加入Hank's吹散细胞后， 用200目的不锈钢滤网过滤细胞以获得单细胞悬液。细胞接种于培养皿，于37℃培养2小时 后收集贴壁细胞，经3-5代纯化培养后备用。

培养鸡骨骼肌成纤维细胞所用的培养基为含有10％FBS、100U/ml青霉素、100ug/ml链 霉素的高糖DMEM。

实施例3鸡骨骼肌成肌细胞的分化培养

为了避免培养过程中成肌细胞和成纤维细胞的物理接触，同时发挥肌源成纤维细胞的促 成肌作用，本实施例采用了1um孔径PET膜的Transwell细胞培养系统。其中成肌细胞分化 培养的操作步骤包括：以2000个细胞/cm²的密度将经过3-5次传代的肌源成纤维细胞(实施 例2)接种于Transwell培养皿内，培养基为含有10％FBS、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉 素的高糖DMEM；37℃培养1天后，去除上述培养基并用PBS清洗3次；将接种了鸡骨骼肌 成肌细胞的Transwell>2O₂的成肌分化培养基，其中成肌分化培养基由含有2％马血 清、2mM>2O₂于使用 前现加入，此时Transwell培养皿内各组分的分布如图1所示；将培养物置于37℃培养箱培 养，7-10天可见多核肌管形成。

成肌细胞分化培养期间：每隔48小时半量更换培养基，其中培养基为含有60umol/L H₂O₂的成肌分化培养基(成肌分化培养基由含有2％马血清、2mM>2O₂于使用前现加入)；每隔8小时将培养物置于 16℃无菌冷柜低温孵育30分钟。

针对培养效果的下述检测，将经过上述操作的培养组设为实验组；对照组中，Transwell 培养皿内不接种细胞，培养基为成肌分化培养基(含有2％马血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml 青霉素、100ug/ml链霉素的高糖DMEM)，每隔48小时半量更换培养基。

实施例4鸡骨骼肌细胞氧化代谢能力的检测

肌细胞的有氧代谢过程依赖于线粒体呼吸链提供能量，氧化代谢能力强的肌细胞线粒体 含量丰富且跨膜电位高，同时有氧代谢酶含量高，而对无氧应激起重要调控作用的ATPase 的活性较低。

1.鸡骨骼肌细胞线粒体含量及跨膜电位检测

Rhodamine123是一种可以透过细胞膜的染色活细胞线粒体的特异性染料，被广泛用作检 测线粒体跨膜电位。本实例中，Rhodamine123染色被用于检测骨骼肌细胞的线粒体含量及其 跨膜电位。

分别在成肌细胞分化培养3天和分化培养10天(实施例3)后去除培养液，将Transwell Insert用PBS清洗3次，培养皿中加入2uM Rhodamine123工作液并于室温下避光孵育30分 钟；PBS清洗3次后进行Hoechst33342细胞核染色；PBS清洗3次，取下Transwell Insert底 部的PET膜滴加适量防荧光淬灭剂，封片于载玻片上并于显微镜下观察、拍照。

染色结果显示，实验组的骨骼肌细胞，无论是分化培养3天后尚未融合的单个成肌细胞 (图2。其中A、B为明视野；A’、B’为Rhodamine123的线粒体染色；A’’、B’’为Hochest33342 的细胞核染色)，还是分化培养10天后形成的初级肌管(图3。其中A、B为明视野；A’、 B’为Rhodamine123的线粒体染色；A’’、B’’为Hochest33342的细胞核染色)，其Rhodamine123 的含量及荧光强度均显著高于对照组，其差异在分化后期的肌管中尤为明显。该结果表明， 本实例采用的培养方法可以提高鸡骨骼肌成肌细胞及所形成肌管的线粒体含量及跨膜电位， 并且随着成肌分化其效果更为突出。

2.鸡骨骼肌细胞琥珀酸脱氢酶活性检测

琥珀酸脱氢酶存在于有氧呼吸的细胞中，它定位于线粒体内膜，直接与呼吸链相联系， 其表达水平是反映细胞氧化代谢能力的重要指征之一。本实例将采用NBT染色法检测骨骼肌 细胞的琥珀酸脱氢酶活性。

首先配置孵育液：取0.2M磷酸缓冲液(PH7.6)2.5mL、0.2M琥珀酸钠溶液2.5mL、0.1％ 的NBT溶液5mL，混合后备用；将鸡骨骼肌成肌细胞分化培养10天(实施例3)后去除培 养液，将Transwell Insert用PBS清洗3次后置于装有孵育液的培养皿中37℃避光孵育40分 钟；蒸馏水充分清洗后，取下Transwell Insert底部的PET膜滴加树脂封片于载玻片，立即置 于显微镜下观察。其中琥珀酸脱氢酶活性部位可见深蓝色沉淀。

染色结果显示，与对照组相比，实验组肌管中的琥珀酸脱氢酶深染颗粒数增多(图4。其 中A为对照组；B为实验组)。采用IMAGE-J图像分析软件分析肌管中琥珀酸脱氢酶平均积 分光密度值，实验组为473.96±107.22(n＝6)，对照组为243.52±77.18(n＝6)，实验组琥珀酸 脱氢酶平均积分光密度值显著高于对照组(P<0.05)。可见本实例采用的培养方法可以提高鸡 骨骼肌肌管的琥珀酸脱氢酶活性。

3.鸡骨骼肌细胞ATPase活性检测

肌球蛋白Ca²⁺—ATPase通过分解ATP为肌肉收缩提供能量，无氧代谢类型的肌细胞的 Ca²⁺—ATPase含量高、活性强。本实例将采用比色法检测鸡骨骼肌细胞的ATPase活性。

成肌细胞分化培养7天和10天(实施例3)后去除培养液，将Transwell Insert用PBS 清洗3次后收集细胞。采用比色法检测ATPase活性的操作步骤参照南京建成生物工程研究所 的超微量Ca-ATP酶测定试剂盒(货号：A070-4)的说明书进行，其中比色测定波长为636nm。

检测结果如表1所示，分化培养7天，实验组的ATPase活性低于对照组，但差异不显著； 分化培养10天，实验组的ATPase活性为0.45±0.10，显著低于对照组0.91±0.20(P<0.05)。 可见本实例采用的培养方法抑制了鸡骨骼肌细胞ATPase活性，并且随着成肌分化其效果更为 突出。

表1对照组和实验组对鸡骨骼肌细胞ATPase活性的影响

注：同一时间点，标注不同字母表示差异显著(n＝6，P<0.05)

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的 人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应 该以权利要求书所界定的为准。