一种与中华绒螯蟹性早熟性状相关的SNP标记及其应用

摘要

本发明公开了一种与中华绒螯蟹性早熟性状相关的SNP标记及其应用。该SNP位于蜕皮抑制激素基因MIH（AY310313.1）的3’‐UTR区，具体位置为3088bp处，碱基变异信息为SNP A3088T T>G。性状‐基因型关联性分析结果表明，该SNP变异与河蟹的性早熟性状之间存在着显著的相关性，其中GG基因型河蟹个体表现出性早熟性状的风险性较TT基因型个体高2.175倍。本发明河蟹性早熟相关基因的多态性SNP标记，可用于后续与河蟹性早熟性状相关的遗传育种研究。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种与中华绒螯蟹性早熟性状相 关的SNP标记及其应用。

背景技术

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）又称河蟹，是我国重要的甲壳类经济动物。 长期以来，河蟹养殖过程中普遍存在着一龄蟹种的性早熟问题。性早熟幼蟹在培 育过程中性腺当年发育成熟，这些性早熟蟹种不能顺利蜕壳，体重增长缓慢甚至 停滞，绝大多数在翌年4～5月期间死亡，不能再继续饲养至2龄成蟹规格。性早 熟一龄蟹的大量存在不仅造成饵料的巨大浪费，而且由于其外形与大规格蟹种较 为相似，如果在挑选蟹种时不慎将性早熟个体用于后续商品蟹养殖，将给生产带 来巨大的损失。目前的研究认为，河蟹性早熟的发生机制非常复杂，可能与内在 的遗传因素和多种外部环境因素有关，但是其形成的确切机理还不清楚。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种与中华绒螯蟹性早熟 性状相关的SNP标记。

本发明的另一目的是提供该SNP标记的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种与中华绒螯蟹性早熟性状相关的SNP标记，该SNP位于蜕皮抑制激素 基因MIH（Genbank登录号AY310313）的3’‐UTR区，具体位置为3088bp处，碱 基变异信息为SNP A3088T T>G。

其中，所述的SNP标记，蜕皮抑制激素基因MIH3088bp处SNP位点GG基 因型河蟹个体表现出性早熟性状的风险性显著高于TT基因型个体。

本发明所述的SNP标记在预测中华绒螯蟹性早熟风险中的应用。

一种预测中华绒螯蟹性早熟风险的方法，通过检测所述的SNP标记，预测 中华绒螯蟹性早熟风险。

所述的预测中华绒螯蟹性早熟风险的方法，优选通过检测所述的SNP标记， 该位点GG基因型河蟹个体表现出性早熟性状的风险性较TT基因型个体显著提 高，从而预测中华绒螯蟹性早熟风险。

所述的预测中华绒螯蟹性早熟风险的方法，可进一步优选不同河蟹个体的基 因组DNA，采用以PCR为基础的限制性片段长度多态法PCR‐RFLP对不同个体进 行基因分型，从而预测中华绒螯蟹性早熟风险。

所述的PCR‐RFLP中使用的PCR上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2；使用的限制性内切酶为SspI限制性内切酶。

所述的PCR‐RFLP中，酶切后进行电泳，GG基因在359b p处有特异性条带， TT基因型在192bp和167bp处有特异性条带，TG基因型在359bp、192bp以及 167bp处有特异性条带。

所述的预测中华绒螯蟹性早熟风险的方法，还可进一步优选提取不同河蟹个 体的基因组DNA，PCR扩增含有所述SNP标记的基因片段，通过直接测序获得所 述SNP标记的序列，从而预测中华绒螯蟹性早熟风险。

用于鉴定本发明所述的SNP标记的PCR引物，上游引物为SEQ ID NO.1，下 游引物为SEQ ID NO.2。

有益效果：

本发明提供了一种与河蟹性早熟性状密切相关的SNP标记及其应用，其位 于编码河蟹MIH基因序列的3’‐UTR区（T>G；3088bp处）。性状‐基因型关联性 分析结果表明，该SNP变异与河蟹的性早熟性状之间存在着显著的相关性，其 中GG基因型河蟹个体表现出性早熟性状的风险性较TT基因型个体高2.175倍。 本发明河蟹性早熟相关基因的多态性SNP标记，可用于后续与河蟹性早熟性状 相关的遗传育种研究。

附图说明

图1中华绒螯蟹SNP A3088T位点基因分型情况。

图1A.酶切后电泳图谱及测序结果，其中泳道1为marker；泳道2为GG基因

型（359bp）；泳道3和5为TT基因型（192bp；167bp）；泳道4为TG基因型（359bp；

192bp以及167bp）。图1B.为三种基因型个体MIH基因PCR扩增产物经直接测序 所得到的测序图谱。

具体实施方式

实施例1

（1）检测方法：采用常规的酚氯仿法提取不同河蟹个体的基因组DNA，采用以 PCR为基础的限制性片段长度多态法（PCR‐RFLP）对不同个体进行基因分型；

PCR反应条件：

PCR产物长度为359bp，PCR扩增引物为：F:CGTTCACCTCGTTTACCCAC（SEQ  ID NO.1）；R:CCCTCAAACAGCTTTAGAGTT（SEQ ID NO.2）。PCR反应体系为20μL， 其中包括：10×PCR Buffer2.5μL，Mg²⁺（2.5mmol/L）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L） 1.7μL，正反向引物各0.75μL（10nmol/L），Taq酶0.2U，DNA模板1μL （50ng/μL），去离子双蒸水补足体积。PCR反应共计30个循环，循环前95℃预 变性5min，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s；循环 结束后于72℃延伸5min。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测合格后用 于酶切。

酶切条件：

采用SspI限制性内切酶对上述PCR产物进行酶切，酶切体系为10μL，其中包 括10×NEB缓冲液1μL，PCR产物5μL，SspI0.25μL，去离子双蒸水补足体积。37℃ 酶切过夜后用3%的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，确定个体的不同基因 型。

基因分型结果如图1所示。

（2）不同基因型个体与性早熟性状的相关性

表1SNP A3088T与河蟹性早熟性状相关性的两阶段相关研究

^a野生纯合子/杂合子/突变纯合子河蟹个体数；

^b最小等位基因频率

结果表明，MIH基因SNP A3088T与河蟹性早熟之间存在着显著的相关性（OR =1.469(95%CI1.169‐1.844)，P=0.001）。因此，可通过检测该SNP位点预测河蟹 性早熟的风险。