用于治疗耐多种药物的疟疾的组合物和方法

摘要

提供了一种用于治疗个体的疟疾感染的方法，具体是疟原虫的耐药性物种，该方法包括向需要如此治疗的该个体给予一种组合物，该组合物包括一种提取物，该提取物包含一个有效量的一种或多种抗疟疾的二萜或三萜化合物。为了从容易获得的商品中以一种廉价的方式治疗和预防疟疾的目的，包含抗疟疾化合物的有力的并且有效的提取物可以衍生自罗汉果和甜菊叶（包括其组合）。在一个实施例中，该组合物以一种固体的或液体的可摄取形式口服给予。

说明书

发明领域

描述了一种用于治疗个体的疟疾感染的方法。具体地，披露了 一种用于治疗一个被疟原虫的耐疟疾药物的物种感染的个体的方法，该方 法包括向需要如此治疗的个体给予一种组合物，该组合物包含一种或多种 二萜或三萜化合物。已经发现衍生自罗汉果（Siraitia grosvenorii，Luo Han  Guo）的果实和甜菊（Stevia，Stevia rebaudiana）的叶子（包括其组合） 的有力的并且有效的化合物包含有效量的二萜或三萜化合物，并且对这些 进行了描述。在一个实施例中，发明组合物以一种固体或液体的可摄取形 式口服给予。

背景

疟疾是一种毁灭性传染病，并且在全世界每年出现3.5-5亿病 例。作为亚洲、非洲、中东、以及中美洲和南美洲的主要卫生问题，约 41%的世界人口生活在疟疾传播地区。并且仍更加悲惨的，是在发展中国 家，疟疾导致全部儿童死亡的11%。例如，世界卫生组织（WHO）报道 在2008年，疟疾导致近一百万的死亡，其中大多数是非洲儿童。在非洲， 每45秒钟就有一个儿童死于疟疾，并且该疾病占全部儿童期死亡的20%。

抗疟疾治疗（主要是药物疗法）是已知的。作为治疗剂，奎宁 （或奎宁类）是熟知的，例如氯喹、甲氟喹。也已经开发了其他的药物组 合。目前最好的可获得治疗（特别是针对恶性疟原虫（P.falciparum）疟 疾）是以青蒿素为基础的联合治疗（“ACT”）。青蒿素衍生自一种植物青 蒿（Artemisia annua），属于菊科。

不幸地，在对抗疟疾的斗争中出现了两个基本问题，即耐药性 以及药物和医学治疗的高成本。对于避免疟原虫的耐药性的发展并且大幅 度降低与治疗疟疾相关联的成本的替代疗法存在迫切需要。提供以不同形 式可给予的容易获得的、容易进入的抗疟疾组合物对医学领域将是一个贡 献。

根据WHO数据，如氯喹和磺胺多辛（sulfacoxine）-乙胺嘧啶 （SP）以前已经发生过的，如果对青蒿素的耐受性发展并且蔓延到其他 大的地理区域，那么公共卫生后果会是可怕的，因为可能在不久的将来将 没有可获得的替代抗疟疾药品。

此外，假设同样浓度的来自罗汉果的提取物（包含本发明的组 合物）和青蒿素衍生物一样有效，那么罗汉提取物的成本将仅是每次用于 治愈疟疾的青蒿素治疗的成本的一部分。以甜菊叶为基础的提取物可以同 样这么说。即使抗疟疾治疗需要实质上更大量的衍生自罗汉和/或甜菊的 活性成分，与目前推向市场的疗法相比，成本节约也将是巨大的。

某些二萜或三萜糖苷作为甜味剂是已知的，但是还没有使用此 类化合物用于治疗人类受试者的疟疾的报道。

提供一种通过向需要如此治疗的人类患者给予包含一种或多种 二萜或三萜化合物的组合物来治疗疟疾的方法对医学领域将是另一个贡 献。提供一种通过向需要如此治疗的人类患者给予处于提取物形式的有效 量的本发明的组合物来治疗耐药性疟疾的方法对医学领域将是另一个贡 献，该组合物包含一种或多种二萜或三萜化合物。

发明概述

已经发现衍生自罗汉果（Siraitia grosvenorii，Luo Han Guo）的 果实和甜菊（Stevia，Stevia rebaudiana）的叶子（包括其组合）的有力的 并且有效的活性化合物包含有效量的一种或多种二萜或三萜。这些有力的 化合物（包括罗汉果甙）可以从罗汉果中提取。在一个实施例中，假设同 样浓度的来自罗汉的提取物和青蒿素衍生物通常是一样有效的，那么罗汉 提取物的成本将仅是每次用于治愈疟疾的治疗的成本的一部分。其他有力 的化合物（包括莱苞迪苷A）可以从甜菊叶中提取。

提供了一种用于治疗个体的疟疾感染的方法，该方法包括向需 要如此治疗的该个体给予一个治疗有效量的组合物，该组合物包括一种甜 菊叶提取物和一种可接受的载体，该甜菊叶提取物包含甜菊糖苷。

在另一个实施例中，罗汉果提取物可以被包括在一种组合物中 用于疟疾的治疗。另外，提供了一种用于治疗个体的疟疾感染的方法，该 方法包括向需要如此治疗的该个体给予一个治疗有效量的组合物，该组合 物包括一种罗汉果提取物和一种可接受的载体。

在一个替代实施例中，提供了一种用于治疗个体的疟疾感染的 方法，该方法包括向需要如此治疗的该个体给予一个治疗有效量的组合 物，该组合物包括二萜或三萜中至少一个，以及一种可接受的载体。

在一个替代实施例中，提供了一种用于治疗个体的疟疾感染的 方法，该方法包括向需要如此治疗的该个体给予一个治疗有效量的组合 物，该组合物包括莱苞迪苷A、一种罗汉果提取物、以及一种可接受的载 体。

仍在另一个实施例中，提供了一种用于治疗个体的疟疾感染的 方法，该方法包括向需要如此治疗的该个体给予一个治疗有效量的组合 物，该组合物包括与选自下组的一种或多种抗疟疾化合物处于组合形式的 二萜或三萜中的至少一个，该组由以下各项组成：甲氟喹、卤泛群、青蒿 琥酯、蒿甲醚、氯喹、苯芴醇、伯氨喹、磺胺多辛、磺胺林、乙胺嘧啶、 多西环素、四环素、阿奇毒素、氯胍、环氯胍、氨苯砜、青蒿素以及阿托 伐醌（atovoquone），但是优选是青蒿素。

仍在另一个实施例中，提供了一种抗疟疾组合物，该抗疟疾组 合物包括一个治疗有效量的莱苞迪苷A、一个治疗有效量的罗汉果提取 物、以及一种可接受的载体。该抗疟疾组合物可以进一步包括一个治疗有 效量的选自下组的化合物，该组由以下各项组成：甲氟喹、卤泛群、青蒿 琥酯、蒿甲醚、氯喹、苯芴醇、伯氨喹、磺胺多辛、磺胺林、乙胺嘧啶、 多西环素、四环素、阿奇毒素、氯胍、环氯胍、氨苯砜、青蒿素、阿托伐 醌（atovoquone）、及其组合。

附图简要说明

图1描绘了一条剂量反应曲线（生长百分比对活性成分浓度）， 该剂量反应曲线描述了罗汉果提取物（即乙酸乙酯、EtOAc馏分：“化合 物A”）的一个实施例，该罗汉果提取物用于在体外治疗恶性疟原虫（P. falciparum）7G8（一种耐药性试验株系，获得自Malaria Research and  Reference Reagent Resource Center(MR4),Manassas,Virginia,USA（疟疾 研究和参考试剂资源中心（MR4），马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国）），使 用氯喹（“CQ”）作为阳性对照。

图2描绘了一条剂量反应曲线（生长抑制百分比对药物浓度）， 该剂量反应曲线描述了CQ对在一个实施例中作为药物敏感性试验株系 的恶性疟原虫（P.falciparum）克隆3D7的作用。

图3描绘了一条剂量反应曲线（生长抑制百分比对药物浓度）， 该剂量反应曲线描述了CQ对在一个实施例中作为耐药性试验株系的耐 多种药物的恶性疟原虫（P.falciparum）克隆Dd2的作用。

详细说明

在此披露的有力的并且有效的二萜或三萜可以被包含在一种组 合物用于疟疾感染的安全治疗。这些有力的并且有效的二萜和/或三萜活 性化合物（包括罗汉果甙）可以从罗汉果中提取。这些有力的并且有效的 二萜和/或三萜活性化合物（包括莱苞迪苷A）可以从甜菊叶中提取。可 替代地或额外地，此类二萜和/或三萜化合物（包括罗汉果甙和/或莱苞迪 苷A）可以从任何适合的天然源或植物源中提取或分离。

在一个替代实施例中，用于疟疾感染的治疗的包含一种或多种 二萜或三萜化合物的组合物可以进一步包括一种倍半萜内酯，例如青蒿 素。

优选地，该组合物包含被认为对人类消费和使用安全并且有效 的成分。

如在此使用，术语“有效量”是指根据本发明的化合物在其给予 或使用的背景内有效的量或浓度，该有效量可以是抑制的、预防的和/或 治疗的。通常，优选的是将该组合物以一种口服可给予形式来给予，但是 可以经由肠胃外的、静脉内的、肌内的、经皮的、口腔的、皮下的、栓剂 或其他途径来给予某些配制品。

疟疾感染是由疟原虫寄生虫导致的。这些寄生虫是通过被称为 “疟疾传染媒介”的感染的疟蚊（Anopheles mosquitoe）传播至人的。

存在四种类型的人类疟疾：恶性疟原虫（Plasmodium  falciparum）、间日疟原虫（Plasmodium vivax）、卵形疟原虫（Plasmodium  ovale）、以及三日疟原虫（Plasmodium malariae）。根据WHO，近年还出 现了一些带有诺氏疟原虫（Plasmodium knowlesi）的人类疟疾病例—一种 影响猴的疟疾，这种疟疾出现在东南亚的某些森林地区。

萜类包括广泛类别的天然植物材料。单萜包括两个异戊二烯单 位并且具有通式C₁₀H₁₆。尽管大多数生物活性种类包括一个或多个可以是 稠合的或桥联的环，但是萜类可以是非环状的或环状的。倍半萜拥有三个 异戊二烯单位并且包括青蒿素及其衍生物，青蒿素是一种已知类别的过氧 基桥联内酯。由四个异戊二烯单位组成的二萜涵盖一个更广泛组的生物上 重要的化合物，这包括甜菊醇、毛喉素、等。最后，由六个异戊二烯单位 组成的三萜表示一个甚至更广泛组的化合物，这些化合物通常具有C₃₀的 碳骨架或核心结构。角鲨烯以及其他生物甾体产生自这个类别，葫芦烷相 关的化合物也产生自这个类别。三萜包括许多的并且广泛地分布于自然 中、主要出现在植物中的一类化合物。葫芦烷是在许多植物中发现的三萜， 并且这些化合物中的一些（例如葫芦素、罗汉果甙I-VI、苦瓜蛋白 （momordicin）、等）是重要的植物化学成分。

考虑作为对目前抗疟疾组合物有用的二萜和三萜及其衍生物 （包括糖苷衍生物）包括，但不局限于：莱苞迪苷A、莱苞迪苷B、莱苞 迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F、杜克甙A、杜克甙B、 甜茶素、斯替维苷、甜菊双糖甙、罗汉果甙II、罗汉果甙III、罗汉果甙 IV、罗汉果甙V、赛门苷I、光果木鳖皂苷I（grosmomoside I）、及其组 合。此外，视情况，还考虑了使用这些成分的盐、溶剂化物以及前药。

甜菊糖苷被包含在来自南美药草甜菊（Stevia rebaudiana）的叶 子的纯化提取物中。目前，甜菊在全世界的许多地方被栽培并且在食物中 使用。莱苞迪苷A（经常被称为“rebianna”或“Reb A”）和斯替维苷是这些 提取物的主要组分，并且两者都是二萜。Reb A被命名为 (14α)-13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄 糖基)氧基]贝壳杉（kaur）-16-烯-19-羧酸β-D-吡喃葡萄糖基酯。Reb A的 结构被描绘于具有化学式(1)的化合物中：

斯替维苷在C-13位置处拥有一个更小的葡萄糖基基团，确切 地，缺少Reb A的3-O-吡喃葡萄糖基基团。

已知Reb A和斯替维苷两者都是非营养性甜味剂，分别处于甜 度为蔗糖的约300倍和350-450倍的比较水平。目前，主要使用甜菊糖苷 作为无热量的甜味剂和增味剂。

莱苞迪苷A已经被授权了来自美国食品和药品管理局的GRAS （一般认为安全（Generally Regarded as Safe））告示状态（编号252和 253）。

在人类代谢研究中，斯替维苷和Reb A两者都被转化成甜菊醇， 然后甜菊醇共轭于葡萄糖醛酸以形成甜菊醇葡萄糖苷酸，并且在II期代 谢中被排泄于尿液中。在人类中两种糖苷的半衰期（t_1/2）都是约14小时。 此外，处于在此所使用的剂量时，Reb A不展示出不利的血液动力学效应 或血糖降低效应。甜菊糖苷的唯一报道的药理学效应是在非常高的剂量速 率（约750至1500mg/天）观察到的减小血压和降低血糖水平。

包含Reb A和一种可接受的载体的组合物可以用于疟疾感染的 治疗。进一步期望的是当与一种药学上可接受的载体一起配制时，选自下 组的活性化合物的组合对于人类患者的疟疾（包括疟原虫种类的耐药性感 染）的治疗是治疗有效的，该组由以下各项组成：莱苞迪苷A、莱苞迪苷 B、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F、杜克甙A、杜 克甙B、甜茶素、斯替维苷、以及甜菊双糖甙。

罗汉果（Luo Han fruit）（汉语，luo han guo）、或僧侣果（monk  fruit）是由一种仅生长在中国南方的广西省北部的植物（罗汉果（Siraitia  grosvenorii））产生的。该植物是葫芦（瓜（cucumber或melon））科中的 一种多年生藤本植物。这种果实在整个中国和东南亚作为膳食的和医药的 食物而被广泛使用，并且已经用于此类用途而栽培了数个世纪。在中国， 这些果实被频繁地用作“冷饮或茶”中的主要成分。传统地，使用这种果实 来制作热水汤剂（a decoction with hot water）并且用于嗓子和肺部疾病的 治疗而被饮用。额外地，罗汉果汁非常甜，并且罗汉果的一些组分已经被 用作甜味剂。

在此描述了罗汉果的提取物。罗汉果提取物的主要组分是称为 罗汉果甙的葫芦烷三萜糖苷，确切地是罗汉果甙II、III、IV、V、以及 VI，连同类黄酮和类黑精。罗汉果的甜味主要源自罗汉果甙，尤其是罗 汉果甙V，这些罗汉果甙包括一个三萜糖苷基团并且构成按干果重量计的 约0.5%至1%。罗汉果甙V已经被鉴定为主要的萜类化合物组分和主要 的糖苷组分，并且使用提取以及其他分离手段可以获得例如处于按重量计 约30%-60%水平的罗汉果甙V。此外，罗汉果提取物可以包含按重量计> 45%至按重量计高达约48%的总罗汉果甙（包括罗汉果甙衍生物和/或代 谢物）。罗汉果甙V被命名为(3β,9β,10α,11α,24R)-3-[(6-O-β-D-吡喃葡萄糖 基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-11,25-二羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾 (norlanost)-5-烯-24-基-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1-2)-O-[β-D-吡喃葡萄糖基 -(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。罗汉果甙V的结构被描绘于具有化学式(2) 的化合物中：

已知罗汉果甙是非营养性甜味剂，并且处于其纯的形式的罗汉 果甙V的甜度是糖的高达300倍。

一种包含罗汉果甙V的有用的罗汉果提取物已经被授权了来自 美国食品和药品管理局的GRAS（一般认为安全（Generally Regarded as  Safe））告示状态（编号301）。

罗汉果甙衍生物或代谢物的一个实例是11-氧代-罗汉果甙V， 11-氧代-罗汉果甙V也能以按重量计高达约8%的实质量存在于在此所描 述的罗汉果提取物中。

进一步期望的是当与一种药学上可接受的载体一起配制时，罗 汉果提取物对于人类患者的疟疾（包括疟原虫种类的耐药性感染）的治疗 是治疗有效的。

青蒿素是从青蒿（Artemisia annua）（一种属于菊科并且发现于 温带亚洲的小灌木；通常被称为黄花蒿（sweet worm wood））中提取并分 离的。对在此所披露的实施例有用的其他青蒿素衍生物包括，但不局限于， 蒿甲醚、蒿乙醚、二氢青蒿素、青蒿琥酯、等。如以上所讨论，对于疟疾 的医学研究的一个主要焦点是以青蒿素为基础的联合治疗（“ACT”）。这 些治疗将青蒿素衍生物与伴侣药物进行合并。例如，一种熟知的组合包括 处于1:6wt/wt比例的蒿甲醚和苯芴醇（亦称共-蒿甲醚（co-artemether））。 苯芴醇是(+/-)-2-二丁氨基-1-[2,7-二氯-9-(4-氯苯亚甲基)-9,11-芴-4-基]乙 醇（亦称本芴醇（benflumetol）和外消旋本芴醇（dl-benflumetol）），并且 可以与其他成分合并于本发明的实施例中。然而，还没有报道青蒿素或其 衍生物与二萜或三萜的组合。具体地，还没有报道用于在抗疟疾治疗中使 用的青蒿素或其衍生物与二萜糖苷和/或三萜糖苷的组合。

青蒿素及其多种衍生物是难溶于水的，这可能造成吸收进人体 和延迟的摄取问题。相反，如在此所披露的某些二萜糖苷和三萜糖苷是高 度水溶性的，并且更容易地克服吸收和生物利用度障碍。例如，Reb A和 罗汉果甙V两者都是完全溶于水的，并且因此当被包含于本发明的抗疟 疾组合物中时更加有用和容易获得。

不被理论所束缚，相信与一种或多种抗疟疾化合物组合使用的 某些二萜和/或三萜化合物将提供对疟疾的有效治疗，因此以一种协同方 式清除或抑制存在于人类患者中的疟原虫寄生虫，这些抗疟疾化合物选自 甲氟喹、卤泛群、青蒿琥酯、蒿甲醚、氯喹、苯芴醇、伯氨喹、磺胺多辛、 磺胺林、乙胺嘧啶、多西环素、四环素、阿奇毒素、氯胍、环氯胍、氨苯 砜、青蒿素以及阿托伐醌（atovoquone），最优选的是青蒿素或其衍生物。 期望的是使用二萜和/或三萜糖苷衍生物的ACT将提供比任一单独的试 剂（即青蒿素对萜化合物）更大的治疗效果，并且还避免了耐药性。在一 个替代实施例中，期望的是使用青蒿素（或一种衍生物）以及二萜和三萜 的组合的ACT将提供比任意单独的试剂更大的治疗效果，并且也避免了 耐药性。在另一个替代实施例中，进一步期望的是使用青蒿素（或一种衍 生物）以及包含甜菊糖苷的甜菊叶提取物和罗汉果提取物的组合的ACT 将提供比任意单独的试剂更大的治疗效果，并且也避免了耐药性。在另一 个替代实施例中，进一步期望的是使用青蒿素（或一种衍生物）以及包含 甜菊糖苷的甜菊叶提取物和罗汉果甙V的组合的ACT将提供比任意单独 的试剂更大的治疗效果，并且也避免了耐药性。在另一个替代实施例中， 进一步期望的是使用青蒿素（或一种衍生物）以及莱苞迪苷A和罗汉果 甙V的组合的ACT将提供比任意单独的试剂更大的治疗效果，并且也避 免了耐药性。在另一个替代实施例中，进一步期望的是使用青蒿素（或一 种衍生物）以及莱苞迪苷A和罗汉果提取物的组合的ACT将提供比任意 单独的试剂更大的治疗效果，并且也避免了耐药性。

例如，抗疟疾化合物可以与二萜糖苷和/或三萜糖苷组合使用于 本发明的实施例中。适合的抗疟疾化合物包括甲氟喹、卤泛群、青蒿琥酯、 蒿甲醚、氯喹、苯芴醇、伯氨喹、磺胺多辛、磺胺林、乙胺嘧啶、多西环 素、四环素、阿奇毒素、氯胍、环氯胍、氨苯砜、青蒿素以及阿托伐醌 （atovoquone），但是优选的是青蒿素。

可以与以下实例相联系来进一步理解上面所描述的方法。甜菊 糖苷提取物可以获得自EUSTAS（European Stevia Assoc.,Huesca,Spain（欧 洲甜菊协会，韦斯卡，西班牙））和Pure Circle，Oak Brook（橡树溪）， Illinois（伊利诺州），美国。处于约90%-95%纯的Reb A（一种甜菊叶提 取物）如上是可获得的并且来自GLG，温哥华，不列颠哥伦比亚省，加 拿大（GLG,Vancouver,British Columbia,Canada）。处于约35%-60%纯的 罗汉果甙V（罗汉果纯提取物粉末）从BioVittoria有限公司（BioVittoria  Limited）（汉密尔顿，新西兰）作为是可获得的。罗汉果粉末作 为果实-甜味^TM（Fruit-Sweetness^TM）从BioVittoria有限公司（BioVittoria  Limited）（汉密尔顿，新西兰）以及桂林莱茵天然成分公司，桂林，广西， 中国（Guilin Layn Natural Ingredients Corp.,Guilin,Guangxi,P.R.China） 也是可获得的。

在本说明书中使用了以下缩写。EtOAc：乙酸乙酯；DMSO：二 甲亚砜；MDR：耐多种药物的；CQ：氯喹；PBS：磷酸盐缓冲盐水。

实例1A

样品编号1：莱苞迪苷A（甜菊叶纯提取物），按重量计纯度> 95%

样品编号2：甜菊糖苷（甜菊叶纯提取物），按重量计纯度约> 95%

样品编号3：包含罗汉果甙V（按重量计约40%）的罗汉果纯 提取物粉末

样品编号4：罗汉果汁浓缩物（来自新鲜罗汉果）

样品编号5：罗汉果提取物（水相）

样品编号6：罗汉果提取物（正丁醇相）=“化合物B”

样品编号7：罗汉果提取物（EtoAc相）=“化合物A”

样品编号8：罗汉果普通提取物（来自干罗汉果）

作为第一步骤，将罗汉果粉末（135mg）（即包含罗汉果甙V（按 重量计约40%）的纯提取物粉末）通过热水萃取（3X400mL）在水中复 水，并且将合并的水提取物先用EtOAc（200mL，2X100mL）、并且接 着用正丁醇（200mL，2X100mL）进行分配，以产生分别对应于以上样 品5-7的3个馏分，并且将有机溶剂通过旋转蒸发器去除以产生“化合物 A”（EtOAc馏分）和“化合物B”（正丁醇馏分）。针对抗疟疾活性对化合 物A和化合物B进行测试。样品5对应于用EtOAc、随后是正丁醇进行 分配之后的最终的水相。

此外，罗汉果普通提取物（样品8）通过如在上面的第一步骤 中用热水萃取干罗汉果而无需进一步操作来制备。

活性成分溶液的制备。将上面所列的每个样品溶解于DMSO中 以制备0.1mg/μL的储备溶液。

实例1B

将恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）耐多药株系（MDR） 7G8（获得自Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4),Manassas,Virginia,USA（疟疾研究和参考试剂资源中心（MR4）， 马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国））在体外培养于具有5%的PCV（血细胞 压积）的RMPI1640细胞培养基（补充有10%的人类血清）中。将恶性 疟原虫（P.falciparum）通过添加5%的D-山梨醇使细胞同步化，并且然 后将这些同步化的细胞在达到环式相（ring form phase）之后铺开在培养 平板上，初始感染率为1%并且PCV为5%。

将如上针对样品编号7（“化合物A”）和样品编号6（“化合物B”） 的DMSO储备溶液用培养基稀释至2000μg/ml作为母液，并且用培养基 进行稀释用于在活性测试检测中的3倍连续稀释形式的梯度浓度（活性成 分溶液应该小于该培养系统的10%，并且DMSO浓度应该低于0.5%以避 免对恶性疟原虫（P.falciparum）生长的不利影响）。将10μl的活性成分 溶液附加90μl的恶性疟原虫（P.falciparum）培养基铺开于每个孔上。如 本领域所熟知，通过用标准吉姆萨染液的涂片检查在显微镜下针对感染率 对细胞培养进行观察。

抑制百分比=（空白对照的感染率-活性成分-处理的或药物-处 理的组的感染率）/空白对照的感染率×100%。

为了确定IC₅₀（最大抑制浓度的一半），使用氯喹处理的组作为 阳性对照，产生了作为生长值百分比对活性成分/药物浓度的剂量反应曲 线（软件Graphpad Prism3.0中的非线性回归分析功能，GraphPad Software 公司，拉霍亚，加利福尼亚州，美国）。图1示出了针对氯喹（CQ）和化 合物A的剂量反应生长抑制曲线。

表1

如表1中所示，样品编号7示出了针对恶性疟原虫（P. falciparum）7G8的强活性，其中IC₅₀为22.14μg/ml。如表1中所示，在 所测试的更高的浓度处样品编号7罗汉果提取物证明了对感染的细胞生 长的完全抑制。

实例1C

寄生虫培养。将获得自Malaria Research and Reference Reagent  Resource Center(MR4),Manassas,Virginia,USA（疟疾研究和参考试剂资 源中心（MR4），马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国）的恶性疟原虫（Plasmodium  falciparum）的药物敏感性克隆3D7和耐多种药物的（MDR）克隆Dd2 继续维持在处于一种气体混合物（由7%CO₂、5%O₂以及88%N₂组成） 中的血型O+的人类红细胞和10%的人类血清中。

将实例1A的储备溶液以及作为阳性对照而采用的CQ（制备为 PBS中的10mM储备溶液）储存在-20℃。每种工作溶液被新鲜制备于细 胞培养基中。在所有测定中，DMSO和PBS的浓度维持在0.5%，这不影 响对照培养物的生长。

体外抑制浓度测定。将通过用5%的D-山梨醇的连续处理而同 步化的恶性疟原虫（P.falciparum）克隆3D7和Dd2继续维持在处于一种 气体混合物（由7%CO₂、5%O₂以及88%N₂组成）中的血型O+的人类 红细胞和10%的人类血清中。通过吉姆萨染液涂片的光学显微镜确定起 始于1%的寄生虫血症和2.5%的红细胞压积的环期寄生的 （ring-stage-parasitized）红细胞的体外生长抑制。

使用CQ的阳性对照实验的结果呈现于图2和3中。

图2在一个作为生长抑制百分比对药物浓度的剂量反应曲线中 示出了CQ对恶性疟原虫（P.falciparum）克隆3D7的效果。

图3在一个作为生长抑制百分比对药物浓度的剂量反应曲线中 示出了CQ对恶性疟原虫（P.falciparum）克隆Dd2的效果。

接着，基于上面所讨论的这些储备溶液，对实例1A的提取物 进行测试。下表2示出了这些提取物对恶性疟原虫（P.falciparum）克隆 3D7和Dd2的效果。

表2

表2的结果清楚地证明衍生自甜菊叶和罗汉果的提取物可以抑 制恶性疟原虫（P.falciparum）克隆3D7和Dd2的生长。此外，参考产生 样品5-7的实例1A的提取制品，这些结果证明这些活性化合物似乎是在 EtOAc相中（样品7）。

值得注意的是，所有的提取物（无论衍生自甜菊叶还是罗汉果） 证明了对抑制导致疟疾的寄生虫的有效性。具体地，无论衍生自甜菊叶还 是罗汉果的这些提取物针对耐药性株系Dd2是高度有效的。

实例1D

罗汉果普通提取物（样品8）通过如在实例1A中用热水萃取干 罗汉果来制备，并且然后将其如在实例1A中分别用EtOAc和正丁醇进行 分馏以产生对应于样品5a-7a的3个馏分。样品6a-7a也分别对应于“化合 物B”和“化合物A”。

将恶性疟原虫（P.falciparum）通过添加5%的D-山梨醇使细胞 同步化，并且然后将这些同步化的细胞在达到环式相（ring form phase） 之后铺开在培养平板上，初始感染率为1%并且PCV为5%。

将如上针对样品编号7a（“化合物A”）和样品编号6a（“化合物 B”）的DMSO储备溶液用培养基稀释至2000μg/ml作为母液，并且将 DMSO储备溶液用培养基进行稀释以用于在活性测试检测中的3倍连续 稀释形式的梯度浓度（活性成分溶液应该小于该培养系统的10%，并且 DMSO浓度应该低于0.5%以避免对恶性疟原虫（P.falciparum）生长的不 利影响）。将10μl的活性成分溶液附加90μl的恶性疟原虫（P.falciparum） 培养基铺开于每个孔上。通过使用标准吉姆萨染液的涂片检查在显微镜下 针对感染率对细胞培养进行观察。

抑制百分比=（空白对照的感染率-活性成分-处理的或药物-处 理的组的感染率）/空白对照的感染率×100%。

为了确定IC50（最大抑制浓度的一半），使用氯喹和青蒿素处 理的组作为阳性对照，产生了作为生长值百分比对活性成分/药物浓度的 剂量反应曲线（软件Graphpad Prism3.0中的非线性回归分析功能， GraphPad Software公司，拉霍亚，加利福尼亚州，美国）。参见下表3。

将获得自Malaria Research and Reference Reagent Resource  Center(MR4),Manassas,Virginia,USA（疟疾研究和参考试剂资源中心 （MR4），马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国）的恶性疟原虫（Plasmodium  falciparum）的药物敏感性（DS）克隆3D7和耐多种药物的（MDR）克 隆Dd2继续维持在处于一种气体混合物（由7%CO₂、5%O₂以及88%N₂组成）中的血型O+的人类红细胞和10%的人类血清中。

在所有测定中，DMSO和PBS的浓度维持在0.5%，这不影响 对照培养物的生长。体外抑制浓度测定。将通过使用5%的D-山梨醇的连 续处理而同步化的恶性疟原虫（P.falciparum）克隆3D7和Dd2继续维持 在处于一种气体混合物（由7%CO₂、5%O₂以及88%N₂组成）中的血型 O+的人类红细胞和10%的人类血清中。通过吉姆萨染液涂片的光学显微 镜确定起始于1%的寄生虫血症和2.5%的红细胞压积的环期寄生的 （ring-stage-parasitized）红细胞的体外生长抑制。

表3

如表3中所示，样品编号7a在萃取之后包含抗疟疾活性。还发 现莱苞迪苷A（样品1）和罗汉果甙V（样品3）证明了针对测试寄生虫 的普遍可比较活性。

实例2

棋盘测试。使用疟疾株系恶性疟原虫（P.falciparum）DD2对罗 汉果提取物和甜菊叶提取物的体外抗疟疾活性进行确定和预测。将样品混 合成1:2连续稀释并且计算FIC指数（FICI）。（Rand,K.H.（兰德K.H.）， Houck,H.J.（霍克H.J.），Brown,P.（布朗P.）等人，“Reproducibility of the  microdilution checkerboard method for antibiotic synergy,”（―针对抗生素协 同作用的微量稀释棋盘法的再现性”），Antimicrobial Agents& Chemotherapy（《抗微生物制剂和化学治疗》）（1993）37:613–5；Eliopoulos, G.M.（艾里普卢斯G.M.），Moellering R.C.in Antibiotics in Laboratory  Medicine（《实验室医学中的抗生素》），编辑Lorian V（洛里安V）（Williams &Wilkins,Baltimore,MD,1991（威廉姆斯和威尔金斯，巴尔的摩，马里 兰州，1991）），pp432–492；Ghannoum,M.A.（格汉奴姆M.A.），Fu,Y. （福Y.），Ibrahim,A.S.（易卜拉欣A.S.），Mortara,L.A.（莫塔拉L.A.）， Shafiq,M.C.（沙菲克M.C.），Edwards,J.E.（爱德华J.E.），Jr.，Criddle,R.S. （克里得利R.S.）Antimicrob.Agents Chemother.（《抗菌物和化学疗法期 刊》）（1995）39:2459–2465；Barchiesi,F.（巴克易斯F.），DiFrancesco,L.F. （迪弗朗切斯科L.F.），Scalise,G.（斯卡利塞G.）―In Vitro Activities of  Terbinafine in Combination With Fluconazole and Itraconazole Against  Isolates of Candida albicans With Reduced Susceptibility to Azoles,”（“与氟 康唑和伊曲康唑组合的特比萘芬针对具有对唑类降低的敏感性的白色念 珠菌的分离菌的体外活性”），Antimicrob.Agents Chemother.（《抗菌物和 化学疗法期刊》）（1997）41:1812-1814。前述每个参考文件通过引用以其 全文结合在此。）

为了确定该联合治疗的示值读数是否是叠加的、协同的或中立 的，通过使用棋盘测试来计算FIC指数（FICI）。FICI表示每种测试药物 的FIC的总和，其中通过当组合使用时每种药物的MIC除以当单独使用 时每种药物的MIC针对每种药物确定FIC（分数抑制浓度）。FICI=（组 合形式的MIC药物A/单独的MIC药物A）+（组合形式的MIC药物B/ 单独的MIC药物B）。这些预假设（preassumption）是(i)被因子2隔开 的测试使用浓度和(ii)一步稀释（one-dilution-step）MIC变化在实验误 差的范围之内。还已经使用了其他复杂的方法；例如，在使用不同浓度的 每种试剂表征处于组合形式的三种抗真菌剂的性质中使用了等高线曲面 图方法论（contour surface-plot methodology）。

FICI在数值<0.5处证明了协同作用，而发现于0.5至约1.0范 围内的数值证明了叠加效应而非协同作用。

实例2A

包含甜菊糖苷的甜菊叶提取物和罗汉果提取物的组合。如上所 描述的罗汉果提取物（化合物A）和包含甜菊糖苷的甜菊叶提取物（如在 实例1A，样品2）的组合提供了0.3的FICI，证明了比任一单独的组分 更大范围的抑制恶性疟原虫（P.falciparum）的体外生长的协同能力。（单 独的化合物A的MIC：232nM；单独的甜菊糖苷的MIC：400nM；组合 形式的化合物A的MIC：14.5nM；组合形式的甜菊糖苷的MIC：100nM）。

实例2B

包含甜菊糖苷的甜菊叶提取物和罗汉果甙V的组合。根据一个 实施例，期望的是包含甜菊糖苷的甜菊叶提取物（如在实例1A，样品2） 和包含罗汉果甙V（40%）的罗汉果纯提取物粉末（如在实例1A，样品 3）的1:1wt/wt组合可以比任一单独的组分更大范围地抑制恶性疟原虫 （P.falciparum）的体外和体内生长。

实例2C

莱苞迪苷A（Reb A）和罗汉果甙V的组合。根据一个实施例， 期望的是Reb A（如在实例1A，样品1）和包含罗汉果甙V（40%）的罗 汉果纯提取物粉末（如在实例1A，样品3）的1:1wt/wt组合可以比任 一单独的组分更大范围地抑制恶性疟原虫（P.falciparum）的体外和体内 生长。

实例2D

莱苞迪苷A（Reb A）和罗汉果提取物的组合。Reb A（如在实 例1A，样品1）和罗汉果提取物（化合物A）的组合提供了0.3的FICI， 证明了比任一单独的组分更大范围的抑制恶性疟原虫（P.falciparum）的 体外生长的协同能力。（单独的化合物A的MIC：232nM；单独的Reb A 的MIC：376nM；组合形式的化合物A的MIC：14.5nM；组合形式的 Reb A的MIC：94nM）。

实例2E（对照）

莱苞迪苷A（Reb A）和青蒿素的组合。Reb A（如在实例1A， 样品1）和青蒿素的组合提供了约0.9-1.0的FICI，仅证明了叠加效应。（单 独的青蒿素的MIC：0.13nM；单独的Reb A的MIC：376nM；组合形式 的青蒿素的MIC：0.0081nM；组合形式的Reb A的MIC：376nM）。

实例3A

一种包括莱苞迪苷A（Reb A）的组合物。根据一个实施例，用 一个或多个剂量的水性组合物口服地治疗一个患者（或一个患者群体的每 个成员），该水性组合物包括高达约500mg的莱苞迪苷A的总每日剂量。 期望的是如通过标准血膜监测所评估的，恶性疟原虫（P.falciparum）感 染将被遏制或抑制在3-7天之内。

实例3B

莱苞迪苷A（Reb A）和包含罗汉果甙V的罗汉果提取物的组 合。根据一个实施例，使用一个或多个剂量的水性组合物口服地治疗一个 患者（或一个患者群体的每个成员），该水性组合物包括高达约500mg 的莱苞迪苷A和高达约500mg的罗汉果甙V的总的日剂量。期望的是如 通过标准血膜监测所评估的，恶性疟原虫（P.falciparum）感染将被遏制 或抑制在3-7天之内。

实例4

体外抗疟疾活性还通过轻微修改的基于疟疾SYBR Green I的荧 光法进行确认，该荧光法先前由Smilkstein（斯密尔斯坦茵）等人, Antimicrobial Agents and Chemotherapy（《抗微生物制剂和化学治疗》）， May2004（2004年5月），p.1803-1806，Vol.48，No.5进行了描述。将 药物溶液用培养基进行连续稀释并且将其以一式四份的方式分布于96-孔 平板中的异步寄生虫培养物中，以实现总体积为100μL、具有2%的血细 胞压积（haematocrit）的0.2%的血症。然后将这些平板在37℃下孵育72 h。孵育之后，将具有0.2μL/mL的SYBR Green I的100μL裂解缓冲液 添加至每个孔。将这些平板在37℃下、在黑暗中孵育1h，并且然后将 其放置于96-孔荧光读板仪（96-well fluorescence plate reader）（Multilabel  HTS Counter;PerkinElmer,Waltham,Massachusetts,USA（多标记HTS计 数器；珀金埃尔默公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国））中，该读板仪 具有分别为497nm和520nm的激发波长和发射波长，用于荧光测量。 使用GraphPad Prism软件（GraphPad软件有限公司，拉霍亚，加利福尼 亚州）通过逻辑斯蒂剂量反应曲线的非线性回归分析来确定50%抑制浓 度（IC₅₀）。这个实例充当一个比较方法。

接着，使用复方蒿甲醚作为阳性对照来进行实例1C的程序的测 定部分。复方蒿甲醚是一种基于固定剂量的青蒿素的联合治疗（ACT）， 它从瑞士巴塞尔的诺华制药公司（Novartis AG,Basel,Switzerland）可获得。 每个复方蒿甲醚片剂包含20mg的蒿甲醚和120mg的苯芴醇。蒿甲醚具 有一个快速的起始作用并且被快速消除，而苯芴醇被消除地更慢。因此， 该组合快速地清除寄生虫，同时还防止血液中寄生虫的再次出现。在中国， 这种药物已经被广泛地用于替代氯喹（CQ），用于治疗和预防疟疾。表4 示出了如通过荧光法所确定，标准药物处理对恶性疟原虫（P.falciparum） 克隆3D7和Dd2的效果。相信发现于先前实例中的这些活性化合物也将 提供寄生细胞生长的显著（如果不是可比较的）抑制。

表4

IC₅₀呈现为平均数±这些平均数（n>3）的标准差。

本发明的这些组合物可以与一种可接受的载体组合给予。在此 类配制品中可以包括从按重量计1%至按重量计99%、或可替代地按重量 计0.1%至按重量计99.9%的活性成分。一种“可接受的载体”是指与该配 制品中的其他成分兼容并且对使用者无害的任何载体、稀释剂或赋形剂。 有用的赋形剂包括微晶纤维素、硬脂酸镁、硬脂酸钙、或任何可接受的糖 （例如，甘露醇、木糖醇）。

本发明的这些药物组合物可以与一种药学上可接受的载体组合 给予。在此类配制品中可以包括从按重量计1%至按重量计99%、或可替 代地按重量计0.1%至按重量计99.9%的活性成分。一种“药学上可接受的 载体”是指与该配制品中的其他成分兼容并且对使用者无害的任何载体、 稀释剂或赋形剂。

本发明的这些抗疟疾组合物和衍生自罗汉果和/或甜菊叶的有 力化合物可以与一种可接受的载体组合给予。在此类配制品中可以包括从 按重量计1%至按重量计99%、或可替代地按重量计0.1%至按重量计 99.9%的活性成分。一种“可接受的载体”是指与该配制品中的其他成分兼 容并且对使用者无害的任何载体、稀释剂或赋形剂。

递送系统

适合的剂型包括片剂、胶囊、溶液、悬浮液、粉末、胶质、以 及糖果。舌下递送系统包括，但不局限于，舌头下和舌头上的可溶药片、 液滴、以及饮料。可以使用可食用膜、亲水性聚合物、口服可溶的膜或口 服可溶的条。其他有用的递送系统包括口腔喷雾或鼻腔喷雾或吸入器、等。

对于口服给予而言，可以将这些活性化合物与一种或多种固体 的无活性成分进行合并用于片剂、胶囊、丸剂、粉末、颗粒或其他适合剂 型的制备。例如，可以将该活性剂与至少一种赋形剂进行合并，这些赋形 剂是例如填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、溶液阻滞剂、吸收促进剂、 润湿剂（wetting agent）、吸收剂、或润滑剂。其他有用的赋形剂包括硬脂 酸镁、硬脂酸钙、甘露醇、木糖醇、甜味剂、淀粉、羧甲基纤维素、微晶 纤维素、硅石、明胶、二氧化硅、等。

给予途径

这些活性化合物可以通过任何途径来给予，包括但不局限于， 口服、舌下、口腔、眼睛、肺部、直肠、以及肠胃外给予，或作为口腔喷 雾或鼻腔喷雾（例如喷雾状的蒸汽、液滴或固体微粒的吸入）。肠胃外给 予包括，例如，静脉内、肌内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、膀胱内 （例如，向膀胱）、真皮内、经皮、局部、或皮下给予。例如，这些活性 成分可以被定位于一个储存处用于至该循环的缓释。

这种处理可以按单一的、连续的一段时间或者以不连续的一段 时间进行一个必要长的时期。基于患者的反应，治疗医生将知道如何增加、 减少或中断治疗。根据一个实施例，治疗可以进行从约一天至约七天。可 以根据需要重复该治疗计划。

总之，已经示出纯化的Reb A和甜菊叶的粗提物两者针对导致 疟疾的寄生虫的已知耐药性株系是高度有效的。还已经示出纯化的罗汉果 提取物及其粗提物两者针对导致疟疾的寄生虫的已知耐药性株系是高度 有效的。进一步期望的是Reb A和罗汉果提取物的组合针对导致疟疾的 寄生虫的已知耐药性株系将是高度有效的。

尽管在前述说明书中，已经就本发明的某些实施例对其进行了 描述，并且为了说明的目的已经提出了许多细节，但是对本领域普通技术 人员显而易见的是本发明易受额外的实施例的影响并且在此所描述得某 些细节可以在不偏离本发明的基本原则下进行相当大的改变。

如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、 “一种”和“该”包括复数参照，除非上下文清楚地另外指明。例如，术语“一 个叶子”或“叶子”包括多个叶子。

在此所引用的所有参考文件通过引用以其全文被结合。在不偏 离本发明的精神或基本属性下，可以将其体现为其他特定形式，并且因此 应该参考指明本发明的范围的所附权利要求书，而非参考前述说明书。