一种嗜热栖热菌漆酶及工程菌、重组漆酶和应用

摘要

本发明公开了一种嗜热栖热菌漆酶及工程菌、重组漆酶和应用，该嗜热栖热菌漆酶的氨基酸序列如Seq No.2所示。编码上述漆酶的DNA序列如Seq No.1所示。该DNA可在构建巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中应用。重组毕赤酵母工程菌是将表达载体pHKFA1-lacTT线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)获得。重组漆酶是将上述重组毕赤酵母工程菌进行发酵获得。该重组漆酶具有漆酶活性和耐高温特性，可在染料脱色中应用，尤其是偶氮染料和蒽醌染料的脱色作用，脱色率甚至可以达到100％。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域和环境生物领域，特别涉及一种嗜热栖热菌漆酶 基因和该基因工程菌和该基因编码的漆酶在生物酶法处理纺织废水中的应用。

背景技术

漆酶(benzenediol:oxygen oxidoreductases,EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚 氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶(MCOs)家族，广泛分布在植物、真菌、少数 细菌和昆虫中。漆酶的活性中心一般包含4个铜离子，漆酶的催化氧化反应即 通过铜离子间的协同传递电子，夺取反应底物的电子，将底物氧化为自由基形 式，同时将从底物捕获的电子传递给O₂，将O₂还原为水。漆酶作用的底物相 当宽泛，典型的底物是各种酚类化合物及其衍生物，包括简单的二酚、多酚、 甲氧基取代酚(如愈创木酚)、氨基酚、氯酚等。在小分子的介体物质存在下， 漆酶可氧化的底物范围还将进一步扩大。由于漆酶具有降解木质素与有毒酚类 物质的作用，使得漆酶在工业上有重要的应用价值，包括工业染料脱色、土壤 和水体的生物除污、纸浆漂白、食品和果汁加工等方面。

目前研究比较多且深入的漆酶大多是真菌漆酶。但真菌漆酶的工作pH一 般在酸性范围，热稳定性较差，而且对氯离子比较敏感，在高浓度氯离子环境 下容易失去活性。这些缺点使真菌漆酶在某些工业应用领域受到一定的限制。 而细菌漆酶的工作pH一般在中性到碱性范围，热稳定性好，且它们中有不少 对氯离子有较高的耐受性。

印染、纺织工业的废水排放量巨大，而且未经处理的废水严重污染环境。 来自印染、纺织工业的废水的pH值一般在中性到碱性，含有高浓度氯化物、 金属离子、表面活性剂和合成染料等复杂成分。其中高含量的工业染料可能对 水体生物具有毒性，降低水体能见度，同时增加水体生物需氧量(BOD)。大 部分的工业染料都难以被微生物降解，使用物理或者化学方法往往成本高而且 效果不佳。生物法，比如利用漆酶、锰过氧化物酶等，对一些工业染料的脱色 率高且环保。

因此，具有碱性工作pH以及对高浓度氯化物具有高耐受性的细菌漆酶在 印染、纺织废水脱色处理中具有独特的优势。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术中的不足，提供一种来源于嗜热栖热 菌Thermus thermophilus的漆酶基因。

本发明按照毕赤酵母密码子偏好性对漆酶基因进行优化，并通过全基因合 成得到该漆酶基因核酸序列，该漆酶基因的核酸序列如Seq No.1所示,氨基酸 序列如Seq No.2所示。该漆酶基因能够在毕赤酵母(Pichia pastoris)实现高 效表达。

上述漆酶基因在构建巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中的应 用，将上述漆酶基因及其调节基因构成的表达盒整合到毕赤酵母的基因组中， 具体包括如下步骤：

(1)将权利要求2所述DNA连入到巴斯德毕赤酵母表达载体pHKFA1， 得到表达载体pHKFA1-lacTT；

(2)通过将表达载体pHKFA1-lacTT化学转化E.coli Top10得到克隆菌株 E.coli Top10/pHKFA1-lacTT。

一种重组毕赤酵母工程菌，将权利要求5所述表达载体pHKFA1-lacTT线 性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)获得。

上述重组毕赤酵母工程菌的构建方法如下：

将表达载体pHKFA1-lacTT经Kpn2I单酶切线性化并纯化后电转化毕赤酵 母工程菌(Pichia pastoris)GS115感受态细胞，并在MD平板进行阳性转化 子筛选；以MD平板筛选得到的转化子为模板，以TTF和TTR为引物进行 PCR鉴定，PCR鉴定正确的转化子为重组毕赤酵母工程菌Pichia pastoris  GS115/pHKFA1-lacTT，其中TTF和TTR的序列如Seq No.3、4所示。

一种重组漆酶，将上述重组毕赤酵母工程菌进行发酵获得。其构建方法如 下：

挑取重组毕赤酵母工程菌接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养至 OD₆₀₀接近6.0，于6000rpm,4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬 到BMMY培养基至起始OD₆₀₀接近1.0，于30℃，250rpm震荡培养，每天补 加终浓度1％甲醇；发酵六天后在6000rpm，4℃离心5min回收发酵上清液； 用亲和层析方法对发酵上清液的重组漆酶进行纯化即可；所述BMMY培养基 中含有0.1mM CuSO₄。

上述重组漆酶可在染料脱色中应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明的漆酶具有漆酶活性。同时还对获得的重组漆酶进行最适作 用pH、pH稳定性、最适作用温度及温度稳定性分析。结果显示该重组漆酶的 温度稳定性和pH稳定性非常好，表明该漆酶具有非常好的耐热耐碱能力。

(2)本发明还涉及氯离子对获得的重组漆酶的影响分析，结果显示该重 组漆酶对氯离子有非常高的耐受性。

(3)本发明的重组漆酶来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus，在成 功地将这个新发现的漆酶基因在毕赤酵母中异源表达的基础上，对这个酶蛋白 进行纯化和酶学性质研究，结果显示，该重组漆酶对碱性环境和NaCl有较高 的耐受性，且具有耐高温的特点。此外，实现了该漆酶在生物酶法处理纺织废 水中的应用，尤其是偶氮染料和蒽醌染料的脱色作用，脱色率甚至可以达到 100％。

附图说明

图1为纯化漆酶的(a)SDS-PAGE分析及(b)活性染色图；(a)SDS-PAGE图 谱，其中M：标准蛋白质分子量；1：加热变性的纯化重组漆酶；2：未经加 热变性的纯化重组漆酶；(b)活性染色图，其中M：标准蛋白质分子量；1：非 变性纯化漆酶与底物SGZ发生显示反应；2：非变性纯化漆酶与底物愈创木酚 发生显示反应。

图2为纯化重组漆酶的(a)最适pH曲线和(b)pH稳定性曲线。

图3为纯化重组漆酶的最适温度曲线和温度稳定性曲线。

图4为不同浓度的NaCl对纯化重组漆酶的影响。

图5为纯化重组漆酶在磷酸钠缓冲液pH7.5(刚果红脱色pH环境是pH8.0) 对3种偶氮类和一种蒽醌类染料的脱色作用。

图6为漆酶脱色处理前后四个合成染料的全波长扫描分析:(a)RB5； (b)RBWNN；(c)RBBR；(d)CR。

具体实施方式

下面结合具体制备实施例和应用实施例，对本发明作进一步详细描述，但 本发明的实施方式不限于此。

实施例1

新型漆酶基因的合成

以美国国立生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公 布的GenBand:YP_005641270.1氨基酸序列为基础，对该序列按照毕赤酵母的 密码子偏好性进行优化，得到新型漆酶基因，其序列如SEQ ID NO.1所示， 通过生物技术公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)全基因合成，合成的基因 克隆在pUC57质粒(购自金斯瑞生物科技公司)上，得到质粒pUC57-lacTT。

实施例2

含新型漆酶基因的重组质粒pHKFA1-lacTT及携带该质粒的菌株E.coli  Top10/pHKFA1-lacTT的构建

根据新型漆酶基因的核苷酸序列设计PCR引物：正向引物TTF： 5'-GGAATTCAATACCGATAGAAGAACCCT-3'(下划线为EcoRI酶切位点)和 反向引物TTR：5'-ATTTGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGG TGGTGGTG TCCGACTTCCAAAACTCC-3'(下划线为NotI酶切位点，同时 含有8×His标签和终止密码子)。

以实施例1中的质粒pUC57-lacTT为模板，TTF和TTR为引物进行PCR 扩增。将胶回收纯化后的PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切， 与同样经过EcoRI和NotI双酶切的质粒pHKFA1用T4连接酶16℃连接过夜， 连接产物化学转化E.coli Top10(购自美国Invitrogen英杰生命技术有限公司)， 经卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，阳性转化子提取质粒经EcoRI和NotI 双酶切鉴定正确后，得到重组质粒pHKFA1-lacTT。含有正确重组质粒 pHKFA1-lacTT的克隆菌株E.coli Top10/pHKFA1-lacTT加15％甘油于-80℃保 存。

实施例3

新型漆酶生产菌株Pichia pastoris GS115/pHKFA1-lacTT的构建及重组漆 酶表达

将重组质粒pHKFA1-lacTT经Kpn2I单酶切线性化并纯化后电转化Pichia  pastoris GS115(购自美国Invitrogen英杰生命技术有限公司)感受态细胞，并 在MD平板进行阳性转化子筛选。以MD平板筛选得到的转化子为模板，以 TTF和TTR为引物进行PCR鉴定，PCR鉴定正确的转化子初步鉴定为新型漆 酶生产菌株Pichia pastoris GS115/pHKFA1-lacTT。

挑取3个PCR鉴定正确的转化子接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培 养至OD₆₀₀接近6.0，于6000rpm,4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞 重悬到BMMY培养基(含有0.1mM CuSO₄)至起始OD₆₀₀接近1.0，于30℃， 250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇。发酵六天后在6000rpm，4℃离 心5min回收发酵上清液。用亲和层析方法对发酵上清液的重组漆酶进行纯化。 纯化方法参照HisTrap^TM FF crude1mL(GE Healthcare,Sweden)操作指南。经 纯化的重组漆酶在4℃保存。

实施例4

纯化的重组漆酶LacTT的酶学性质

漆酶酶活的测定方法：

以愈创木酚(ε₄₆₅＝12000M^-1.cm^-1)为底物，1mL反应混合液中，含100μL 愈创木酚(终浓度2mmol/L)，100μL酶液，10μL CuSO₄(终浓度10μmol/L)， 790μL0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5)，90℃水浴保温反应5min后，冰浴60s 终止反应，465nm处测定吸光度。其他用于漆酶活力分析的底物还有1mM ABTS(ε₄₂₀＝36000M^-1.cm^-1)、100μM SGZ(ε₅₂₅＝65000M^-1.cm^-1)和2mM 2,6-DMP(ε₄₆₈＝49600M^-1.cm^-1)。

漆酶酶活力定义：以1min内催化氧化1μmol底物的量为1个酶活单位(U)。

漆酶活力计算公式：酶活(U/L)＝n×V_t×A/(ε×5×V_e/10⁶)；n:酶液稀释 倍数；A：吸光度的变化值；V_t：酶反应液的总体积；V_e:酶反应液中酶液体积； ε：摩尔吸光系数。

最适pH和pH稳定性：以ABTS、SGZ、愈创木酚为底物，在90℃下测 定LacTT在pH3.0-10.0(Britton–Robinson缓冲液)之间酶活的变化。将LacTT 置于pH3.0-11.0的Britton–Robinson缓冲液中,4℃下处理14h后取出，在 pH7.5,90℃条件下测定被处理后的LacTT的酶活力，同时以等量未经处理的酶 液作为正对照，活力设为100％。以ABTS、SGZ、愈创木酚和2,6-DMP为底 物，测定LacTT在pH3.0-10.0范围下的酶活力，结果显示LacTT作用于ABTS、 SGZ、愈创木酚和2,6-DMP的最适pH分别是4.5、6.0、7.5和8.0(图2a)， 而且，LacTT在pH3.0-11.0环境下非常稳定，在经过14h处理后酶活力仍然可 以保持90％以上(图2b)，显示出LacTT对碱性环境有较高的耐受性。

最适温度和温度稳定性：将LacTT在pH7.5条件下，以2mM愈创木酚为 底物，测定其在40℃-100℃范围内的酶活力变化。将LacTT分别在40℃-95 ℃处理1h后取出后冰浴，并在pH7.5，90℃条件下测定被处理后的LacTT的 酶活力，同时以等量未经处理的酶液作为正对照，活力设为100％。结果显示， 以愈创木酚为底物时LacTT的最适温度高达90℃，而且在高温范围70-100℃ 可以保持70％以上的酶活力(图3)。而且LacTT有较高的热稳定性，即使在 95℃处理1h，仍然可以保持90％以上的酶活力。实验结果充分表明重组漆酶 具有耐高温的优点。

不同浓度的NaCl对纯化漆酶的影响：在不同浓度的NaCl(0-2000mM) 存在的条件下，以2mM愈创木酚为底物，测定LacTT在pH7.5，90℃条件下 酶活力变化。结果显示，在0-500mM的范围内，NaCl对LacTT不同程度的 激活作用，而随着NaCl浓度继续升高，LacTT酶活力渐渐受到抑制，在1.5M NaCl存在下，LacTT的剩余酶活力仍有70％(图4)。相对于其他已发现的漆 酶，LacTT显示出非常高的对NaCl的耐受性。

实施例5

纯化的重组漆酶LacTT对3种偶氮染料和1种蒽醌染料的脱色效率测定

反应体系为2mL,染料浓度为50mg/L,漆酶浓度为40U/L,CuSO₄浓度为 100μM，反应温度为70℃，50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5，刚果红脱色环 境为pH8.0)。作用24h后，在不存在任何介体的条件下，该漆酶对偶氮染料 Reactive Black5(RB5)、Reactive Black WNN(RBWNN)、Congo Red(CR)和蒽 醌染料Remazol Brilliant Blue R(RBBR)的脱色率分别为94％、93％、100％和 73％(图5)，而对脱色过程中脱色样品的全波长扫描分析发现，随着漆酶处 理时间增加，RB5和RBWNN在其最高吸收峰595nm附件的吸收值逐渐降低， 但在516nm处重新形成新的峰，可能是由于RB5和RBWNN的某些发色基团 没有被漆酶氧化去除(图6a，图6b)。RBBR的最高吸收峰为594nm，随着漆酶 处理时间增加，其594nm处的吸收值降低，反应24h后594nm的吸收峰仍然 存在，LacTT对RBBR的脱色并不完全(图6c)。CR的最高吸收峰为488nm， 随着漆酶处理时间增加，其在488nm处的吸收值降低，在反应24h后CR基 本被LacTT完全降解，脱色率达到100％(图6d)。

上述结果表明该漆酶对某些偶氮染料和蒽醌染料具有良好的脱色效果。