一种红法夫酵母菌中虾青素分离纯化的方法

摘要

一种红法夫酵母菌中虾青素分离纯化的方法，涉及虾青素。1)红法夫酵母菌的菌体细胞经洗涤，除去发酵液中残余的油脂等杂质，菌体冷冻干燥，通过二甲亚砜有机溶剂破壁，无水乙醇避光萃取，离心除去菌体碎片，得到虾青素乙醇粗提液；2)在虾青素乙醇粗提液中加入正己烷和去离子水，正己烷-乙醇-水三元系统经过恒温震荡混合，离心后分为两层，弃下层无水乙醇-水相，收集上层正己烷有机相，虾青素被萃取至上层正己烷有机相中，得到虾青素正己烷萃取液；3)将虾青素正己烷萃取液上样至硅胶柱层析中，洗脱液梯度洗脱，收集虾青素条带洗脱液，经高效液相色谱检测样品纯度，氢谱核磁共振仪鉴定样品结构。纯度大于99％、回收率大于60％。

说明书

技术领域

本发明涉及虾青素，尤其是涉及一种红法夫酵母菌中虾青素分离纯化的方法。 

背景技术

虾青素，学名为3,3’-二羟基-β,β’-胡萝卜素-4,4’-二酮，分子式C₄₀H₅₂O₄，相对分子质量596.86，是一种非维生素A原的类胡萝卜素、萜烯类不饱和化合物，其结构式如下所示： 

虾青素呈艳丽的红色，具有极强的色素沉积能力(Shoji Y,Yoshito T,Muneo S,et al.Aquaculture,1990,87(3):323-330.)；虾青素是一类断链抗氧化剂，能向自由基提供电子或与自由基进行反应，吸收自由基多余的能量，使之变为非活性的或较稳定的化合物，中断自由基的氧化反应过程，具有较强的抗氧化性能(Kurashige M,Okimasu E,Inoue M,et al.Physiol.Chem.Phys.Med.NMR.,1990,22:27-38.)；同时，虾青素能明显增强机体局部和全身的免疫能力，抵抗机体炎症，免疫调节特性与抗氧化性相结合，在防止疾病的发生与传播中发挥重要作用(Jyonouchi H,Gross M,Tomita Y.Nutr.Cancer.,1994,21:47-58.)；虾青素对癌细胞增殖有较强的抑制作用，高浓度的虾青素能杀伤肿瘤细胞，降低某些致癌物诱导的癌症发生率(Roger et al.Biotechnology Bioengineering,2010,9(20):245-257.)。 

目前，虾青素已成为国内外研究的热点。虾青素的独特性质使它具有较高的应用价值，其在食品添加剂、化妆品、保健品、水产养殖和医药等诸多领域具有很大的潜力，开发应用前景广阔，发达国家需求量日益增加。许多公司生产的虾青素产品安全性已经得到了美国FDA的GRAS认证、欧盟新资源食品认证、清真犹太Kosher认证、中国卫生部新资源食品认证。 目前生产雨生红球藻来源天然虾青素的有5个国家的7家公司：美国Cyanotech公司(占据了全球食品级虾青素市场份额的70％以上)、日本FUJI化学集团(控制瑞典、夏威夷两家工厂)、YAMAHA集团、Biogenic公司、中国荆州市天然虾青素有限公司、印度Bioprex公司、以色列Algatech公司，我国厦门汇盛生物科技有限公司有生产小批量红发夫来源的天然虾青素。 

天然虾青素一般有如下来源：虾壳等水产品加工废弃物、雨生红球藻等藻类、乳酸分支杆菌等细菌、红法夫酵母。以甲壳加工的下脚料为原料提取虾青素是生产的主要途径之一，国内外在这方面均有大量的研究，且主要采用以下三种提取方法：碱提法、有机溶剂萃取法和超临界CO₂萃取法。其中，关于天然虾青素分离纯化的专利报道主要有：中国专利101691348从雨生红球藻中超临界提取虾青素的方法，利用超临界CO₂萃取工艺提取虾青素。中国专利102106448A将虾蟹壳烘干后，用醋酸浸取、用蛋白酶除去蛋白质、乙醇溶解、盐酸沉降得到质量分数为5-15％的虾青素。中国专利1534020将酵母与提取溶媒按比例混合后进行负压空化混旋固液萃取，减压浓缩后，再经负压柱层析和正压柱层析纯化得98％成品。中国专利1548420将红法夫酵母湿菌体与含抗氧化剂的有机酸或酸性有机溶剂搅拌混合提取虾青素，从酵母泥到虾青素浓缩液的总提取收率达到80％以上。中国专利CN1534020在加热和搅拌的条件下采用低浓度乙醇溶液在加热条件下滤除去对鱼水溶性化合物，再用二氯甲烷与已烷组成的混合溶剂进行萃取，经蒸馏后得到含虾青素约7％左右的虾青素浸膏产品。这些专利提到的技术，有的因为高压、减压、低温技术而大大增加分离纯化的成本，有些因为采用酸热、使用易残留有机溶剂而降低了虾青素的活性。本申请人在中国专利CN101838614A中公开一种虾青素生产菌株及其诱变筛选方法与应用，涉及一种微生物菌株及其获取方法。所述一种虾青素生产菌株为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)的诱变菌株N1806-04。以红法夫酵母为出发菌株，采用酶法制备红法夫酵母原生质体，再通过NTG诱变及β-紫罗酮筛选等方法进行虾青素生产菌株的选育，获得虾青素生产菌株，连续传代5次后虾青素的产量稳定。将该虾青素生产菌株用发酵罐放大培养，其虾青素产量和含量分别可达500～600mg/L和5000～6300mg/kg(细胞干重)，生物量可达80～110g/L。虾青素产量和含量以及对应的生物量都满足了工业化生产的要求，具有很大的应用前景。 

虾青素生产菌株为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)的诱变菌株N1806-04，该菌株已于2009年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.3045。 

发明内容

本发明的目的是提供操作简便、高效，适用于大规模工业生产，获得的虾青素纯度高，具生理活性的一种红法夫酵母菌中虾青素分离纯化的方法。 

所述红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)的诱变菌株N1806-04，该菌株已于2009年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.3045。 

本发明包括以下步骤： 

1)红法夫酵母菌的菌体细胞经洗涤，除去发酵液中残余的油脂等杂质，菌体冷冻干燥，通过二甲亚砜有机溶剂破壁，无水乙醇避光萃取，离心除去菌体碎片，得到虾青素乙醇粗提液； 

2)在虾青素乙醇粗提液中加入正己烷和去离子水，正己烷-乙醇-水三元系统经过恒温震荡混合，离心后分为两层，弃下层无水乙醇-水相，收集上层正己烷有机相，虾青素被萃取至上层正己烷有机相中，得到虾青素正己烷萃取液； 

3)将虾青素正己烷萃取液上样至硅胶柱层析中，洗脱液梯度洗脱，收集虾青素条带洗脱液，经高效液相色谱检测样品纯度，氢谱核磁共振仪鉴定样品结构。 

在步骤1)中，所述洗涤可采用去离子水与工业酒精交替重复洗涤；洗涤的方法可为：清洗胞外残余物的溶剂为去离子水、无水乙醇，玻璃棒搅拌至菌体细胞分散后，用超声震荡清洗3次以上，至离心后菌体细胞上无白色杂垢即可，以保证之后乙醇萃取液中不带入发酵液中附着在菌体细胞上的油脂及其他杂质；洗涤时菌体在转速为800～2000r/min下离心5～10min；所述破壁用有机溶剂二甲亚砜需提前水浴加热至50～55℃，加入菌体后也需恒温在此温度范围内，采用锡箔纸避光破壁20～30min；所述无水乙醇避光萃取后，在转速为3000～5000r/min下离心3～5min，除去菌体碎片。 

在步骤2)中，正己烷-乙醇-水三元系统中，正己烷与虾青素乙醇粗提液的体积比可为(0.5～1.0)∶1，水与虾青素乙醇粗提液的体积比可为(1～2)∶1；所述震荡的条件可为在25～30℃下以200r/min的转速振荡15～30min；所述离心的速率可为800～1000r/min，离心的时间可为5～10min。 

在步骤3)中，所述硅胶柱层析的硅胶粒径可为100～200目，硅胶柱层析的方法可为：在重力场作用下常压层析，采用正己烷湿法装柱，层析柱的规格：柱长度150～200mm，直径19～25mm，上样量：0.2～0.5mg/mL；所述洗脱的流速可为1～5mL/min；所述洗脱液可采用正己烷与丙酮采用不同配比的洗脱梯度，采用阶段性梯度洗脱方式：采用体积比为正己 烷∶丙酮＝95∶5的洗脱液洗脱第一、第二、第三杂质条带；体积比为正己烷∶丙酮＝90∶10的洗脱液洗脱第四条带，即回收虾青素条带；配制体积比为正己烷∶丙酮＝85∶15的洗脱液洗脱第五杂质条带；配制体积比为正己烷∶丙酮＝80∶20的洗脱液冲洗硅胶柱，后用100％正己烷冲洗再生硅胶柱；所述高效液相色谱检测中，可采用型号为Eclipse XDB-C18(φ4.6mm×150mm，5μm)的色谱柱，流动相为100％甲醇(色谱纯)，洗柱剂：100％乙腈(色谱纯)，检测波长为478nm，柱温控制在25～30℃，流速为1mL/min，20μL满环进样。 

本发明以红法夫酵母细胞为原料，经过乙醇与水清洗除去胞外杂质，二甲亚砜有机溶剂破壁，无水乙醇萃取得到虾青素粗提液；继续通过正己烷-乙醇-水三元系统萃取虾青素得到虾青素正己烷萃取液；最后经过硅胶柱层析梯度洗脱、氮气吹干得到纯度大于99％的虾青素。 

本发明以除去发酵液的红法夫酵母菌体细胞为原料，提取﹑分离纯化菌体胞内虾青素。本发明包括菌体二甲亚砜有机溶剂破壁、乙醇浸取红法夫酵母菌内虾青素、正己烷-乙醇-水三元系统萃取虾青素至正己烷有机相、硅胶柱层析梯度洗脱、氮气吹干得到纯度大于99％、回收率大于60％的虾青素。利用本发明分离纯化出的虾青素通过了经高效液相色谱检测及氢谱核磁共振仪检测，可直接充氮气保护避光保存或溶解在有机溶剂中保存，其生物活性优良，具有很大的应用前景。 

附图说明

图1为虾青素乙醇粗体液的HPLC检测图。图中横坐标为测试样品的保留时间(min)，纵坐标为测试样品的响应强度(mAu)，虾青素出峰时间为3.204min，峰面积百分比为56.6％。 

图2为分离提纯后样品的HPLC检测图。图中横坐标为测试样品的保留时间(min)，纵坐标为测试样品的响应强度(mAu)，虾青素出峰时间为3.203min，峰面积百分比为99.9％。 

图1-2样本分别来自实施例1中步骤1)和步骤3)。 

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。 

实施例1： 

1)量取5g红法夫酵母菌于50mL离心管中，加入40mL去离子水，用玻璃棒搅拌至菌体细胞分散后，在超声清洗仪中震荡清洗2min，800r/min离心10min，弃上层洗涤液，加入40mL工业酒精洗涤，重复5次；冻干后用5mL50℃预热的二甲亚砜锡箔纸避光破壁 30min，加入500mL无水乙醇浸取，后再转速为3000r/min下离心5min。 

2)取上述虾青素乙醇浸取液10mL，加入正己烷10mL，去离子水10mL置于28℃恒温摇床中以200r/min的转速振荡30min；取出后在高速离心机中以1000r/min的转速离心5min快速达到相平衡，混合液分为2层，上层即为虾青素正己烷萃取液。 

3)采用粒径为100～200目的硅胶，在直径为19mm的玻璃层析柱中正己烷湿法装柱20mm，重力场作用下常压层析，采用正己烷湿法装柱。取6mL虾青素正己烷萃取液上样，洗脱流速为70滴/min；首先采用体积比为正己烷∶丙酮＝95∶5的洗脱液洗脱第一、第二、第三杂质条带，待三个条带都被洗出层析柱后，用体积比为正己烷∶丙酮＝90∶10的洗脱液洗脱并收集第四条带即虾青素条带，最后用体积比为正己烷∶丙酮＝85∶15的洗脱液洗脱第五杂质条带。收集的第四条带即为虾青素条带，HPLC检测纯度为99.9％，回收率为65.2％。实施例2： 

1)量取5g红法夫酵母菌于50mL离心管中，加入40mL去离子水，用玻璃棒搅拌至菌体细胞分散后，在超声清洗仪中震荡清洗3min，2000r/min离心5min，弃上层洗涤液，加入40mL工业酒精洗涤，重复3次；冻干后用5mL55℃预热的二甲亚砜锡箔纸避光破壁25min，加入500mL无水乙醇浸取，后再转速为5000r/min下离心3min。 

2)取上述虾青素乙醇浸取液10mL，加入正己烷8mL，去离子水20mL置于25℃恒温摇床中以200r/min的转速振荡20min；取出后在高速离心机中以800r/min的转速离心10min快速达到相平衡，混合液分为2层，上层即为虾青素正己烷萃取液。 

3)采用粒径为100～200目的硅胶，在直径为25mm的玻璃层析柱中正己烷湿法装柱15mm，重力场作用下常压层析，采用正己烷湿法装柱。取5mL虾青素正己烷萃取液上样，洗脱流速为62滴/min；首先采用体积比为正己烷∶丙酮＝95∶5的洗脱液洗脱第一、第二、第三杂质条带，待三个条带都被洗出层析柱后，用体积比为正己烷∶丙酮＝90∶10的洗脱液洗脱并收集第四条带即虾青素条带，最后用体积比为正己烷∶丙酮＝85∶15的洗脱液洗脱第五杂质条带。收集的第四条带即为虾青素条带，HPLC检测纯度为99.9％，回收率为68.8％。