一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法

摘要

本发明提供一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，涉及生物技术领域，以解决现有方法很难得到纯合四倍体的问题。一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，包括如下步骤：启动培养，诱导培养，伸长培养，壮苗培育，幼叶检测。本发明用以培养得到酸枣纯合四倍体材料，为枣树遗传改良提供支持。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方 法。

背景技术

枣(Zizyphus.jujuba Mill.)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Zizyphus.Mill.) 植物，是原产于中国的特色优势经济树种，其味道鲜美，果形美观，富含人体 所需的多种氨基酸和维生素，还含有多种多糖、微量元素及抗癌物质环磷酸腺 苷等药用成分，是药食两用滋补品。

酸枣(Ziziphus spinosus Hu.)原产中国华北，多野生，耐干旱、贫瘠， 在山区开发中曾发挥重要作用。酸枣花期长，是良好的蜜源植物，种仁饱满可 入药。酸枣作为食品，营养价值很高，含有钾、钠、铁、锌、磷、硒等多种微 量元素；更重要的是酸枣中含有大量的维生素C，其含量是普通红枣的2～3 倍、柑橘的20～30倍，在人体中利用率可达86.3％。此外，近年来果汁、果 醋等天然养生食品深受广大消费者喜爱，酸枣作为生产原材料，其枣果品质的 增加可以大幅提高生产效率，减少生产成本。

酸枣的多倍体研究已有一些报道，但多采用田间愈伤组织途径或材料为丛 芽、茎段的离体诱导途径，这些途径通常会形成的嵌合体，很难得到纯合四倍 体。本发明以酸枣无菌苗的幼嫩叶片作为试验材料，采用直接再生不定芽途径 进行多倍体的诱导，从而有效的避免嵌合体的出现。此外，对于枣树叶片离体 多倍体诱导最佳处理时期的相关研究还未见报道，本发明采用两步培养法，在 第一步预(暗)培养中首次找到秋水仙碱最佳处理时期，进而可以提高诱变效 率，以期短时间内获得大量的多倍体材料，对枣树的遗传改良具有重要价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供酸枣不定芽途径诱导多倍体中秋水仙碱 的最佳处理时期、适宜浓度和处理时间，以解决现有方法很难得到纯合四倍体 的问题。

为解决上述技术问题，本发明实施例提供一种酸枣不定芽途径诱导多倍体 的方法，包括如下步骤：启动培养，剪取酸枣无菌苗的幼嫩叶片，刻伤后接种 到不定芽启动培养基一上进行9～11d预(暗)培养；诱导培养，将叶片转至含 有40～80mg/L秋水仙碱的液体培养基中进行多倍体诱导培养，在黑暗条件下 100rmp摇床震荡培养2～3d后转入不定芽启动培养基一上继续暗培养8～ 10d；伸长培养，预(暗)培养结束后，将叶片转接到不定芽伸长培养基二上， 移至光下培养25～35d；壮苗培育，将叶片再生出的不定芽从叶片上剥离，转 接到含有植物生长调节剂的MS壮苗培养基中，培养18～20d；幼叶检测，待 不定芽生长健壮后，取幼嫩叶片，进行多倍体检测。

其中，所述不定芽启动培养基一包括改良WPM基本培养基和包含 1.0mg/L的噻苯隆和0.3mg/L的吲哚-3-丁酸的植物生长调节剂；所述不定芽伸 长培养基二包括改良WPM基本培养基和包含0.1mg/L的吲哚-3-乙酸和 0.5mg/L的赤霉素的植物生长调节剂。

其中，所述改良WPM基本培养基含蔗糖30g/L，ph＝5.8～6.2，配方为：

其中，所述MS壮苗培养基含蔗糖30g/L，ph＝5.8-6.2，配方为：

其中，所述壮苗培养基中的植物生长调节剂为1.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤 和0.4mg/L的吲哚丁酸。

其中，所述幼嫩叶片为酸枣无菌苗植株形态学上端至下端的第3-5枚的三 枚叶片；所述叶片刻伤方法为沿中脉垂直方向横切2～3个伤口，切断主脉但不 切断叶片；所述接种方式为近轴端接触培养基。

其中，所述诱导培养所用液体培养基为不加入琼脂的不定芽启动培养基 一，所述秋水仙碱的浓度为40～80mg/L。

其中，所述伸长培养阶段采用人工控制的培养条件，所述人工控制的培养 条件中光照强度为19000x～21002x，光照时间12～16h/d，温度23～27℃。

其中，所述多倍体检测方法为流式细胞仪法，所用裂解液为改良WPB裂 解液，所用染液为10ug/L的DAPI染液。

其中，所述改良WPB裂解液ph＝7.2～7.8，配方为：

改良WPB裂解液成分 配置1L含量 Tris·HCl 24.22g MgCl₂·6H₂O 0.81g Na₂EDTA·2H₂O 0.74g NaCl 5.03g KCl 5.96g

Na₂S₂O₅1.90g TritonX-100 10ml PVP-10 10g

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

上述方案中，通过采用酸枣无菌苗的幼嫩叶片作为试验材料，能有效克 服嵌合体的出现，获得同质多倍体植株的效率较高，对枣树的遗传改良具有重 要价值。

附图说明

图1为本发明实施例的刻伤后的酸枣无菌苗的幼嫩叶片；

图2为本发明实施例的酸枣无菌幼嫩叶片在不定芽伸长培养基二光照培 养30d后的示意图；

图3为本发明实施例的酸枣叶片再生不定芽壮苗培养20d后的示意图；

图4A为本发明实施例的酸枣二倍体植株DNA含量示意图；

图4B为本发明实施例的酸枣四倍体植株DNA含量示意图；

图5A为本发明实施例的酸枣二倍体植株气孔密度和大小示意图；

图5B为本发明实施例的酸枣四倍体植株气孔密度和大小示意图；

图6为本发明实施例的酸枣四倍体植株的生长状况示意图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附 图及具体实施例进行详细描述。

本发明实施例针对现有的方法很难得到纯合四倍体的问题，提供一种酸枣 不定芽途径诱导多倍体的方法，包括如下步骤：

启动培养，剪取酸枣无菌苗的幼嫩叶片，刻伤后接种到不定芽启动培养基 一上进行9～11d预(暗)培养；

诱导培养，将叶片转至含有40～80mg/L秋水仙碱的液体培养基中进行多 倍体诱导培养，在黑暗条件下100rmp摇床震荡培养2～3d后转入不定芽启动 培养基一上继续暗培养8～10d；

伸长培养，预(暗)培养结束后，将叶片转接到不定芽伸长培养基二上， 移至光下培养25～35d；

壮苗培育，将叶片再生出的不定芽从叶片上剥离，转接到含有植物生长调 节剂的MS壮苗培养基(Murashige and Skoog，1962)中，培养18～20d；

幼叶检测，待不定芽生长健壮后，取幼嫩叶片，进行多倍体检测。

通过采用酸枣无菌苗的幼嫩叶片作为试验材料，能有效克服嵌合体的出 现，获得同质多倍体植株的效率较高，对枣树的遗传改良具有重要价值。

具体地，所述酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，包括如下步骤：

步骤一、启动培养

制备不定芽启动培养基一，包括改良WPM基本培养基(Woody Plant  medium)和包含1.0mg/L的噻苯隆和0.3mg/L的吲哚-3-丁酸的植物生长调节 剂，其中所述改良WPM基本培养基含蔗糖30g/L，ph＝6.0，配方为：

选取酸枣无菌苗植株形态学上端至下端的第3-5枚的三枚叶片，如图1所 示，在每枚叶片上沿中脉垂直方向横切2个伤口，切断主脉但不切断叶片，采 用近轴端接触培养基接种在不定芽启动培养基一，共接种144枚叶片，进行 10d预(暗)培养。

步骤二，诱导培养

制备含有75mg/L秋水仙碱的液体培养基，即在不加入琼脂的不定芽启动 培养基一中加入75mg/L秋水仙碱。

经过10d预(暗)培养，叶片的叶柄和伤口主脉处都长出了类似愈伤组织 的白点，此时为秋水仙碱诱导加倍处理最佳时期，将叶片转入含有75mg/L秋 水仙碱的液体培养基中进行多倍体诱导培养，在黑暗条件下100rmp摇床震荡 培养3d，之后，转入不定芽启动培养基一上继续预(暗)培养10d。

步骤三，伸长培养

制备不定芽伸长培养基二，包括改良WPM基本培养基和包含0.1mg/L的 吲哚-3-乙酸和0.5mg/L的赤霉素的植物生长调节剂，所述改良WPM基本培养 基配方同上。

如图2所示，预(暗)培养结束后，将叶片转接到不定芽伸长培养基二上， 并移至光下培养，采用人工控制的培养条件，所述人工控制的培养条件中光照 强度为20000x，光照时间14h/d，温度25℃。

30d后共有120枚叶片诱导出不定芽，平均每枚叶片再生芽数2.29。不定 芽再生率为83.33％，其中不定芽再生率＝诱导出不定芽叶片个数×100％/接种外 植体数。

步骤四，壮苗培养

制备MS壮苗培养基，所述MS壮苗培养基含蔗糖30g/L，ph＝6.0，配方 为：

并加入1.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和0.4mg/L的吲哚丁酸的植物生长调节 剂。

如图3所示，将经伸长培养长至2cm的不定芽从叶片上小心剥离，并接 种到MS培养基上，共接种275个不定芽，经培养20d后，有211个不定芽成 活，成活率为76.72％。

步骤五，幼叶检测

制备改良WPB裂解液和10ug/L的DAPI染液，所述改良WPB裂解液 ph＝7.5，配方为：

改良WPB裂解液成分 配置1L含量 Tris·HCl 24.22g MgCl₂·6H₂O 0.81g Na₂EDTA·2H₂O 0.74g NaCl 5.03g KCl 5.96g Na₂S₂O₅1.90g TritonX-100 10ml PVP-10 10g

如图4A至图6所示，将壮苗培养所得叶片切碎于含1ml WPB裂解液的 培养皿中，使用200目尼龙网过滤至离心管，加入100ul DAPI染液，采用细 胞仪法进行多倍体检测。最终得到14个纯合四倍体植株，四倍体诱导率为 6.63％。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。