利用具有溶胶-凝胶转变特性的聚合物制备微球的方法以及由此制备的微球

摘要

本发明提供利用具有溶胶-凝胶转变特性的聚合物来制备微球的方法以及由此制备的微球，更具体地说，本发明提供利用具有溶胶-凝胶转变特性的聚合物制备微球的方法以及由此制备的微球，通过利用具有溶胶-凝胶制备特性的聚合物作为包含在水性介质中的表面活性剂，所述水性介质中注入初级乳液，并利用作为表面活性剂的聚合物的溶胶-凝胶特性来使注入初级乳液后形成的二级乳液胶凝化，能防止载体聚合物溶液中的溶剂在微球形成期间过快扩散入水性介质，以便降低微球的孔隙率，降低微球的表面粗糙度，从而获得具有球状形貌的微球，并且能提高生物活性物质的包封率。

说明书

技术领域

本发明涉及利用具有溶胶-凝胶转变特性(sol-gel transition property)的聚合 物制备微球的方法以及由此制备的微球；更具体地说，本发明涉及利用具有溶 胶-凝胶转变特性的聚合物制备微球的方法以及由此制备的微球，通过利用具有 溶胶-凝胶制备特性的聚合物作为包含在水性介质中的表面活性剂，所述水性介 质中注入初级乳液(primary emulsion)，并利用作为表面活性剂的聚合物的溶胶- 凝胶特性来使注入初级乳液后形成的二级乳液胶凝化，这样能防止载体聚合物 溶液中的溶剂在微球形成期间快速扩散入水性介质，以便降低微球的孔隙率， 降低微球的表面粗糙度，从而获得具有球状形貌的微球，并且能提高生物活性 物质的包封率(encapsulation ratio)。

背景技术

作为颗粒制备技术，通用制备方法包括双乳化法(W/O/W)、相分离法、喷 雾干燥法、超临界流体(SCF)法，等等。近年来，开发了制备单分散颗粒 (monodispersed particle)的方法，借助该方法能制备均匀的颗粒。

双乳化法的代表性例子包括制备细颗粒的方法，包括将生物可降解的载体 溶解在溶剂中并将水溶性药物溶解于水相以形成初级乳液，然后将初级乳液注 射入溶解有聚(乙烯醇)(PVA)的二级溶液以形成颗粒。武田公司(Takeda corporation)注册了关于双乳化法的专利(US4652441)，并在大规模生产和商业 化后提交了许多关于双乳化法的其它专利申请。具体地说，现已开发了制备细 颗粒的方法，通过优化构成细颗粒的聚合物的组成、分子量、末端基团改变等 特征，使药物的包封率得到提高并表现出初始释放控制(initial release control)， 就包裹水溶性药物而言，这些方法是已知的最适合方法。然而，就缺点而言， 颗粒因为制备过程中的温度、浓度和搅拌速度而显示出一定孔隙率，从而导致 初始药物释放率升高而药物包封率降低。此外，就溶解聚合物的溶剂而言，利 用了具有高毒性的二氯甲烷，而其水溶性低到20g/L(20℃)。由于要利用水溶 性低的有机溶剂来有效包裹水溶性药物，因此用于溶解聚合物的可选溶剂十分 有限。

至于相分离法，第一个专利提交于1984年(US4460563)，其相关的产品包 括Somatuline LA。该相分离法是一种分离方法，包括在含硅油等的凝聚层 (coacervate)中形成初级乳液，然后通过固化聚合物来形成颗粒。近年来，相分 离法的技术趋势是根据凝聚层的pH、温度和组成来控制细颗粒的粒径、包封率 等等。相分离法的优点在于可仅仅通过控制化学组成来控制粒径而无需专门的 设备。然而，其缺点在于需要利用大量的溶剂，在形成凝聚层时参数过多。

喷雾法是通过在热空气中喷雾初级乳液而形成细颗粒的方法。阿克美斯公 司(Alkermes Corporation)开发了这样一种方法，在热空气中喷雾初级乳液以弥 补所用的包裹药物有限的不足，利用LN2猝灭，用乙醇提取。开发出冷冻-喷雾 干燥法之后，迄今为止又开发了类似的技术。现已开发了各种形状的喷嘴，利 用喷雾器、电极、超声波仪等也可形成细小且均匀的颗粒。喷雾干燥法的优点 在于易于大规模生产颗粒，但其缺点在于其难以形成球状形貌颗粒，并且除了 在冷冻-喷雾干燥法中，初级乳液需要在热空气中喷雾。

超临界流体(SCF)提取方法是利用代表性的超临界流体CO₂作为反溶剂，将 初级乳液与超临界流体一起喷雾的技术。SCF提取方法的优点在于其环境友好， 不需要除去残留溶剂等额外步骤，但缺点在于其在大规模生产中难以控制粒径 分布。

当采用常规双乳化法制备颗粒时，通过将初级乳液注入水性介质并将初级 乳液中所用的溶剂分散入该水性介质以形成颗粒的步骤在制备颗粒中至关重 要。在该步骤中，溶剂分散入水性介质的速度决定了细颗粒的粒径、孔隙率、 表面粗糙度、包封率等特性。溶剂的类型、溶剂的水溶性、水性介质的温度以 及形成水性介质的表面活性剂的种类、浓度、搅拌速度等特性决定了溶剂分散 速度。

在以上步骤中，为提高溶剂分散入水性介质的速度，可采用选择具有高水 溶性的溶剂、提高水性介质温度、降低形成水性介质的表面活性剂的浓度等的 方法。溶剂分散速度提高时，构成载体的聚合物的固化时间缩短，因此，颗粒 的孔隙率增加，粒径较大，包封率降低。所以，具有高水溶性的溶剂，例如乙 酸乙酯可较快速地分散入水性介质，从而造成难以形成球状形貌、包封率低和 易于形成多孔颗粒。因此，当利用具有高水溶性的溶剂时，提高水性介质的浓 度或降低温度来防止溶剂过快扩散入水性介质。US6565777公开了利用乙酸乙 酯制备细颗粒的多步骤方法。该方法首先减少水性介质的体积以防止乙酸乙酯 过快分散入水性介质，然后形成细颗粒，再用大量水性介质稀释颗粒并蒸发残 留溶剂，从而形成颗粒。然而，其不利之处在于产率降低到10-20%。因此，为 了能通过各种方法形成颗粒而不用限制溶剂，急需能控制溶剂分散时间的技 术。

为固化聚合物并将溶剂分散入水性介质，通常进行搅拌操作。搅拌操作包 括，例如在室温下搅拌、加热搅拌、压力搅拌(pressure stirring)等方法。在室温 下搅拌的情况中，大规模生产期间的搅拌时间增加，水溶性药物在长时间搅拌 后释放，从而导致包封率降低。加热搅拌期间，聚合物的固化速度升高，搅拌 时间缩短，但聚合物表现出多孔性，且其含量降低。在压力搅拌期间，溶剂在 分散入水性介质的同时因压力而蒸发，因此，溶剂可快速蒸发，进而可制备符 合药物残留溶剂标准的细颗粒。然而，在压力搅拌期间，如果反应体积很大， 则难以达到所需的真空，真空度降低，则需要小心处理聚合物以防止在真空控 制下搅拌期间的溶剂形成气泡。特别是，如果加入了表面活性剂，则起泡现象 更严重，因此，需要维持操作条件以控制真空压力。为解决这些问题，US 7029700中采用冷却整个水性介质并减压除去溶剂的方法。此外，US6020004 公开了通过冷却和冷冻干燥初级乳液来获得微球的制备方法。

在这种背景下，本发明人证实通过以下方法可获得具有球状形貌的微球： 利用具有溶胶-凝胶转变特性的聚合物作为包含在注入初级乳液的水性介质中 的表面活性剂，以使注入初级乳液后形成的二级乳液凝胶化，藉此防止微球状 形貌成期间载体聚合物溶液中的溶剂过快分散入水性介质，从而降低微球的孔 隙率，降低微球的表面粗糙度，还易于实现微球的高包封率而对溶剂选择、或 其它搅拌或溶剂蒸发操作没有限制。因此，本发明基于这些事实得以完成。此 外，在本发明的制备微球的方法中，由于可以在二级乳液与初级乳液的低体积 比下获得所需量的微球，可通过降低反应体积来提高本发明方法的效率。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供制备微球的方法，所述方法能获得具有球状形貌的细 颗粒，以及提高生物活性物质的包封率。

本发明的另一目的是提供所述制备方法制备的微球。

本发明还有另一目的是提供含有所述微球作为活性组分的药物递送系统。

技术方案

为解决现有技术中的问题，本发明提供制备微球的方法，其中生物活性物 质包封在载体聚合物中。所述方法包括以下步骤：

1)通过将初级乳液注入水性介质来形成二级乳液，在所述初级乳液中生物 活性物质与载体聚合物混合，而在所述水性介质中溶解有具有溶胶-凝胶转变特 性的聚合物(步骤1)；和

2)对所述二级乳液进行胶凝反应(步骤2)。

优选地，制备微球的方法还可包括在步骤2)后除去残留溶剂和水性介质并 收集微球的步骤(步骤3)。

本发明的特征在于，通过利用具有溶胶-凝胶转变特性的聚合物作为包含在 水性介质中的表面活性剂，所述水性介质中注入初级乳液，并利用作为表面活 性剂的该聚合物的溶胶-凝胶转变特性来使注入初级乳液后形成的二级乳液凝 胶化，从而防止微球形成过程中载体聚合物溶液中的溶剂过快分散入水性介 质，以便降低微球的孔隙率以及降低微球的表面粗糙度，获得具有球状形貌的 微球，并且能提高生物活性物质的包封率。

此外，本发明的技术效果在于对溶剂没有限制，因为采用上述使二级乳液 胶凝的方法，可利用具有高水溶性的任何溶剂。

此外，本发明的特征在于，通过完全蒸发残留溶剂和水性介质，例如采用 真空干燥方法等，可快速除去残留溶剂和水性介质，而在胶凝后除去残留溶剂 和水性介质的步骤无需搅拌操作，通过完全干燥水性介质而不作清洗过程，可 任选利用水性介质本身。

此外，由于快速蒸发溶剂而不搅拌，尽管反应体积小，依然可以实现优秀 的包封率。由于反应体积显著降低，本发明可方便地应用于大规模生产。

此外，本发明的技术效果在于通过控制包含在水性介质中、具有溶胶-凝胶 转变特性的表面活性剂聚合物的浓度可控制粒径。

对于初级乳液注入水性介质形成二级乳液的步骤，其中，所述初级乳液中 生物活性物质和载体聚合物混合，而所述水性介质中溶解有具有溶胶-凝胶转变 特性的聚合物，步骤1是要通过以下方式形成二级乳液：将包含生物活性物质 和载体聚合物的初级乳液注入某溶液，所述溶液中具有溶胶-凝胶转变特性的聚 合物作为表面活性剂溶解在水性介质中。

本发明所用的术语“生物活性物质”表示这样一种物质，用于修正参与体 内功能调节的某物质缺乏或过度分泌导致的异常情况，例如在生物体维持生命 的同时改善或抑制活体功能的物质。

在本发明中，生物活性物质可以是选自下组中的至少一种：促黄体生成素 释放激素(luteinizing hormone-release hormone，LHRH)同系物、它们的肽及盐。 详细地说，在这些生物活性物质中，可利用戈舍瑞林(goserelin)、乙酸亮丙瑞林 (leuprolide acetate)、曲谱瑞林(triptorelin)、布舍瑞林(buserelin)、那法瑞林 (nafarelin)等作为LHRH同系物的激动剂，西曲瑞克(cetrorelix)、阿吉泰得(argitide) 等可用作拮抗剂。此外，水溶性和水不溶性药物，例如蛋白质、DNA和化学药 物均可用作生物活性物质而没有限制。进一步地，可单独使用所述生物活性物 质或其中两种或更多种联用。

按照本发明，由于载体聚合物溶液的溶剂分散入水性介质受到上述胶凝反 应的控制，用于溶解载体聚合物的溶剂种类无需特别限制。例如，在本发明中， 可将载体聚合物溶解于选自下组中的至少一种溶剂来制备初级乳液：二氯甲 烷、氯仿、乙腈、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和乙酸乙酯，但本发明不限于此。

本发明所用的术语“载体聚合物”表示用于携带生物活性物质以便递送所 述生物活性物质的聚合物。

在本发明中，可利用常规聚合物作为载体聚合物。优选地，载体聚合物可 以是生物可降解聚合物。详细地说，载体聚合物可以是选自下组中的至少一种： 聚酯，例如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、 聚原酸酯、聚酸酐、聚氨基酸(polyaminoacid)、聚缩醛(polyacetal)、聚氰基丙 烯酸酯(polycyanoacrylate)、聚己内酯(polycaprolactone)、聚对二氧环己酮 (polydioxanone)、聚亚烷基烷基化物(polyalkylene alkylate)等，但本发明不限于 此。

在本发明中，步骤1)中可用的水性介质的例子可包括水，但不限于水。例 如，可利用所有可以溶解药物的溶剂。

对于双乳化法，通常在二级乳液中加入表面活性剂以促进颗粒形成。最典 型的例子是聚(乙烯醇)，是一种非离子型表面活性剂。可利用聚山梨醇酯 (Polysorbate)、泊洛沙姆(poloxamer)、聚乙二醇等，但本发明不限于此。本发明 开发了一种制备方法，该方法包括通过下述方式以形成颗粒：利用具有溶胶- 凝胶转变特性的聚合物作为表面活性剂而非常规表面活性剂，并使颗粒胶凝化 以便快速蒸发溶剂。一般情况下，当初级乳液注入二级乳液中时，载体聚合物 快速固化，二级乳液的体积需要达到初级乳液体积的100-200倍或更高以便蒸发 溶剂。当体积比较低时，载体聚合物的固化速度降低。药物的包封效率随之降 低。在本发明中，体积比是约10-20倍，但由于二级乳液经胶凝，溶剂可快速蒸 发而无需搅拌，即使反应体积很小，包封效率依然得到提高。

本发明所用的术语“具有溶胶-凝胶转变特性”表示可通过特定刺激将溶胶 态转变成凝胶状态的聚合物。所述特定刺激可依据聚合物的种类而有所不同， 可以包括，例如温度改变、压力改变、pH改变或加入盐等，但本发明不限于此。

在本发明中，可用的具有溶胶-凝胶转变特性的聚合物没有限制，只要它们 能进行溶胶-凝胶转变并有利于形成颗粒。详细地说，具有溶胶-凝胶转变特性 的聚合物可以是选自下组中的至少一种：甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素 (HPMC)、二乙基羟基纤维素(EHEC)、木葡聚糖(xyloglucan)、壳聚糖、聚(N- 异丙基酰胺)(PNIPAM)、N-异丙基酰胺-co-丙烯酸共聚物、泊洛沙姆 (PEO-PPO-PEO)、泊洛沙姆-g-PAA、PAA-g-泊洛沙姆、PEO-PLGA-PEO、和聚 (乙烯醇)。

作为对二级乳液进行胶凝反应的步骤，步骤2)是要使二级乳液胶凝化以降 低溶剂分散入水性介质的分散速度。

在步骤2)中，通过二级乳液的胶凝，溶剂的溶解度快速降低，因此，可形 成颗粒而无论溶剂的种类。

在步骤2)中，可根据用于步骤1)中具有溶剂-凝胶聚合物的种类，通过已知 的方法适当实施胶凝反应。例如，在甲基纤维素的实例中，可以通过加入合适 浓度的NaCl或加入NaCl并加热来胶凝二级乳液，在泊洛沙姆的实例中，可优选 加热至35-50℃、最优选40℃来使二级乳液胶凝化，加热温度可根据泊洛沙姆的 种类和浓度而有所不同。此外，在羟丙基甲基纤维素(HPMC)、二乙基羟基纤 维素(EHEC)、木葡聚糖、壳聚糖、聚(N-异丙基酰胺)(PNIPAM)、N-异丙基酰 胺-co-丙烯酸共聚物、泊洛沙姆-g-PAA、PAA-g-泊洛沙姆、PEO-PLGA-PEO、 和聚(乙烯醇)的实例中，可通过适于胶凝反应的浓度以及温度下来加热胶凝二 级乳液。在一些情况中，可任选加入添加剂，例如NaCl，并视情况控制pH。

作为通过除去残留溶剂和水性介质来收集微球的步骤，步骤3)是要通过除 去胶凝材料中的溶剂来收集微球。

优选地，可采用真空干燥方法实施步骤3)的除去残留溶剂和水性介质。详 细地说，可通过在0-0.99Torr的真空下蒸发溶剂来实施真空干燥方法。

在步骤3)中，可采用真空干燥方法，通过完全蒸发残留溶剂和水性介质来 快速除去残留溶剂和水性介质，在一些情况中，通过完全干燥水性介质而不进 行清洗过程，可利用水性介质本身。如此，根据本发明的制备方法，由于可以 省去通常进行以除去溶剂的搅拌过程，可能克服双乳化法中包封率因所包裹的 药物在搅拌过程中释放而降低，或残留溶剂存留的缺点。

本发明制备方法的另一优点是可溶解形成微球的载体聚合物的溶剂不受 限制。如果在常规双乳化法中利用因高水溶性而具有高混溶性的乙酸乙酯、丙 酮等，不会形成球状形貌，或者包封率非常低，约低于50%。作为原因有各种 各样的因素存在，但其中，是因为在微球形成球状形貌之前，溶剂就快速分散 入水性介质。为形成球状形貌并提高包封率，需要降低溶剂的水溶性。在本发 明中，将具有溶胶-凝胶转变特性的聚合物以合适浓度溶解于水性介质中，将初 级乳液注射入其中以形成二级乳液，然后二级乳液完全胶凝以降低溶剂的溶解 度。通过该制备方法，采用了乙酸乙酯的优点就在于包封率为70-100wt%，并 可均匀形成粒径在5-10μm的颗粒。

此外，通过控制具有溶胶-凝胶转变特性的聚合物的浓度可形成粒径在1-10 μm的均匀、细小的颗粒。此外，在形成二级乳液时，反应体积可以显著降低至 常规制备方法的1/10-1/20，因此，对于大规模生成极为有利。

此外，本发明提供通过本发明方法制备的微球，其中生物活性物质包封在 载体聚合物中。

即，通过乳化载体聚合物和生物活性物质及具有溶胶-凝胶转变特性的聚合 物来形成生物活性物质包封在载体聚合物中的本发明微球。

此外，本发明提供包含该微球作为活性组分的药物递送系统。

在本发明中，所述药物递送系统可包含药学上可接受的载体和pH调节剂。

在本发明中，所述药物递送系统可以是注射剂的形式，但本发明不限于此。

在本发明中，当所述药物递送系统是注射剂的形式，所述药学上可接受的 载体是注射用水，所述pH调节剂是酸，例如盐酸，或碱，例如氢氧化钠。在该 情况中，可以优选将注射剂的pH调节至约6.0-8.0，更优选约7.2-7.8。

此外，本发明提供生物活性物质包封在载体聚合物中的微球。在本文中， 借助具有溶胶-凝胶转变特性的聚合物，通过乳化载体聚合物与生物活性物质以 形成微球。

在本发明中，对载体聚合物、生物活性物质和具有溶胶-凝胶转变特性的聚 合物的描述方式与微球制备方法的描述方式相同。

本发明的技术效果

根据本发明，可在微球形成前防止载体聚合物溶液的溶剂过快分散入水性 介质来降低微球的孔隙率和降低微球的表面粗糙度，从而获得具有球状形貌的 微球；而生物活性物质的包封率可以通过以下方式提高：将包含生物活性物质 的水性溶液和溶解于溶剂中的载体聚合物溶液的初级乳液注入水性介质中具 有溶胶-凝胶转变特性的聚合物的溶液以形成二级乳液，然后胶凝所述二级乳液 并除去溶剂来收集微球。此外，通过完全胶凝二级乳液的方法可以利用高水溶 性的溶剂而不受其限制。此外，在胶凝反应后除去溶剂期间，采用真空干燥方 法，通过蒸发残留溶剂和整体水性介质可快速除去残留溶剂和水性介质，在一 些情况中，通过完全干燥水性介质而不进行清洗过程，可利用水性介质本身。 此外，通过控制包含在水性介质中，具有溶胶-凝胶转变特性的聚合物的浓度可 控制粒径，而可以省去搅拌操作。此外，颗粒的反应体积可以显著降低，因此， 易于大规模生产颗粒。

附图说明

图1是实施例2和5及对比例2制备的微球表面的扫描电子显微镜(SEM)照 片。在此情况中，图1A代表实施例2中利用甲基纤维素制备的微球，图1B代表 实施例5中利用泊洛沙姆制备的微球，图1C代表对比例2的微球。

图2显示了实施例1-5所制备微球的体外释放测试结果。在此情况中，▲代 表实施例1的微球，□代表实施例2的微球，○代表实施例3的微球，◆代表实 施例4的微球，和■代表实施例5的微球。

具体实施方式

下文将参考实施例更详细地描述本发明的构思和效果，但这些实施例仅仅 是要示范本发明，本发明的范围不仅限于这些实施例。

实施例1：采用甲基纤维素的胶凝反应制备含有乙酸亮丙瑞林的微球

将100mg乙酸亮丙瑞林溶解于100μl蒸馏水中，然后与其中900mg PLGA (Resomer RG502H)溶解于1mL乙酸乙酯的聚合物溶液混合来制备初级乳液。利 用均质器将制备的初级乳液分散在含有预先制备的10%甲基纤维素的20mL蒸 馏水溶液中。二级乳液形成，然后通过加入1g NaCl并将温度升高到40℃来进 行胶凝反应。真空条件下，除去残留溶剂和介质2小时以制备固化的微球。用 蒸馏水洗涤制备的微球数次，然后冷冻干燥。

实施例2：采用甲基纤维素的胶凝反应制备含有乙酸亮丙瑞林的微球

将90mg乙酸亮丙瑞林溶解于100μl蒸馏水中，然后与其中810mg PLGA (Resomer RG502H)溶解于1mL乙酸乙酯的聚合物溶液混合来制备初级乳液。利 用均质器将制备的初级乳液分散在含有预先制备的7.5%甲基纤维素的20mL蒸 馏水溶液中。二级乳液形成，然后通过加入1g NaCl并将温度升高到40℃来进 行胶凝反应。真空条件下，除去残留溶剂和介质2小时以制备固化的微球。用 蒸馏水洗涤制备的微球数次，然后冷冻干燥。

实施例3：采用甲基纤维素的胶凝反应制备含有乙酸亮丙瑞林的微球

将160mg乙酸亮丙瑞林溶解于100μl蒸馏水中，然后与其中640mg PLGA (Resomer RG502H)溶解于1mL乙酸乙酯的聚合物溶液混合来制备初级乳液。利 用均质器将制备的初级乳液分散在含有预先制备的7.5%甲基纤维素的20mL蒸 馏水溶液中。二级乳液形成，然后通过加入1g NaCl并将温度升高到40℃来进 行胶凝反应。真空条件下，除去残留溶剂和介质2小时以制备固化的微球。用 蒸馏水洗涤制备的微球数次，然后冷冻干燥。

实施例4：采用甲基纤维素的胶凝反应制备含有乙酸亮丙瑞林的微球

将160mg乙酸亮丙瑞林溶解于150μl蒸馏水中，然后与其中640mg PLGA (Lakeshore5050DLG2A)溶解于1mL乙酸乙酯的聚合物溶液混合来制备初级乳 液。利用均质器将制备的初级乳液分散在含有预先制备的7.5%甲基纤维素的20 mL蒸馏水溶液中。二级乳液形成，然后通过加入1g NaCl并将温度升高到40℃ 来进行胶凝反应。真空条件下，除去残留溶剂和介质2小时以制备固化的微球。 用蒸馏水洗涤制备的微球数次，然后冷冻干燥。

实施例5：采用泊洛沙姆的胶凝反应制备含有乙酸亮丙瑞林的微球

将100mg乙酸亮丙瑞林溶解于100μl蒸馏水中，然后与其中900mg PLGA (PLGA5005)溶解于1mL乙酸乙酯的聚合物溶液混合来制备初级乳液。利用均质 器将制备的初级乳液分散在含有预先制备的18%泊洛沙姆(泊洛沙姆407)的20 mL蒸馏水溶液中。二级乳液形成，然后通过将温度升高到40℃来进行胶凝反应。 随后在真空条件下，除去残留溶剂和介质2小时以制备固化的微球。用蒸馏水 洗涤制备的微球数次，然后冷冻干燥。

实施例6：采用泊洛沙姆的胶凝反应制备含有乙酸亮丙瑞林的微球

将60mg乙酸亮丙瑞林溶解于100μl蒸馏水中，然后与其中540mg PLGA (Resomer RG502H)溶解于1mL乙酸乙酯的聚合物溶液混合来制备初级乳液。利 用均质器将制备的初级乳液分散在含有预先制备的18%泊洛沙姆(泊洛沙姆407) 的20mL蒸馏水溶液中。二级乳液形成，然后通过将温度升高到40℃来进行胶 凝反应。随后在真空条件下，除去残留溶剂和介质2小时以制备固化的微球。 用蒸馏水洗涤制备的微球数次，然后冷冻干燥。

实施例7：采用泊洛沙姆的胶凝反应制备含有乙酸亮丙瑞林的微球

将200mg乙酸亮丙瑞林溶解于300μl蒸馏水中，然后与其中800mg PLGA (Resomer RG502H)溶解于3mL乙酸乙酯的聚合物溶液混合来制备初级乳液。利 用均质器将制备的初级乳液分散在含有预先制备的20%泊洛沙姆(泊洛沙姆407) 的20mL蒸馏水溶液中。二级乳液形成，然后通过将温度升高到40℃来进行胶 凝反应。随后在真空条件下，除去残留溶剂和介质2小时以制备固化的微球。 用蒸馏水洗涤制备的微球数次，然后冷冻干燥。

对比例1：采用常规双乳化法制备含有乙酸亮丙瑞林的微球

将50mg乙酸亮丙瑞林溶解于100μl蒸馏水中，然后与其中450mg PLGA (Lakeshore7525DLPLG2A)溶解于1mL二氯甲烷的聚合物溶液混合来制备初级 乳液。利用均质器将制备的初级乳液分散在含有预先制备的1%聚乙烯醇(分子 量30,000-50,000)的200mL蒸馏水溶液中。二级乳液形成，然后搅拌2小时以除 去残留溶剂和水性介质。用蒸馏水洗涤固化的微球数次，然后冷冻干燥。

对比例2：采用常规双乳化法制备含有乙酸亮丙瑞林的微球

将100mg乙酸亮丙瑞林溶解于100μl蒸馏水中，然后与其中900mg PLGA (Lakeshore7525DLPLG2A)溶解于1mL二氯甲烷的聚合物溶液混合来制备初级 乳液。利用均质器将制备的初级乳液分散在含有预先制备的1%聚乙烯醇(分子 量30,000-50,000)的350mL蒸馏水溶液中。二级乳液形成，然后搅拌2小时以除 去残留溶剂和水性介质。用蒸馏水洗涤固化的微球数次，然后冷冻干燥。

对比例3：利用乙酸乙酯作为聚合物溶剂来制备含有乙酸亮丙瑞林的微球

当通过对比例1和2的方法，用乙酸乙酯制备微球时，没有形成球形颗粒， 且包封率低于10%。因此，可以看出常规双乳化法未制备得到微球。所以，为 用乙酸乙酯制备微球，本对比例中采用形成微球的多步骤方法。将50mg乙酸 亮丙瑞林溶解于100μl蒸馏水中，然后与其中500mg PLGA(Lakeshore 7525DLPLG2A)溶解于1mL二氯甲烷的聚合物溶液混合来制备初级乳液。利用 均质器将制备的初级乳液分散在含有预先制备的1%聚乙烯醇(分子量 30,000-50,000)和10%NaCl的6mL蒸馏水溶液中。将形成的二级乳液加入含有 1%聚乙烯醇和10%NaCl的10mL蒸馏水溶液以形成三级乳液，将该三级乳液加 入含有1%聚乙烯醇和10%NaCl的200mL蒸馏水中并搅拌3小时。用蒸馏水洗涤 固化的微球数次，然后冷冻干燥。

实施例1-7及对比例1和2所制备微球的组分和含量总结于下表1。

表1

实验实施例1：测定含有乙酸亮丙瑞林的微球的表面形状

在扫描电子显微镜(SEM)下观察实施例2和5及对比例2制备的微球娥表面。 检测结果分别示于图1A、1B和1C。

从检测结果可以看出，采用甲基纤维素和泊洛沙姆的胶凝反应的实施例2 和5所得微球因微球表面的孔隙率低而具有较平滑的表面，并显示均匀的粒径 分布。相比之下，在利用聚(乙烯醇)通过常规双乳化法制备微球的情况中，观 察到表面的孔隙率较大，它们的表面不平整，还观察到具有不规则形状的较大 颗粒。

同时发现，与实施例2、3和4制备的微球相比，实施例1和5制备的微球具 有较小粒径(未示出)。

实验实施例2：检测乙酸亮丙瑞林微球的包封量

为测定药物的包封率，将预定量的微球完全溶解于二甲基亚砜(DMSO)， 然后经注射过滤器过滤待用作测试液，采用HPLC检测包封在微球中的药物含 量。在该例中，HPLC分析采用C18柱(150mm L.×4.6mm I.D.5μm)和 Gemini-NX C18柱(4.0mm L.×3.0mm I.D.)。样品的溶剂和流动相是碳酸钾的 水性溶液(pH7.0)和25%乙腈(ACN)，UV220nm下检测。

检测制备的微球中药物的含量来测定包封率。包封率列于下表2。

[表2]

类别 药物包封率(wt%) 实施例1 79.8 实施例2 89.3 实施例3 88.0 实施例4 100.0 实施例5 83.6 实施例7 83.6 对比例1 99 对比例2 45.3 对比例3 30

如表2所述，可以看出，即使利用高水溶性的溶剂-乙酸乙酯来溶解聚合物 载体，本发明的大多数微球制剂的药物包封率均在70-100wt%。在另一方面， 当不利用本发明的具有溶胶-凝胶转变特性的聚合物时，可以看出微球显示药物 包封效率在利用高毒性溶剂-二氯甲烷时是45-99.5wt%，而在利用乙酸乙酯时 药物包封率不超过30wt%。

实验实施例3：含有乙酸亮丙瑞林的微球的体外释放测试

以下进行本发明含有乙酸亮丙瑞林的微球的体外释放测试。

首先，将200mL0.1mol/L乳酸、5mL20(w/v)%聚山梨醇酯80和200mL 2(w/v)%聚(乙烯醇)(PVA)置于同一容器中并加入蒸馏水来制备1000mL测试溶 液。随后，将100mg制备的微球置于120mL玻璃试管中，向其中加入100mL 测试溶液。然后用橡胶盖密封容器，立即振荡并混合得到的混合物。然后，用 铝盖封闭该容器。在48±5℃下温育1、9和48小时后，利用具有23号针头的玻 璃注射器抽取各1mL的混悬液。然后，将离心获得的上清液立即用作测试液， 用HPLC分析，药物释放结果列于表3并示于图3。

[表3]

时间 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 对比例1 对比例2 1小时 14.9 6.3 2.1 9.3 13.1 9.6 10.4 9小时 52.8 32.3 34.2 42.4 60.4 33.4 39.7 48小时 89.6 90.0 85.3 102.7 85.1 87.1 88.4

释放率(%)根据各种复杂的因素而有所不同，但通常是药物的分散速度越 快并且粒径越小(由于相同重量下，较小颗粒的表面积大于大颗粒)，则颗粒越 快释放药物。

如表3所列，可以看出本发明制备的微球的总释放率为85%或更高，这表明 实施例的微球显示与对比例的相似的释放特性，但是药物包封含量更高。