中华绒螯蟹育种群体遗传特征分析及性早熟相关SNP标记筛选

摘要

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）俗称河蟹，主要分布于中国长江、辽河、瓯江等水域，但群体自然分布以长江流域为主。多年来，由于各水系中华绒螯蟹无序引种和培育苗种的盲目放流，加上人工养殖群体向自然水体的逃逸，打破了各水系中华绒螯蟹的天然分布格局，各水系群体间的基因交流非常频繁，由此产生了中华绒螯蟹的种质混杂问题。因此，进行长江水系中华绒螯蟹优良品系选育已成当务之急。本研究采用微卫星技术分析了选育过程中所构建的3个育种基础群体的遗传特征，以期为后期深入开展长江水系中华绒螯蟹优良品系选育积累有益资料。近年来，在各地的养殖过程中普遍发生一龄蟹的性早熟现象。性早熟直接导致河蟹生长缓慢甚至停滞，个体小，死亡率高，严重制约了河蟹养殖业的发展，给生产带来了巨大损失。本研究在假设蜕皮抑制激素基因（MIH基因）变异与中华绒螯蟹性早熟之间存在相关性的基础上，尝试鉴定MIH基因调控区和编码区的SNPs位点，然后对鉴定出的所有SNPs位点在性早熟蟹和正常扣蟹中进行基因分型，并对两个群体中差异显著的SNPs位点与中华绒螯蟹性早熟的关联性进行了分析。 为进行长江水系中华绒螯蟹优良品系选育，本研究利用16对微卫星引物对长江水系中华绒螯蟹3个育种基础群体（第一群体采自长江口崇明团结沙，第二群体采自长江扬中江段，第三群体采自长江靖江、六合、江浦江段）共计89个个体的遗传特征进行分析。结果表明:3个中华绒螯蟹基础群体均具有较高的遗传多样性（其总体平均期望杂合度He为0.7014）。各群体在16个微卫星位点上的观察杂合度(Ho)均高于期望杂合度(He)，第一群体、第二群体和第三群体的平均观察杂合度分别为0.7750、0.7457、0.7917，平均期望杂合度分别为0.7050、0.7029、0.6964。第一群体的平均期望杂合度最高，第三群体最低，各群体间无显著性差异(P＞0.05)。3个基础群体在16个微卫星位点上的固定指数Fis多为负值，其中第三群体的Fis最小(-0.1561)，第二群体的Fis最大(-0.0796)，提示本研究中各群体内部存在着较为明显的远缘繁殖现象。3个群体的Hardy-Weinberg平衡偏离指数(D)在-0.3794～0.9666之间，每个群体均有5个微卫星位点存在杂合子缺失现象。本研究中各群体间遗传距离介于0.0321至0.0384之间，其中第一群体与第二群体间的遗传距离最小(0.0321)，第二群体与第三群体间的遗传距离最大(0.0384)。总体来说，本次研究所选的3个基础群体遗传多样性指数均较高，适合作为选育的材料。 蜕皮抑制激素(MIH)是固醇类蜕皮激素的重要调节器，它能抑制Y-器官(YO)中蜕化类固醇的合成，并在甲壳动物蜕皮调节和胚后发育过程中发挥了非常重要的作用。已有的观测结果表明，性早熟蟹中普遍存在不正常的蜕壳现象，在此基础上，我们对中华绒螯蟹MIH基因的变异与性早熟的关联性进行了研究。对30个正常扣蟹的DNA样本进行直接测序，用以筛选MIH基因调控区和编码区的SNPs位点。结果在调控区和编码区分别筛选并鉴定出了12个SNPs和10个SNPs，其中调控区的12个SNPs中有5个SNPs(SNP A196A，SNP G230C，SNPG305C，SNP C323G和SNP T372C)位于5'-上游调控区，7个SNPs(C2677G，SNPG2759A, SNP T2807G, SNP T3032T, SNP C3042T, SNP A3088T和SNP A3095T)位于3'-UTR区;编码区的10个SNPs中有3个SNPs(SNP C422G，SNP G1714A和SNP C2529T)位于外显子区，7个SNPs(SNP C2384T，SNP C2387T，SNPT2410G，SNP G2415T，SNP T2416A，SNP A2430C和SNP C2466C)位于内含子区。采用两步法对得到的21个SNPs（SNP T3032T除外）在正常扣蟹和性早熟蟹中进行基因分型。最终我们发现MIH基因3'-UTR区的位点SNP A3088T和内含子区的位点SNP C2466C与中华绒螯蟹性早熟之间存在显著的相关性。位点SNP A3088T最终的相加模型结果为OR=1.469(95％ CI1.169-1.844，P=0.001)，而位点SNP C2466C最终的共显性模型(TT)结果为OR=0.613(95％ CI0.386-0.975，P=0.039)。除此以外，其他的19个SNPs均未表现出与中华绒螯蟹性早熟存在显著的相关性。本次研究首次对中华绒螯蟹SNP基因型与表型之间的关联性进行了分析，首次发现MIH基因上的两个位点SNP A3088T和SNPC2466C与河蟹性早熟性状之间存在着相关性，推测这些位点可作为标记用于后续的分子标记辅助育种工作，从而减少中华绒螯蟹性早熟现象的发生。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1 中华绒螯蟹种质混杂及性早熟机制研究进展

1．1 中华绒螯蟹种质混杂

1．2 中华绒螯蟹性早熟机制研究进展

2 DNA分子标记技术在水产动物遗传育种中的应用

2．1 DNA分子标记技术简介

2．2 DNA分子标记技术在水产动物遗传育种中的应用

2．3 展望

3 研究设想

第二章 中华绒螯蟹3个育种基础群体遗传特征的微卫星分析

1 材料与方法

1．1 实验材料与仪器

1．2 微卫星引物

1．3 方法

2 结果与分析

2．1 各基因位点的遗传多态

2．2 Hardy-Weinberg平衡

2．3 3个群体间的遗传分化

3 讨论

3．1 3个育种基础群体的遗传多样性

3．2 3个育种基础群体杂合子缺失现象的原因分析

3．3 3个育种基础群体的遗传结构

第三章 中华绒鳌蟹MIH基因变异及其与性早熟的关联性分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 SNPs筛选

1．3 MIH基因分型

1．4 统计分析

2 结果与分析

2．1 调控区结果

2．2 编码区结果

3 讨论

第四章 结论

参考文献

缩略词

在读期间发表的学术论文与研究成果

致谢