硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制备抗动物病毒药物中的应用

摘要

本发明属于兽药应用技术领域，涉及硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制备抗动物病毒药物中的应用，尤其涉及在制备抗猪流感病毒、猪蓝耳病病毒以及猪伪狂犬病毒药物的应用。本发明所述药物抗病毒谱广，有效率高，安全无毒副作用，无残留，且能够减少或替代抗生素使用，属于新型抗病毒药物，具有良好应用开发前景。

说明书

技术领域

本发明属于兽药应用技术领域，涉及硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制备抗动物病毒药物中的应用，尤其涉及在制备抗猪流感病毒、猪蓝耳病病毒以及猪伪狂犬病毒药物的应用。

背景技术

随着集约化、规模化养殖业的迅速发展，动物疾病发病率越来越高，尤其是病毒性疾病发病率日益升高，给养殖业带来了巨大经济损失。尽管疫苗免疫在一定程度上能够预防此类疾病的发生，但由于病原菌日益加快的变异速度和新型超级病原微生物的出现，往往使已研制出的疫苗在预防上效果不佳或是研制出的疫苗跟不上病原菌变异的速度，产生生产与应用间的脱节。抗生素类药物虽然能够显著抑制或杀灭病原微生物，但抗生素长期不科学使用，使病原菌产生耐药性，同时其在畜产品中产生的严重药物残留容易产生抗药性，对畜禽疫病的防治和人类的健康产生不良影响。因此，开发新型的绿色安全无公害，无毒副作用，无药物残留，无耐药性的抗生素替代品已成为当前畜牧兽医科学家研究的热点。

近年来，酵母β-葡聚糖作为一种抗生素替代品越来越受到人们的关注，它具有增强免疫活力、抗肿瘤活性、降低胆固醇和血脂等多种生理功能。研究报道通过化学修饰的方法可以提高其功效，其中经硫酸化修饰后，会使其具有或加强抗病毒活性。相关文献报道某些多糖对疱疹病毒、艾滋病病毒等病毒具有良好的抑制作用，且具有活性的多糖主要成分为硫酸多糖。经人工硫酸酯化修饰可使原来不含有硫酸根或硫酸根含量低的多糖表现出较强的抗病毒活性。如作为抗肿瘤辅助治疗制剂的香菇多糖本身不具抗HIV活性，硫酸酯化修饰后则具有显著的抗HIV活性。另外，酵母葡聚糖属食品添加剂，已广泛应用食品加工，无任何残留，因此，研究硫酸酯化酵母β-葡聚糖潜在的抗病毒活性，提高生物利用度，拓宽新剂型临床应用范围，是未来新型抗生素替代品研究的重要发展方向。

猪流感病毒（Swine influenza virus）是一种可引起猪急性、群发性呼吸道传染病病原，该病临床以突发、高热、咳嗽、呼吸困难为特征。目前，临床上流行血清型包括H1N1、H3N2及H1N2等，2009年甲型流感主要为H1N1血清型，该病不仅给养猪业带来巨大危害，更造成了公共卫生安全事件。目前，对于该病的防治，国内尚未有商品化疫苗，临床应用主要采用常规抗病毒药物，但是这些常规的抗病毒药物普遍存在病毒突变产生抗药性，体内的低效率和毒副作用等问题。抗病毒疗效十分不理想。因此寻找和开发新的抗病毒制剂成为人们所关注的问题。

猪蓝耳病病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的俗称，可引起猪发热、厌食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎，各种年龄猪（特别是仔猪）呼吸障碍为特征的高度传染性疾病。患病猪和带毒猪是本病的重要传染源。该病主要传播途径是接触感染、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。易感猪可经口、鼻腔、肌肉、腹腔、静脉及子宫内接种等多种途径而感染病毒，猪感染病毒后2～14周均可通过接触将病毒传播给其他易感猪。持续性感染是猪蓝耳病流行病学的重要特征，住蓝耳病毒可在感染猪体内存在很长时间，长期危害养猪生产，给养猪业造成巨大的经济损失。

猪伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）可引起多种动物共患的急性病毒性传染病。本病的特点是侵害猪的中枢神经系统和引起猪的皮肤瘙痒。对2周龄以内仔猪致死率可达100％。成年猪多为隐性感染，也可出现发热、精神沉郁症状，有些猪呕吐、咳嗽。新生仔猪、哺乳仔猪发病症状明显，病猪高热、呕吐、食欲废绝、呼吸急促，有神经症状，兴奋，叫声嘶哑，无目的前进或转圈，继而出现肌肉痉挛、四肢麻痹，卧地、四肢做游泳状态运动。妊娠母猪可出现流产，产木乃伊胎、死胎、弱胎。公猪感染后可出现睾丸肿胀或萎缩，丧失种用能力，母猪感染后可出现不育症，严重影响种猪场生产及优良品种的推广，给养猪业造成极大的损失。

发明内容

本发明公开了硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制备抗动物病毒药物中的应用。

具体包括：

硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制备抗H1N1猪流感病毒药物中的应用；其中所用硫酸酯化酵母β-葡聚糖IC50为1.72mg/ml。

硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制备抗猪蓝耳病毒药物中的应用；其中所用硫酸酯化酵母β-葡聚糖IC50为0.62mg/ml。

硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制备抗猪伪狂犬病毒药物中的应用；其中所用硫酸酯化酵母β-葡聚糖IC50为2.03 mg/ml。

典型例子为：配制10mg/ml的硫酸酯化酵母β-葡聚糖药物制剂溶液，它是将1g硫酸酯化酵母β-葡聚糖，溶解在100ml注射溶水，115℃，20min。

另一个典型例子为：配制5mg/ml的硫酸酯化酵母β-葡聚糖药物制剂溶液，方法如下：称取0.5g硫酸酯化酵母β-葡聚糖，溶解在100ml注射溶水，115℃，20min。

本发明人曾在第三届京津冀畜牧兽医科技创新研讨会公开过硫酸酯化酵母β-葡聚糖对小鼠抗H1N1猪流感病毒感染研究思路，本次会议征集论文主题为“新思想、新方法、新观点”。本论文主要说明的是硫酸酯化酵母β-葡聚糖具有潜在的抗病毒作用这个思路，但尚未公开任何试验数据，并不能支持该观点成立与否，且这部分研究为体内抗病毒，与本发明申请体外抗病毒研究相互补充，且具有相对独立性。

为更加准确的确定本发明的应用效果，本发明人进行了如下的试验：

试验一： 

硫酸酯化酵母β-葡聚糖抗H1N1猪流感病毒的药效研究

1 材料和方法　

1.1 毒株  猪流感病毒H1N1株由本实验室分离鉴定。

1.2 鸡胚  9-11日龄鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.3药物  硫酸酯化酵母β-葡聚糖，本实验室前期制备，并已发表相关文章（苯酚-硫酸法测定硫酸酯化酵母葡聚糖含量，动物医学进展，2011,9）。金刚烷胺购自沈阳康芝制药有限公司。

2 试验方法

2.1 药物准备

    配制50mg/ml的硫酸酯化酵母β-葡聚糖药物制剂溶液，同时配制5mg/ml金刚烷胺药物制剂溶液。按照2倍比例逐次稀释，高压灭菌，制备一系列不同浓度药物。

2.2药物对鸡胚毒性试验

将不同稀释度试药物接种鸡胚尿囊腔，0.5ml/胚，作5个重复，同时设生理盐水空白对照。置37℃恒温箱孵育，每天观察鸡胚死亡或发育情况，弃掉24小时内死亡的鸡胚。

2.3 药物在鸡胚内抗猪流感病毒的试验

先后将不同稀释度药物与等量100EID50病毒液注入鸡胚后，0.2mL/枚，作5个重复。同时设立病毒阳性对照和生理盐水阴性对照。37℃恒温培养，连续3天观察鸡胚存活情况，然后置于4℃冰箱过夜，次日收取胚蛋尿囊腔液，测定鸡胚尿囊液的血凝（HA）效价。

结果与分析

3.1药物对鸡胚毒性试验结果　

    在实验过程中，当硫酸酯化酵母β-葡聚糖药物用量达15mg/胚时，鸡胚出现致死现象。发明药物半数致死量LD50为40.23mg/胚。而对照药物金刚烷胺半数致死量LD50为19.78mg/胚。在给药剂量小于10mg/胚时，未见药物对鸡胚发育产生不良影响。在雏鸡整个发育过程中，未见异常现象。结果表明，硫酸酯化酵母β-葡聚糖鸡胚发育毒性极低。

3.2药物在鸡胚内抗猪流感病毒的试验结果

由表1、表2可以看出，在样品浓度达1.72mg/胚时，病毒抑制率可达50%以上。硫酸酯化酵母β-葡聚糖抗H1N1猪流感病毒的药效优于金刚烷胺，且毒性极低，其治疗指数TI明显高于金刚烷胺。

表1 硫酸酯化酵母β-葡聚糖抗H1N1猪流感病毒的实验结果

组别用量（mg/胚）病毒抑制率（%）12010021098.73584.342.572.151.2542.5

表2 硫酸酯化酵母β-葡聚糖和金刚烷胺抗H1N1猪流感病毒药效对比

 LD50IC50TI对照组19.785.743.45本发明40.231.7223.39

    注：TI值大于1为有效，数值越大，安全范围越大。

试验二： 

硫酸酯化酵母β-葡聚糖抗猪蓝耳病毒的药效研究

1 材料和方法

1.1 细胞和毒株 

    Mark-145细胞购自上海复祥生物科技有限公司； 猪蓝耳病毒由天津市畜牧兽医研究所猪病研究室分离鉴定并保存。

1.2 药物和试剂

    硫酸酯化酵母β-葡聚糖由天津市畜牧兽医研究所猪病研究室前期制备。阳性

对照药物利巴韦林（100 mg/ml）为天津药业焦作有限公司产品，使用浓度10 mg/ml备用。

1.3 药物细胞毒性试验

96孔板中，加入Mark-145细胞，100μL/孔，于37℃、5% CO₂培养箱中培养至单层细胞。用维持液将药物及利巴韦林对倍稀释，加入培养板中，100μL/孔，重复6孔，同时空白对照，5% CO₂培养48 h后，弃培养液上清，加入含5 mg/ml MTT溶液 50μL/孔，继续培养2~3 h后，弃上清，PBS洗3次，加入MDSO 150μL/孔，振荡5~10 min，待结晶完全溶解，测OD值。计算细胞存活率。

细胞存活率% =实验组OD值 /细胞对照组OD值×100%。

采用SPSS 软件的Probit回归法计算药物最大无毒浓度（TC0）和半数毒性浓度（TC50）。

1.4 药物抗蓝耳病毒作用试验 

取已长成单层Mark-145细胞培养板，加入100 TCID₅₀ PRRSV-VR2332病毒吸附 2 h后，吸弃病毒液，然后加入最大无毒浓度以下，对倍稀释药物，设阳性药物对照组、正常细胞对照组和病毒对照组。置37℃、5% CO₂培养箱中培养48 h，MTT法测OD值。采用SPSS软件Probit回归法计算硫酸酯化酵母β-葡聚糖半数抑制浓度（IC50）和治疗指数（TI）。

结果与分析

2.1 药物对细胞的毒性测定

药物对细胞毒性作用主要表现为细胞折光性增加、变圆、粘连、破碎、脱落、死亡、吸光值明显下降。随着药液浓度的升高，对细胞毒性越大，存活细胞越少，MTT被活细胞线粒体脱氢酶还原成蓝色甲簪结晶越少，OD值越小，细胞存活率越低。由表3可以看出，通过MTT法检测硫酸酯化酵母β-葡聚糖的最大无毒浓度（TC0）为4.86mg/ml，以及半数毒性浓度（TC50）为12.38mg/ml。

表3　药物对Mark-145细胞的TC0和TC50（mg/ml）

药物TC0TC50硫酸酯化酵母β-葡聚糖4.8612.38利巴韦林0.38 2.14

2.3 药物的半数抑制浓度及治疗指数

    治疗指数（TI）是评价药物对病毒抑制效力重要指标之一，根据MTT试验结果，采用SPSS 软件的Probit回归法，计算硫酸酯化酵母β-葡聚糖的半数抑制浓度（IC50）为0.62mg/ml，其治疗指数（TI）为19.97，充分说明药物抗蓝耳病毒的有效性及安全性。

表4　硫酸酯化酵母β-葡聚糖IC50及TI数值

药物 IC50TI硫酸酯化酵母β-葡聚糖0.6219.97利巴韦林0.0730.57

注：TI值大于1为有效，数值越大，安全范围越大。

试验三： 

硫酸酯化酵母β-葡聚糖抗猪伪狂犬病毒的药效研究

1 材料和方法

1.1 细胞和毒株 

    PK15细胞购自上海复祥生物科技有限公司； 猪伪狂犬病毒由天津市畜牧兽医研究所猪病研究室分离鉴定并保存，对外可提供。

1.2 药物和试剂

    硫酸酯化酵母β-葡聚糖由天津市畜牧兽医研究所猪病研究室前期制备。阳性

对照药阿昔洛韦注射剂购自湖北科益药业有限公司。

1.3 药物细胞毒性试验

除培养细胞更换为PK15细胞外，其他具体实验步骤参考试验一药物细胞毒性试验部分，同样方法计算药物最大无毒浓度（TC0）和半数毒性浓度（TC50）。

1.4 药物抗猪伪狂犬病毒作用试验 

除培养细胞更换为PK15细胞外，其他具体实验步骤参考试验一药物抗病毒试验部分，同样方法计算硫酸酯化酵母β-葡聚糖半数抑制浓度（IC50）和治疗指数（TI）。

结果与分析

2.1 药物对细胞的毒性测定

   药物对PK-15细胞毒性作用表现为折光性增加，壁厚，变小变圆，破碎，脱落。由表5可以看出，通过MTT法检测硫酸酯化酵母β-葡聚糖的最大无毒浓度（TC0）为6.84mg/ml，以及半数毒性浓度（TC50）为14.35mg/ml。

表5　药物对Mark-145细胞的TC0和TC50（mg/ml）

药物TC0TC50硫酸酯化酵母β-葡聚糖6.8414.35阿昔洛韦13.7879.32

2.3 药物的半数抑制浓度及治疗指数

   治疗指数（TI）是评价药物对病毒抑制效力重要指标之一，根据MTT试验结果，采用SPSS 软件的Probit回归法，计算硫酸酯化酵母β-葡聚糖的半数抑制浓度（IC50）为2.03mg/ml，其治疗指数（TI）为7.06，表明该药物具有良好的抗猪伪狂犬病毒效果。

表6　硫酸酯化酵母β-葡聚糖IC50及TI数值

药物 IC50TI硫酸酯化酵母β-葡聚糖2.037.06阿昔洛韦6.911.49

注：TI值大于1为有效，数值越大，安全范围越大。

具体实施方式

为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法作以详细的说明，在此需加以说明的是：本发明所用到的试剂均有市售。硫酸酯化酵母β-葡聚糖由天津市畜牧兽医研究所猪病研究室前期制备.

参考实施例1

硫酸酯化酵母β-葡聚糖的制备：(参考文件见苯酚-硫酸法测定硫酸酯化酵母葡聚糖含量，动物医学进展，2011,9）

实施例2

配制10mg/ml的硫酸酯化酵母β-葡聚糖药物制剂溶液，方法如下：称取1g硫酸酯化酵母β-葡聚糖，溶解在100ml注射溶水，115℃，20min。

实施例3

    配制5mg/ml的硫酸酯化酵母β-葡聚糖药物制剂溶液，方法如下：称取0.5g硫酸酯化酵母β-葡聚糖，溶解在100ml注射溶水，115℃，20min。