一种脂肪酶检测试剂和脂肪酶快速检测方法

摘要

本发明公开了一种乳品中脂肪酶快速检测试剂，包括A液、B液和标准品，其中标准品是甲氧基试卤灵，A液为PBS缓冲液，B液含有荧光底物、缓冲液、乳化剂和防腐剂。本发明还公开了使用该检测试剂快速检测乳品中脂肪酶的方法，包括标准曲线绘制、样品荧光值读取和脂肪酶活计算。本发明灵敏度高，操作简单，工作量小，系统误差小，多次试验重复性好，方便快捷，可在20～60min内得到检测结果。

说明书

技术领域

本发明涉及属于食品监测领域，涉及一种脂肪酶检测试剂及使用其检测脂肪酶的快速检测方法，特别涉及乳品如牛奶中脂肪酶的快速检测方法。

背景技术

乳制品营养丰富，是人类理想的营养食品，但同时也是微生物的良好培养基，属高危险性的食品原料。在众多微生物污染中，嗜冷菌污染是影响乳品保质期的主要因素。嗜冷菌在牛奶原料乳低温储存时会大量繁殖，虽然这些菌经过巴氏杀菌和UHT 灭菌阶段可以被杀死，但它们中的某些菌属如假单胞菌属可产生极其耐热的脂肪酶，即使经过140℃的超高温灭菌处理，仍会有少量的残留。这些残留的耐热脂肪酶在乳制品储藏的过程中被激活，水解乳制品中的脂肪球，从而导致产品品质发生变化，如脂肪上浮分层，出现苦味、腐败味、脂肪氧化味，严重影响乳品品质。消费者购买到此类问题产品时，也常会投诉公司产品质量问题。每年因此类问题引发的产品质量事故，不仅给公司带来了巨大的经济损失，同时对企业品牌带来了负面影响。快速筛查原料乳中脂肪酶酶活，控制高酶活力的原料乳进入乳制品尤其是UHT乳生产环节，可以有效地降低嗜冷菌大量繁殖所带来的产品质量隐患，提高整体产品质量，提升公司经济效益。

目前对脂肪酶的检测方法主要是采用氢氧化钠标准溶液滴定（QB/T 1803-1993），采用橄榄油和聚乙烯醇的乳化液作为底物，检测方法十分复杂，耗时较长，但结果变化大，容易产生误差。此外脂肪酶的常见检测方法还包括铜皂法和对硝基苯酚法。铜皂法是依据脂肪酸和Cu²⁺形成绿色络合物，在710nm波长处测定吸光度来进行酶活定量，铜皂法精确度较高，但是操作繁琐、稳定性不高，并且由于该方法使用大量的苯进行铜皂的萃取，容易造成污染和对人体造成伤害；对硝基苯酚法采用对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解后产生有颜色的对硝基苯酚，在420nm波长下测定吸光度进行酶活定量，对硝基苯酚法测定酶活较低的脂肪酶时偏差较大，且对硝基苯酚有毒，不适于食品检测。

发明内容

本发明是针对现有技术方法的不足，旨在提供一种方便、快速、安全和高灵敏度的脂肪酶快速检测试剂及其检测方法，尤其用于检测乳品如牛奶中的脂肪酶。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种基于荧光方法的脂肪酶的检测试剂，其包括A液、B液和标准品，其中

标准品是甲氧基试卤灵；

A液为PBS缓冲液，配方为：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄和水，pH为7.4；

B液含有荧光底物、缓冲液、乳化剂和防腐剂。

其中，所述荧光底物为1,2-氧-二月桂基-(±)丙三醇基-戊二酸-6’-甲基-试卤灵酯(CAS号为110033-82-4)，浓度可以为10μM～200μM，优选50μM～100μM。

所述B液中的缓冲液选自酒石酸缓冲液、醋酸钠缓冲液、柠檬酸钠缓冲液和甘氨酸缓冲液的一种或多种；乳化剂选自Tween(吐温) 20、Tween 40、Tween 60和Tween 80的一种或多种；防腐剂选自Proclin 150、Proclin 200、Proclin 300和叠氮化钠的一种或多种。

所述检测试剂中，A液与B液的体积比优选地可以为2:1～4:1。

在本发明中，所述检测试剂的量可以由本领域技术人员根据根据技术常识确定，当使用液体形式时，可采用不同浓度的标准品甲氧基试卤灵，比如0.1～4mM，比如100μM。

在一个实施方案中，所述B液中的缓冲液为醋酸钠缓冲液，乳化剂为Tween(吐温) 20，防腐剂为Proclin 300。

所述B液中缓冲液的浓度为1mM～20mM，优选的浓度为1.5mM～10mM；pH为3.0～6.0，优选的pH为4.0～5.0。所述的乳化剂的浓度为1/5000～1/500，优选的浓度为1/2000～1/800。所述防腐剂的浓度为1/10000～1/1000，优选的浓度为1/5000～1/2000。

在一个实施方案中，所述B液中缓冲液的浓度为5mM，pH为4.0，乳化剂的浓度为1/1000，防腐剂的浓度为1/5000。

本发明还提供一种试剂盒，其包括上述任一种方案中所述的检测试剂。

本发明所述的检测试剂或试剂盒，用于检测乳品中的脂肪酶，所述乳品可以选自原料乳、巴氏乳、UHT乳、复原乳及乳粉。

在本发明中，原料乳是指从符合国家有关要求的健康奶畜乳房中挤出的无任何成分改变的常乳。巴氏乳是指仅以生牛（羊）乳为原料，经巴氏杀菌等工序制得的液体产品。UHT乳是指以生牛（羊）乳为原料，添加或不添加复原乳，在连续流动的状态下，加热到至少132℃并保持很短时间的灭菌，再经无菌灌装等工序制成的液体产品。复原乳是指炼乳或/和全脂乳粉与水勾兑成的原料乳。乳粉是指以生牛（羊）乳为原料，经加工制成的粉状产品。

本发明还提供了一种使用前述检测试剂检测乳品中脂肪酶酶活的方法，其包括以下步骤：

1）          将A液与B液按2:1～4:1的体积比例混合，配制成工作液C； 

2）          分别加入5，10，15，20μL标准品到96孔酶标板中，每孔中再分别加入100～200μL工作液C，混合均匀，空白对照为对应体积的工作液C；

3）          将酶标板放入25～37℃预热好的荧光酶标仪中，用激发波长510～550nm，优选520～540nm激发，在发射波长580～620nm，优选590nm～610nm处检测，读取荧光值，记录为A_标，空白对照记录为A_空，以标准品荧光值（A_标-A_空）为纵坐标（单位为RFU），以标准品的体积为横坐标（单位为μL），绘制标准曲线；

4）          加入2～20μL乳品样品到96孔酶标板中，每孔中再分别加入100～200μL工作液C，混合均匀，空白对照为对应体积的工作液C；

5）          将酶标板放入25～37℃预热好的荧光酶标仪中，用激发波长510～550nm，优选520～540nm激发，在发射波长580～620nm，优选590nm～610nm处检测，读取荧光值，记录为A1_样，空白对照记录为A1_空，孵育20～60min，优选30～60min之后再次读取荧光值，记录为A2_样，空白对照记录为A2_空；

6）          将样本的荧光值[A_样=(A2_样-A2_空)-(A1_样-A1_空)]代入标准曲线中，从标准曲线上读出该样品所对应的标准品体积，带入下述计算公式即得到样品脂肪酶酶活；

计算公式为：

其中B为样品在标准曲线上所对应的标准品体积（μL）

n为标准品的浓度（μM）

v为加入样品的体积（μL）

t为样品孵育的时间（min）

在本发明中，酶活定义：一定温度下每分钟水解底物得到1μmol的荧光物质，定义为1个脂肪酶活力单位。

在本发明的检测方法中，当乳品样品为乳粉时，对乳粉进行8倍溶解，即称取100g乳粉，加入700ml超纯水进行溶解。

本发明具有如下优点：

1）              本发明基于荧光检测方法，荧光物选择甲氧基试卤灵，甲氧基试卤灵是荧光物试卤灵的甲基醚衍生物，与试卤灵相比，在稳定性和灵敏度方面都有显著提高；

2）              甲氧基试卤灵的发射波长在580～650nm，酸性条件下激发波长为450～550nm，碱性条件下激发波长为550～580nm，考虑到碱性条件下甲氧基试卤灵的激发波长和发射波长过于接近，选择在酸性条件下对甲氧基试卤灵进行激发，同时为了避开乳品在450～500nm处的干扰，选择甲氧基试卤灵的激发波长为510～550nm，优选520～540nm；

3）              荧光底物为脂肪酸与甲氧基试卤灵的偶联产物，偶联状态下，甲氧基试卤灵的荧光被淬灭，当脂肪酶切割荧光底物后，释放出来自由的甲氧基试卤灵，从而发出荧光，通过检测释放出来的甲氧基试卤灵的量即可较准确计算出脂肪酶的酶活；

4）              本发明的灵敏度高，显示的荧光强度强，可以准确快速检出乳品中的脂肪酶；

5）              乳品对本发明的检测无干扰，无需对乳品进行前处理； 

6）              操作简单，工作量小，检测结果准确，系统误差小，多次试验重复性好；

7）              方便快捷，检测速度快，整个检测过程可在20～60min内完成，大大节省了检测时间；

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1为根据实施例2绘制的标准曲线

图2为根据实施例5绘制的标准曲线

具体实施方式

如下采用具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步详细说明，但应当理解本发明技术方案不限于以下所列举具体实施方式，任何根据本发明的原理所做的改变或替代都应当落入本发明的范围之内。

本发明的说明书，尤其是实施例中所使用的材料、试剂、装置等，如没有特别地指出，均是从商业可购得的或本领域常规使用的。

实施例1：工作液C的配制

1）              称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.42g和KH₂PO₄ 0.27g，加800ml超纯水溶解，用超纯水定容至1L，高温灭菌后即配制为A液，4℃保存；

2）              取2.5ml 1.5mM的1,2-氧-二月桂基-(±)丙三醇基-戊二酸-6’-甲基-试卤灵酯，150μl 0.5M的醋酸钠pH 4.0缓冲液，25μl Tween 20和10μl Proclin 300，加水定容至50ml，即配制为B液，4℃避光保存； 

3）              将A液与B液按2:1的体积比例混合，配制成工作液C。

 

实施例2：标准曲线绘制

1）              分别加入5，10，15，20μL 浓度为100μM的标准品到96孔酶标板中，每孔中再分别加入200μL按照实施例1制备的工作液C，混合均匀，空白对照为对应体积的工作液C；

2）              将酶标板放入37℃预热好的荧光酶标仪中，用激发波长520nm激发，在发射波长610nm处检测，读取荧光值为A_标，空白对照为A_空，以标准品荧光值（A_标-A_空）为纵坐标（单位为RFU），以标准品的体积为横坐标（单位为μL），绘制标准曲线。

得到的标准曲线如图1所示，标准曲线线性很好，线性方程为y=2.58x，相关系数R2为0.998。

 

实施例3：原料乳及巴氏乳脂肪酶酶活测定

1）              取2个原料乳样品，命名为1#和2#，取一个巴氏乳样品，命名为3#；

2）              分别加入10μL样品到96孔酶标板中，每孔中再分别加入200μL工作液C，混合均匀，空白对照为对应体积的工作液C；

3）              将酶标板放入37℃预热好的荧光酶标仪中，用激发波长520nm激发，在发射波长610nm处检测，读取荧光值，记录为A1_样，空白对照记录为A1_空；孵育40min之后再次读取荧光值，记录为A2_样，空白对照记录为A2_空；

4）              将样本的荧光值[A_样=(A2_样-A2_空)-(A1_样-A1_空)]代入标准曲线中，从标准曲线上读出该样品所对应的标准品体积(B)，带入下述计算公式即得到样品脂肪酶酶活：

其中B为样品在标准曲线上所对应的标准品体积（μL）

n为标准品的浓度（100μmol/L）

v为加入样品的体积（μL）

t为样品孵育的时间（min）

酶活定义：37℃下每分钟水解底物得到1μmol的荧光物质，定义为1个脂肪酶活力单位。

 

检测得到的荧光值数据如下表，荧光值单位为RFU

 空白对照1#2#3#0min14015213212440min199587516340

根据实施例1得到的标准曲线y=2.58x，三个样品对应的标准品体积分别为146μL、126μL和61μL。按照公式计算，1#原料乳的脂肪酶活力为36U/L，2#原料乳的脂肪酶活力为31U/L，3#巴氏乳的脂肪酶活力为15U/L。

 

实施例4：工作液C的配制

1）              称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.42g和KH2PO4 0.27g，加800ml超纯水溶解，用超纯水定容至1L，高温灭菌后即配制为A液，4℃保存；

2）              取3.3ml 1.5mM的1,2-氧-二月桂基-(±)丙三醇基-戊二酸-6’-甲基-试卤灵酯，1000μl 0.5M的柠檬酸钠pH 5.0缓冲液，50μl Tween 20和25μl Proclin 300，加水定容至50ml，即配制为B液，4℃避光保存； 

3）              将A液与B液按4:1的体积比例混合，配制成工作液C。

 

实施例5：标准曲线绘制

1）              分别加入5，10，15，20μL 浓度为100μM的标准品到96孔酶标板中，每孔中再分别加入200μL按照实施例1制备的工作液C，混合均匀，空白对照为对应体积的工作液C；

2）              将酶标板放入37℃预热好的荧光酶标仪中，用激发波长540nm激发，在发射波长590nm处检测，读取荧光值为A_标，空白对照为A_空，以标准品荧光值（A_标-A_空）为纵坐标（单位为RFU），以标准品的体积为横坐标（单位为μL），绘制标准曲线。

得到的标准曲线如图2所示，标准曲线线性很好，线性方程为y=2.346x，相关系数R2为0.999。

 

显然，上述实施例仅仅是为了示例性阐述本发明的方案，而不以任何方式限制本发明的方案。对于所属领域的普通技术人员来说，在没有背离本发明的精神和范围下，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。