靶向表达尿激酶受体的肿瘤的光敏剂及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及生物医药领域，更具体而言涉及肿瘤的靶向治疗。靶向表达尿激酶受体的肿瘤的光敏剂及其应用。本发明提供了一种靶向表达尿激酶受体的肿瘤的光敏剂及其应用。该光敏剂是酞菁锌（

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体而言涉及肿瘤的靶向治疗，涉及靶向表 达尿激酶受体的肿瘤的光敏剂及其制备方法和用途。

背景技术

肿瘤虽是一类古老的疾病，但直至上世纪初肿瘤在世界仍是比较罕见的疾 病。近半个世纪以来，肿瘤的发病率逐年上升，其在医学领域内的地位也愈来 愈重要。目前肿瘤已成为多发病、常见病，是人类死亡的主要原因之一，严重 威胁着人类健康。根据其目前发病趋势，估计2020年全球每年新增癌症患者人 数将达到1500万人，癌症正成为本世纪人类的第一杀手。

光动力学疗法（Photodynamic therapy,PDT）是一种利用光化学反应及其引 发的一系列生理免疫反应达到治疗恶性肿瘤的方法。其基本原理是：光敏剂 （photosensitizer）本身没有毒性，但可选择性地聚集于肿瘤组织周围，在特定 波长的光激发下，光敏剂被激发至激发态；激发态的光敏剂能激发组织中的溶 解氧成为具有高氧化性的单线态氧以及其他形式的活性氧（reactive oxygen  species,ROS）；这类活性氧具有生物毒性，能破坏蛋白质、核酸等生物大分子， 从而导致其所富集的肿瘤细胞发生坏死，达到抗肿瘤治疗目的。

与常规的手术、化疗、放疗等常规治疗手段相比，光动力学疗法具有许多重 要优点：（1）选择性好：光动力学疗法是通过光照激发光化学反应进行治疗， 仅在光照范围内有效，因此对光照范围外的正常组织与细胞几乎无损伤。（2） 毒副作用小：进入组织的光动力学药物，只有达到一定浓度并受到足量光辐射， 才会引发光毒反应杀伤肿瘤细胞；人体未受到光辐照的部分，并不产生光毒反 应，故体内造血功能、免疫功能、各脏器功能均不会受到影响。换句话说，光 动力学疗法没有放疗、化疗的严重毒性反应。（3）微创性：借助光纤、内窥镜、 彩色B超和其他介入技术，可将激光引导到病变组织进行治疗，避免了开胸、 开腹手术造成的创伤和痛苦。（4）可协同其他治疗方法同期治疗。（5）可重 复治疗：由于光敏剂本身无毒性，肿瘤细胞对光敏剂没有耐药性，因此光动力 学疗法可重复使用。目前全世界已有数万例患者接受了该疗法的治疗，其治疗 的癌症多达数十种，包括食管癌、肺癌、脑瘤、乳腺癌、膀胱癌、妇科肿瘤、 直肠癌、皮肤癌等。

在光动力学疗法的开展中，光敏剂的选择与使用是其核心问题。用于光动力 学治疗的光敏剂应该具有以下条件：（1）最大吸收波长在600-800nm之间， 并且在400-600nm之间的吸收要尽量小；（2）较高的单线态氧产率；（3）光 毒性强而暗毒性弱；（4）在肿瘤组织中的保留比高；（5）组分单一；（6）具 有水溶性；（7）具有荧光。目前临床用于治疗的光敏剂大多为卟啉类衍生物， 如国际上最早批准临床使用的Photofrin系列。这些衍生物大多存在组分不确定、 在适于治疗的红光范围内摩尔消光系数低、毒副作用较大等局限性。与卟啉类 衍生物相比，酞菁类衍生物有其明显优势：最大吸收波长在最适于治疗的 600-800nm范围内；摩尔消光系数高，单线态氧量子产率高。作为第二代光敏 剂的典型代表，酞菁类光敏剂正受到越来越多科研工作者们的关注。在诸多金 属酞菁类衍生物中，酞菁锌衍生物具有相对更高的单线态氧量子产率。然而， 酞菁类衍生物水溶性较低以及其对肿瘤细胞的靶向性较差等极大地限制了其在 临床中的应用和推广。

发明内容

本发明针对金属酞菁类光敏剂水溶性低、对肿瘤靶向性差等不足，提供了一 种提高其水溶性并增强其肿瘤靶向性的制备方法。同时还提供这种光敏剂的制 备方法，为光敏剂在体内外肿瘤靶向成像和光动力学治疗方面的应用提供理论 依据。

因此，本发明通过如下技术方案实现：

一种肿瘤靶向性光敏剂，其表达式为酞菁锌-ATF偶合物（ATF-ZnPc）， ATF为重组尿激酶N端片段。

在一个实施方案中，所述重组尿激酶N端片段为序列为SEQ ID NO.1的氨 基酸序列。

在一个具体实施方案中，本发明的肿瘤靶向性光敏剂结构式为：

其中SEQ ID NO.1的序列如下：

EFSNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEID KSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQ LGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGKKPSSP PEE。

本发明还提供了本发明的肿瘤靶向性光敏剂ATF-ZnPc的制备方法，其特征 在于，所述方法包括：β-单羧基取代酞菁锌首先被乙二胺化，然后以乙二胺为桥 连基团与重组尿激酶N端片段（例如序列为SEQ ID NO.1的氨基酸序列）相偶 联。

本发明所述光敏剂ATF-ZnPc不但水溶性好而且对尿激酶受体具有高亲和 力，在表达尿激酶受体的肿瘤光动力学治疗应用中，可以用作肿瘤成像的探针， 还可以用于肿瘤的光动力治疗。

本发明还提供了如下方案：

1.本发明的肿瘤靶向性光敏剂用于体内外肿瘤成像的用途，所述肿瘤靶向 性光敏剂作为肿瘤成像的探针，所述被成像的肿瘤细胞表面表达尿激酶受 体。所述肿瘤例如白血病、肺癌。

2.本发明的肿瘤靶向性光敏剂在制备用于体内外肿瘤成像的探针中的用途， 所述肿瘤细胞表面表达尿激酶受体。所述肿瘤例如白血病、肺癌。

3.本发明的肿瘤靶向性光敏剂用于肿瘤的光动力学治疗，所述肿瘤细胞表 面表达尿激酶受体，所述肿瘤例如白血病、肺癌。

4.本发明的肿瘤靶向性光敏剂在制备用于肿瘤的光动力学治疗的药物中的 用途，所述肿瘤细胞表面表达尿激酶受体，所述肿瘤例如白血病、肺癌。

本发明的优点是：

（1）该肿瘤靶向性光敏剂制备简单，组分明确；

（2）水溶性好，对尿激酶受体表达的肿瘤细胞具有良好的选择性；

（3）在体内外对尿激酶受体表达的肿瘤细胞选择性高，具有良好的肿瘤靶 向成像和光动力学治疗效果。

附图说明

图1为ATF-ZnPc的结构示意图及其高效液相色谱分析谱图。

图2为ATF-ZnPc的MALDI-TOF质谱分析图，ATF-ZnPc的主峰值为 16746.4。

图3为ATF-ZnPc在不同浓度下对于正常细胞HELF，人白血病细胞U937 和人肺癌细胞H1299的光动力学效应，充分显示ATF-ZnPc对尿激酶受体高 表达的肿瘤细胞（U937细胞和H1299细胞）的选择性。

图4为ATF-ZnPc在正常细胞HELF和肝癌细胞H22的聚集成像对比效果。 结果显示：与正常细胞HELF相比，ATF-ZnPc选择性富集于H22细胞，但 与核染色剂DAPI缺乏共定位。

图5为ATF-ZnPc在H22肝癌移植瘤小鼠模型中不同时间点的肿瘤靶向成像 及ATF-ZnPc在肿瘤与非肿瘤组织的蓄积总量对比。

图6为ATF-ZnPc在H22肝癌移植瘤小鼠模型中的抗肿瘤光动力学治疗作 用。

具体实施方式

本发明将通过如下实施例进行详细说明。但本领域技术人员了解，下述实 施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改进和变化都 在本发明的保护范围之内。

本发明人发现，针对表达尿激酶受体的肿瘤细胞，将光敏剂偶联上能与尿 激酶受体发生特异结合的尿激酶N端片段（amino-terminal fragment,ATF, Ser¹-Glu¹⁴³，即SEQ ID NO.1），就可以通过尿激酶受体的特异性靶向结合片段 与肿瘤细胞的相互作用，特异性识别肿瘤细胞并富集于肿瘤细胞周围，最终达 到肿瘤靶向光动力学治疗效果。

在本发明中，发明人为了保证尿激酶受体的靶向结合片段对尿激酶受体的高 亲和力，首先对β-单羧基取代酞菁锌进行乙二胺化，并以乙二胺为桥连基团， 与重组尿激酶N端片段（amino-terminal fragment,ATF）上的羧基耦合，成功 合成了酞菁锌-尿激酶偶合物（ATF-ZnPc）；该偶合物在体内外对表达尿激酶 受体的白血病、肺癌等肿瘤细胞表面均具有良好的靶向性作用，可以作为肿瘤 成像的探针，还可以用于肿瘤的光动力学治疗。此外，由于绝大多数正常细胞 并不表达尿激酶受体，因此，该偶合物不会富集在正常细胞周围，对正常细胞 的光毒副作用较小。

实施例一：酞菁锌-尿激酶偶合物（ATF-ZnPc）的制备

第一步：合成ZnPc-CO-NH-(CH₂)₂-NH₂

将β-单羧基取代酞菁锌9.3mg（0.015mmol）和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲 基脲六氟磷酸盐（HBTU）23.1mg（0.06mmol）溶解于1.5mL N,N-二甲基甲 酰胺（DMF），加入93μL N,N-二异丙基乙胺（DIEA），室温下避光搅拌30min。 加入过量的N-BOC-1,2-乙二胺，室温下避光搅拌过夜。所得反应液冷冻干燥， 得到固体即为ZnPc-CO-NH-(CH₂)₂-NH-Boc。将其与90%三氟乙酸（TFA）反 应4小时，加入4倍体积的4M氢氧化钠溶液，析出沉淀；离心弃上层清夜， 沉淀以N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解，用高效液相色谱（SinoChrom ODS-BP 色谱柱，10μm，20×250mm）进一步纯化，得固体ZnPc-CO-NH-(CH₂)₂-NH₂。

第二步：合成酞菁锌-尿激酶偶合物（ATF-ZnPc）

称取适量重组尿激酶N端片段ATF（10.91mg,0.71μmol）溶于DMF（2mL） 中，加入上述所得中间产物ZnPc-CO-NH-(CH₂)₂-NH₂（2.83mg,4.26μmol）、 HBTU（5mg/mL,320μL,5.0μmol）及少量DIEA（50μL），室温下避光、振 荡反应2h。反应液离心取上清。用高效液相色谱柱（Vydac-C4色谱柱，5μm， 250×10mm）分离，检测波长280nm，流动相：水、乙腈（均含0.1%TFA）， 梯度：乙腈比例20%-70%，梯度时间35min。收集液冷冻干燥后，获得深蓝 色固体产物。

其高效液相色谱分析谱图（图1）及其MALDI-TOF质谱分析图（图2）证 实该产物为酞菁锌-尿激酶偶合物（ATF-ZnPc）。

其中，重组尿激酶N端片段ATF的氨基酸序列SEQ ID NO.1为：

EFSNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEID KSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQ LGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGKKPSSP PEE

该实施例中使用的偶联方法，与常规的蛋白耦合方法（通常利用蛋白表面的 氨基发生偶联）不同，发明中所涉及的肿瘤靶向性光敏剂的制备，是将光敏剂 与尿激酶受体的特异性靶向结合片段，即重组尿激酶N端片段（amino-terminal  fragment,ATF）耦合，制备而得酞菁锌-尿激酶偶合物（ATF-ZnPc），这种偶 联方式不影响ATF对肿瘤的靶向性识别。

实施例二：酞菁锌-尿激酶偶合物（ATF-ZnPc）对尿激酶受体高表达的肿瘤 细胞具有靶向性。该实施例以尿激酶受体低表达的正常人胚肺成纤维细胞HELF （中国科学院上海细胞生物学研究所）、尿激酶受体高表达的人白血病细胞U937 （中国科学院上海细胞生物学研究所）和人肺癌细胞H1299（中国科学院上海 细胞生物学研究所）为例。

实验选取上述三种细胞：尿激酶受体低表达的正常人胚肺成纤维细胞HELF、 尿激酶受体高表达的人白血病细胞U937和人肺癌细胞H1299。具体实验步骤如 下：（1）细胞培养条件：在37℃，5%CO₂条件下用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基培养；（2）体外光动力学实验：将细胞接种于黑底96孔培 养板，每孔10⁴个细胞，37℃培养24h；待其贴壁后加入图3中所示不同浓度 的酞菁锌-尿激酶偶合物（ATF-ZnPc），孵育2h后换新鲜培养基，并按实验需 要用波长670nm的光源光照1min以获光剂量1.5J/cm²；光照结束后于37℃ 培养12h后，吸去原有细胞培养基，每孔加入100μL新鲜培养基，再加入10μL 5mg/ml MTT试剂，37℃培养；4h后，吸去细胞培养孔内的细胞培养基与 MTT溶液，再加入150μL二甲亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）于室温下震 荡15min溶解析出的晶体；利用BioTek Synergy4多功能酶标仪检测其在570 nm处的吸光度值，反映酞菁锌-尿激酶偶合物（ATF-ZnPc）对不同细胞的选择 性杀伤作用。实验结果（图3）显示ATF-ZnPc对尿激酶受体高表达的人白血病 细胞U937和人肺癌细胞H1299的光动力学杀伤效应随着其剂量的增加而明显 加强；而尿激酶受体低表达的正常人胚肺成纤维细胞HELF则基本没有受到明 显影响。

实施例三：酞菁锌-尿激酶偶合物（ATF-ZnPc）可用于体内外肿瘤成像。

体外肿瘤细胞成像：分别以尿激酶受体低表达的正常人胚肺成纤维细胞 HELF和尿激酶受体高表达的肝癌细胞H22为例。

选取肿瘤细胞H22（uPAR高表达）和正常人胚肺成纤维细胞HELF（uPAR 低表达）作为体外成像细胞，按常规细胞培养的方法培养、传代。在细胞培养 皿中加入2ml细胞悬液（5×10⁴细胞/ml）和2μM ATF-ZnPc孵育4h后，加 入DAPI细胞核染色液孵育。5min后去染色液，利用Olympus FluoView^TMFV1000激光共聚焦显微镜，分别用670nm（ATF-ZnPc）和405nm（DAPI） 的激光扫描获取图像。结果（图4）显示：酞菁锌-尿激酶偶合物（ATF-ZnPc） 明显富集于尿激酶受体高表达的肝癌细胞。

在体肿瘤成像：以尿激酶受体高表达的H22肝癌移植瘤小鼠模型为例。

第一步：建立H22肝癌移植瘤小鼠模型

首先将解冻的H22细胞经昆明小鼠腹腔进行传代，约5-7天后取其腹水瘤液； 用无菌生理盐水将腹水瘤液调整至浓度为10⁷/mL，并在无菌条件下按照0.2mL /只的剂量于昆明小鼠背部皮下种瘤建立实体瘤模型。

第二步：酞菁锌-尿激酶偶合物（ATF-ZnPc）对H22肝癌移植瘤小鼠的肿瘤 成像作用

将建模成功（肿瘤长至约30mm³）的小鼠尾静脉注射ATF-ZnPc（剂量为 0.04μmol/kg小鼠体重）。给药后，小鼠用脱毛剂将肿瘤部位周围脱毛，在不同 时间点（给药后第1、第4及第7天），利用小鼠活体成像FMT2500TM LX 仪器对小鼠进行体内肿瘤成像，并进行相关组织内药浓监测。结果（图5）显示： 酞菁锌-尿激酶偶合物（ATF-ZnPc）对H22肝癌移植瘤小鼠的肿瘤成像作用明 显，其与周围非肿瘤组织的信噪比可高达3-8倍。

实施例四：酞菁锌-尿激酶偶合物（ATF-ZnPc）可用于肿瘤的光动力学治疗。 这里以尿激酶受体高表达的肝癌为例。

第一步：建立H22肝癌移植瘤小鼠模型。

如实施例三中第一步所述。

第二步：酞菁锌-尿激酶偶合物（ATF-ZnPc）在体抗肿瘤光动力学作用

将建模成功的小鼠随机分为4组，每组10只，分别为：酞菁锌-尿激酶偶合 物（ATF-ZnPc）或阳性对照药——带有五个赖氨酸的酞菁锌（ZnPc-(Lys)₅，剂 量均为0.4μmol/kg小鼠体重）给药组及各自的给药+光照治疗组。待小鼠肿瘤 大小约30mm³时，按上述剂量尾静脉注射给药，给药后需要进行光照治疗的 小鼠用脱毛剂将小鼠肿瘤部位周围脱毛，并在每天固定时间利用波长670nm， 功率为300mW的发光二极管（LED）光源光照肿瘤部位5min，让实体瘤部位 获得每日4J/cm²的光剂量治疗。同时每天对肿瘤大小及小鼠体重进行监测并 记录。在进行连续7天光照的时间里，利用小鼠活体成像FMT2500TM LX仪 器对小鼠体内肿瘤部位成像，并对肿瘤部位药物浓度进行监测。实验结果（图 6）显示：单次静脉给药酞菁锌-尿激酶偶合物（ATF-ZnPc,0.4μmol/kg）即可 显著抑制肿瘤生长。