一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用

摘要

本发明涉及一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用。结核杆菌LAM寡糖缀合物，结构通式如下：本发明还涉及上述结核杆菌LAM寡糖缀合物在制备肺结核疫苗中的应用。本发明所述的结核杆菌LAM寡糖缀合物中，寡糖的化学结构是明确且单一的，而非混合物，可通过化学方法合成，它能够解决卡介苗免疫保护力低的问题，对某些免疫力低下的人群同样会产生较好的免疫效果，同时能够避免抗生素的大量使用而带来的细菌耐药性的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用，属于肺结核疫苗研制技 术领域。

背景技术

肺结核是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，具有较高的致死率。结核病主要通过呼吸 道传染，也可以通过消化道、皮肤和子宫传染。大部分感染者通常没有任何症状，只有部分 机体免疫力较低或细胞介导的变态反应增高的感染者才会发病，如果不及时治疗，大约有一 半的感染者会死亡。近几年这一疾病的发病率逐年上升。造成这一现象的原因主要有：(1) 抗生素的滥用导致病菌耐药性的不断增强；(2)与艾滋病的交叉感染；(3)不发达国家较差 的基础医疗设施和环境(J.Infect.Dis.,1999,179,S461；Drugs,1997,53:40； Pharmacotherapy,1998,18:738)。因此，研制新型、有效、安全的结核病药物成为国内外 学者共同关注的一个重要课题。

结核病的治疗方法主要是抗生素和免疫治疗。抗生素治疗周期较长，不但给患者的免疫 系统造成了非常大的伤害，而且使病菌的耐药性不断增强。免疫治疗是预防结核病的非常有 效的措施，不存在细菌耐药性和削弱患者免疫力的问题。目前，预防结核病的主要疫苗是卡 介苗(BCG)。但是，研究发现BCG对结核病的免疫保护力低于80％(Trends Microbiol.,2008, 16:456)，对于有免疫缺陷的病人，BCG接种还有可能导致结核的全身播散。因此，人们迫切 需要一种新的疫苗来替代BCG。为了达到这个目的，人们对结核杆菌的细胞结构进行了深入 的研究。研究发现，其细胞壁的最外层含有结构非常复杂和特殊的糖聚合物，主要包括分枝 酸-阿拉伯半乳糖复合物(mAG)和脂肪阿拉伯甘露聚糖(LAM)(Tuberculosis,2003,83:91)。 其中，LAM在结核杆菌感染人体细胞的免疫学过程中扮演了非常重要的作用，它能够促进宿 主巨噬细胞中有机体的存活，同时在结核杆菌细胞中LAM是高度保守的(FEMS Microbiol. Rev.,2011,35:1126)。因此，可以根据LAM的结构特征，设计合成LAM寡糖片段，并将其 作为半抗原与蛋白质缀合，来制备复合糖缀合物疫苗。

目前，相关的研究工作主要集中在LAM寡糖片段的合成方法学上，只有少数人将寡糖片 段与蛋白质连接。Peter H.Seeberger等(J.Am.Chem.Soc.,2008,130:16791)高效的 合成了磷脂酰肌醇(PI)和含有1-6个甘露糖苷的磷脂酰肌醇(PIM1-PIM6)，在每一个PIM 的还原端都有一个硫醇作为连接基团与血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanin，KLH)连接， 但是，这些糖蛋白的免疫活性测试结果并不理想。David R.Bundle等(Bioconjugate Chem., 2014,25:685)将LAM非还原端阿拉伯分支六糖通过点击化学反应连接在一个共聚维酮上， 这一聚合物是由乙酸乙烯酯和N-乙烯基-2吡咯烷酮通过共聚合反应得到的，然后脱去聚合物 上的乙酰基，再通过引入氨基、叠氮以及炔基等功能基团作为坠与糖或肽连接在一起。结果 表明，最终的络合物能够作为较好的非蛋白抗原，很容易在ELISA板上产生吸附作用，在分 析抗体与半抗原的连接方面表现出较好的特性。

当前，结核杆菌糖缀合物疫苗的研究仍然停留在试验阶段，有许多问题函待解决。目前， 以结核分枝杆菌LAM非还原端含有甘露糖片段的阿拉伯寡糖为半抗原，与载体连接制备结核 杆菌复合寡糖缀合物疫苗，尚未见相关文献报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用， 其中的寡糖是结核杆菌细胞表面夹膜多糖的寡聚衍生物。

本发明通过如下的技术方案来实现：

一种结核杆菌LAM寡糖缀合物，结构通式如下：

其中，寡糖是如下通式(Ⅰ)-(Ⅱ)中的任意一寡糖：

式(I)和式(Ⅱ)中，a是0到10中的任意一个整数，b是0到20中的任意一个整数，m 是0到10中的任意一个整数，n是0到20中的任意一个整数，c是0或1，d是0或1，e是 0或1；

X选自：-CH₂-、-NH-、-O-、-C(O)-、-S-或之一；

连接体是寡糖与载体直接或间接连接后得到的结构部分；

t是与载体连接的寡糖的数量，t为1～30中的任意一整数；

载体选自：牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒 素(TT)、白喉毒素无毒突变体(CRM₁₉₇)、单磷酰化的脂质A(lipid A)、1,2-二硬酯酸-3- 磷脂酰乙醇胺或1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺之一。

根据本发明优选的，所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式为如下之一：

式中，j₁是1到10中的任意一个整数，j₂是1到10中的任意一个整数，k是33或35,t 是1到30中的任意一个整数。

根据本发明优选的，所述的载体选自：牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、血 蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)或白喉毒素无毒突变体(CRM₁₉₇)之一。

根据本发明进一步优选的，所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式如下：

根据本发明进一步优选的，所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式如下：

根据本发明进一步优选的，所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式如下：

上述结核杆菌LAM寡糖缀合物在制备肺结核疫苗中的应用。

有益效果

本发明所述的结核杆菌LAM寡糖缀合物中，寡糖的化学结构是明确且单一的，而非混合 物，可通过化学方法合成，它能够解决卡介苗免疫保护力低的问题，对某些免疫力低下的人 群同样会产生较好的免疫效果，同时能够避免抗生素的大量使用而带来的细菌耐药性的问题。

附图说明

图1 是化合物A11的¹H NMR谱图；

图2是A11-KLH寡糖缀合物的特异性抗体滴度图；

图中kappa代表针对化合物产生的免疫球蛋白中轻链为Kappa的免疫球蛋白，IgM代表 针对化合物产生的免疫球蛋白中重链为μ的免疫球蛋白，IgG1是针对化合物产生的免疫球蛋 白中重链为γ的免疫球蛋白的一个亚型。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例作进一步详细描述，但本发明所保 护范围不限于此。

实施例1：通用的合成方法

A：糖基化反应

取糖基供体(1.2个当量)、糖基受体(1个当量)和分子筛(与供体重量相等)溶于干 燥无水的二氯甲烷中，在氮气气氛下将反应液降温至-30℃，搅拌30分钟，加入N-碘代丁二 酰亚胺(NIS，1.2个当量)和催化量的三氟甲磺酸银(AgOTf)。反应液缓慢升至室温，待TLC 检测到原料全部反应后用三乙胺中和，过滤除去不溶的固体，滤液旋干，粗品经硅胶柱分离 得目标产物(所用洗脱液为石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)，除非另有说明)。

B：去乙酰化反应

将原料溶于甲醇，搅拌条件下加入1mol/L的甲醇钠甲醇溶液调节pH值至10左右，将反 应液置于室温下搅拌反应3小时，TLC检测至原料全部反应完毕，反应液用酸性树脂 (amberlite IR120)中和，过滤除去酸性树脂，减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶柱分离得 目标产物(所用洗脱液为石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)，除非另有说明)。

C：脱二甲基叔丁基硅(TBS)保护的反应

将原料(1个当量)溶于四氢呋喃，在搅拌条件下加入四正丁基氟化铵(TBAF)的四氢 呋喃溶液(1mmol/mL，1.2个当量)，室温搅拌反应2小时，减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶 柱分离得目标产物(所用洗脱液为石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)，除非另有说明)。

D：催化氢化反应

取原料溶于冰乙酸和水的混合溶液(冰乙酸:水＝10:1)，在氮气保护下加入催化量的钯碳 (Pd/C，10％)，向反应瓶中通入氢气，置换出氮气，反应液在氢气气氛下搅拌36小时。将反 应液过滤除去钯碳，减压蒸馏除去溶剂得目标产物。

E：寡糖缀合物的合成

寡糖的活化：将寡糖溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和磷酸盐缓冲溶液(PBS buffer， 0.1M)的混合液(DMF:PBS＝4:1)，搅拌条件下向其中加入双琥珀酰亚胺戊二酸酯，反应液室 温搅拌4小时，减压蒸馏除去溶剂得白色粉末状固体，固体用EA洗涤，干燥，得活化的寡糖。

寡糖蛋白缀合物的合成：按照30:1的摩尔比取活化的寡糖和蛋白(寡糖:蛋白＝30:1)溶 于PBS缓冲溶液，反应液搅拌过夜，用透析的方法除去小分子物质，透析完毕后将蛋白水溶 液冻干得寡糖-蛋白缀合物。

实施例2：3-氨基丙基α-D-甘露糖基-(1→2)-α-D-甘露糖基-(1→5)-β-D-阿拉伯糖 基-(1→2)-α-D-阿拉伯糖-KLH缀合物的合成(A11-KLH)

(1)5-O-叔丁基二甲基硅基-D-阿拉伯糖(A1)的合成

取D-阿拉伯糖(5.00g，33mmol)溶于100mL吡啶，在0℃下加入叔丁基二甲基氯硅烷 (6.00g，40mmol)和催化量的4-二甲基氨基吡啶，将反应液置于室温下搅拌6小时。用 TLC(EA)跟踪反应，待原料全部反应完后，将溶剂蒸干得黄色粘稠液体，粗品经硅胶柱分离 得无色油状液体(6.34g，产率72％)。

(2)1,2,3-三-O-乙酰基-5-O-叔丁基二甲基硅基-α,β-D-阿拉伯糖(A2)的合成

取A1(5.00g，19mmol)溶于5mL乙酸酐和20mL吡啶的混合溶剂，将混合液降温至0 ℃，搅拌条件下加入催化量的4-二甲基氨基吡啶，反应液升至室温反应4小时，减压蒸馏除 去溶剂得黄色粘稠液体，粗品经硅胶柱分离得无色油状液体(6.65g，产率90％，α:β＝2:1)。

(3)对甲苯硫基2,3-二-O-乙酰基-5-O-叔丁基二甲基硅基-1-S-α-D-阿拉伯糖(A3) 的合成

将A2(6.00g,15mmol)和对甲苯硫酚(2.29g,18mmol)溶于50mL干燥除水的二 氯甲烷中,将混合液降温至0℃，在搅拌条件下加入催化量的四氯化锡。反应液升至室温搅 拌30分钟，TLC跟踪反应至原料全部消失，反应液用三乙胺中和，旋蒸除去溶剂，粗品经硅 胶柱分离得无色油状液体(5.01g，产率72％)。

(4)对甲苯硫基2,3-二-O-苄基-5-O-叔丁基二甲基硅基-1-S-α-D-阿拉伯糖(A4)的 合成

取A3(5.00g，11mmol)按实施例1中通用合成方法B脱去乙酰基，用酸性树脂中和 反应液，过滤除去固体，减压蒸馏除去溶剂得淡黄色油状液体。将此液体溶于30mL干燥除水 的DMF，混合液降温至0℃，缓慢加入NaH(60％，1.76g，44mmol)，加完后保持0℃反应 30分钟。取BnBr(5.64g，33mmol)缓慢加入到反应液中，反应液升至室温搅拌30分钟。 此时将反应液倾入150mL冰水中，再用100mL乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤，无水硫酸钠 干燥，旋干得淡黄色油状液体，粗品经硅胶柱分离得无色油状液体(4.50g，产率74％)。

(5)3-叠氮基丙基2-O-乙酰基-3,5-二-O-苄基-α-D-阿拉伯糖(A5)的合成

以对甲苯硫基2-O-乙酰基-3,5-二-O-苄基-1-S-α-D-阿拉伯糖(2.30g,4.81mmol， 参照文献Org.Lett.,2014,16,988的方法合成)为糖基供体，3-叠氮基-1-丙醇(583mg， 5.77mmol)为受体，按照实施例1中通用合成方法A进行糖基化反应得目标产物(1.90g， 产率87％)。

(6)3-叠氮基丙基3,5-二-O-苄基-α-D-阿拉伯糖(A6)的合成

取A5(1.50g，3.30mmol)按实施例1中通用合成方法B脱去乙酰基得目标产物(1.24g， 产率91％)。

(7)3-叠氮基丙基2,3-二-O-苄基-5-O-叔丁基二甲基硅基-β-D-阿拉伯糖基 -(1→2)-3,5-二-O-苄基-α-D-阿拉伯糖(A7)的合成

以A4(2.30g，4.18mmol)为糖基供体，A6(2.07g，5.02mmol)为糖基受体，按照 实施例1中通用合成方法A进行糖基化反应得目标产物(β:α＝1.5:1，1.79g，产率51％)。

(8)3-叠氮基丙基2,3-二-O-苄基-β-D-阿拉伯糖基-(1→2)-3,5-二-O-苄基-α-D-阿 拉伯糖(A8)的合成

取A7(1.00g，1.19mmol)按实施例1中通用合成方法C脱去TBS保护基得目标产物 (794mg，产率92％)。

(9)3-叠氮基丙基2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-α-D-甘露糖基-(1→2)-3,4,6-三-O- 苄基-α-D-甘露糖基-(1→5)-2,3-二-O-苄基-β-D-阿拉伯糖基-(1→2)-3,5-二-O-苄基 -α-D-阿拉伯糖(A9)的合成

以对甲苯硫基2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-α-D-甘露糖基-(1→2)-3,4,6-三-O-苄基 -1-S-α-D-甘露糖(200mg，0.19mmol，参照文献J.Org.Chem.,2007,72,8976的方法 合成)为糖基供体，A8(141mg，0.19mmol)为糖基受体，按照实施例1中通用合成方法A 进行糖基化反应得目标产物，以正己烷(n-hexane)/乙酸乙酯为洗脱液(α:β＝1.8:1，168 mg，产率53％)。

(10)3-叠氮基丙基3,4,6-三-O-苄基-α-D-甘露糖基-(1→2)-3,4,6-三-O-苄基-α-D- 甘露糖基-(1→5)-2,3-二-O-苄基-β-D-阿拉伯糖基-(1→2)-3,5-二-O-苄基-α-D-阿拉伯糖 (A10)的合成

取A9(70mg，43μmmol)按实施例1中通用合成方法B脱去乙酰基得目标产物，以甲 苯(toluene)/乙酸乙酯为洗脱液(62mg，产率91％)。

(11)3-氨基丙基α-D-甘露糖基-(1→2)-α-D-甘露糖基-(1→5)-β-D-阿拉伯糖基 -(1→2)-α-D-阿拉伯糖乙酸盐(A11)的合成

取A10(30mg，19μmmol)按实施例1中通用合成方法D脱去苄基得目标产物(13mg， 产率96％)。¹H NMR(600MHz,D₂O)，见说明书附图1，δ:4.98(s,1H),4.95(s,2H), 4.84(s,1H),4.01-3.40(m,24H),2.95(t,2H),1.80(m,2H),1.73(s,3H).质谱： MALDI-TOF MS(m/z):计算值：C₂₅H₄₅NO₁₉Na[M+Na]⁺,686.2,实测值：685.4。

(11)A11-KLH糖缀合物的合成

取A11(1mg)，KLH(4mg)按实施例1中通用合成方法E合成A11-KLH缀合物(3.1mg)。 以硫酸-苯酚法(参考医药导报，2008，27，12:1511的方法)测定寡糖缀合物的糖含量为5.7％。

实施例3：3-氨基丙基α-D-甘露糖基-(1→2)-α-D-甘露糖基-(1→5)-β-D-阿拉伯糖 基-(1→2)-α-D-阿拉伯糖-BSA缀合物的合成(A11-BSA)

取A11(1mg)，BSA(3mg)按实施例1中通用合成方法E合成A11-BSA缀合物(2.7mg)。 质谱：MALDI-TOF MS(m/z)：74354

实施例4：寡糖缀合物A11-KLH的免疫原性抗体滴度测定

实施例2中制备的寡糖缀合物A11-KLH在小鼠(C57/BL，7周大，每组6只)体内进行 免疫试验。采用皮下注射的方式，以寡糖用量计算，2μg/只小鼠/次，分别在第1、14、21、 28天进行免疫。

分别在免疫前1天和末次免疫2天后取血，制备抗血清研究其免疫原性，用相应寡糖的 BSA缀合物作为固定抗原，以酶联免疫法(ELISA)检测多糖特异性抗体的滴度，结果如图2 所示。

经过免疫后，小鼠血液中的抗体滴度明显增高，IgG1抗体的滴度在总抗中占有较大比例， 说明化合物诱导产生的免疫响应主要是IgG1型，而IgG1型抗体属于T细胞参与的免疫响应， 它能够使宿主细胞产生免疫记忆，促进抗体成熟，这一结果说明化合物A11-KLH是一种非常 有前景的肺结核疫苗。