结核杆菌LAM寡糖缀合物疫苗的合成与免疫活性研究

摘要

肺结核是一种具有高传染性和致死率的疾病。随着抗生素的发现和使用，人们曾经很好地控制了它的传播，但是近年来，这一疾病再次威胁到人类的健康和生命。根据世界卫生组织(WHO)的统计，最近几年全世界感染肺结核的人数在逐年递增，其中有三分之一感染者死亡。抗生素的大量使用是造成这一现象的主要原因。较长的治疗周期和多种抗生素的联合使用一方面给病人的身体造成了非常大的伤害，另一方面还导致细菌耐药性的不断增强。此外，与艾滋病的交叉感染也是导致其死亡率逐年上升的原因之一。艾滋病病毒会对人体的免疫系统造成伤害，艾滋病患者也就更容易感染肺结核，感染后的患者很难治愈，通常在几个月后就会死亡。卡介苗(BCG)是预防结核病的唯一疫苗，但是在许多地区它对结核病的保护力从0到80％不等，对于有免疫缺陷的病人，BCG接种还有可能导致结核的全身播散。因此，人们需要研究开发更为安全、有效的疫苗来预防结核病的传播。
　　到目前为止，科学家们也研发了一些新的肺结核候选疫苗，它们的免疫效果已经通过临床前的动物实验证明，个别候选疫苗已经进入了Ⅰ或Ⅱ期临床实验，但是这些疫苗都以蛋白或肽作为抗原决定基。与蛋白或多肽疫苗相比，糖缀合物疫苗具有很大的优势:首先，多糖类物质一般都存在于细胞表面，这就可以保证人体在受到细菌感染的过程中能够快速识别并产生免疫反应;其次，糖的结构具有高度的保守性，不会像蛋白质和核酸那样容易发生变异，接种糖疫苗后可能会达到终身免疫的效果;另外，研究证明多糖类物质具有非常重要的生物功能，尤其是在细菌感染人体的最初阶段。在许多已经上市的基于糖抗原的疫苗中（如肺炎链球菌疫苗、B型流感嗜血杆菌疫苗、C群脑膜炎球菌多糖缀合物疫苗等），糖抗原已经被证明是一种非常重要的抗原组分，因此我们相信基于糖抗原的肺结核疫苗的研究是非常重要的。
　　脂肪阿拉伯甘露聚糖(LAM)是结核杆菌细胞表面的一种非常重要的脂多糖。研究证明，LAM在结核杆菌感染人体的过程中发挥着非常重要的作用。例如，它能抑制γ-干扰素介导的活化、巨噬细胞活化、触发和杀伤活性、T-细胞活化等，这些都和免疫反应息息相关。因此，LAM是研发肺结核疫苗的良好靶抗原。为此，我们设计了三个源自LAM非还原端的阿拉伯寡糖片段，其结构中都含有α-(1→2)连接的吡喃型甘露二糖。并通过合理的路线设计，以化学手段立体选择性的合成了这些寡糖半抗原，然后与钥孔血蓝蛋白(KLH)和单磷酰类脂A(MPLA)缀合得到LAM寡糖-缀合物候选疫苗，最后对疫苗的免疫活性进行了初步测试。本论文主要包括以下三个部分:
　　一、对结核杆菌LAM寡糖及其衍生物的合成与性能研究做了详细的综述。(1)PIM寡糖的合成。其主要合成思路大体类似，根据肌醇上六个羟基的反应活性不同，经过合理的保护基策略和路线设计，首先合成特定位置羟基裸露的肌醇衍生物作为受体，然后与不同的甘露糖供体进行糖苷化，最后进行肌醇特定位置的磷酸化得到全保护的PIM衍生物，脱去全部保护基得到终产物。(2)LAM阿拉伯寡糖的合成。阿拉伯寡糖片段中含有α-(1→5)、α-(1→3)以及β-(1→2)等连接方式，其合成也相对比较困难，所以大部分研究主要集中在β-(1→2)连接的阿拉伯糖苷键的合成方法学上，主要包括:分子内转移法、利用构像限制作用选择合适的保护基、氢键诱导法等等。(3)LAM小分子类似物的合成。由于LAM结构的复杂性，其衍生物的合成也是非常困难的，只有少数人设计合成了非常简单的分子，且多数都没有涉及到β-(1→2)连接的阿拉伯糖苷键的构建。
　　二、LAM阿拉伯寡糖-蛋白缀合物的合成。(1)LAM非还原端四糖的合成:该合成以D-阿拉伯糖和D-甘露糖为起始原料，采用[2+2]的糖苷化策略，通过构建甘露二糖供体和阿拉伯二糖受体来实现。在合成阿拉伯二糖时，反应生成α和β异构体的混合物，目标产物通过硅胶柱分离纯化，其构型根据13C NMR上异头碳的化学位移确定。在合成四糖时也得到了α和β异构体的混合物，产物也可以很容易地通过硅胶柱分离，其构型根据甘露糖异头碳的1JCH耦合常数确定。(2)LAM七糖的合成:该合成采用[5+2]的糖苷化策略，充分利用乙酰基的邻基参与作用控制立体选择性，且由于α和β异构体是在合成供体的过程中产生的，避免了在最后阶段糖苷化生成异构体，关键中间体的构型根据13C NMR上异头碳的化学位移确定。(3)LAM十一糖的合成:与七糖的合成类似，该合成采用了[9+2]的糖苷化策略。在合成供体的过程中通过双糖苷化的方法快速构建分枝型阿拉伯糖苷键，整个路线同样充分利用了乙酰基的邻基参与作用控制立体选择性，只有一步反应产生α和β异构体，其构型根据13C NMR上异头碳的化学位移确定。(4)寡糖与BSA和KLH的缀合:以双琥珀酰亚胺戊二酸酯为交联剂进行。糖蛋白缀合物的糖含量用硫酸-苯酚法分析计算得到，且BSA缀合物的糖含量可以进一步通过MALDI-TOF质谱确定，KLH缀合物的糖含量通过SDS-PAGE分析确定。(5)LAM寡糖-KLH缀合物的初步免疫结果表明，三个寡糖缀合物均能够引起特异性的免疫反应，产生一定滴度的抗体。
　　三、LAM阿拉伯寡糖-MPLA缀合物的合成。最初我们计划将寡糖连接在MPLA的6'-O位置，通过将6'位羟基衍生化引入炔基，接着和含有叠氮基的LAM寡糖经过点击化学“click”反应完成缀合。我们首先采用收敛的策略高效的合成了6'位羟基的MPLA衍生物，接着和溴丙炔在氢化钠存在的条件下反应引入炔丙基，但是经过核磁共振二维谱图鉴定，MPLA4'-O位的磷脂酰基迁移到了6'-O位，而炔丙基被引入到了4'-O位置。后来我们尝试用戊炔酸与6'位羟基缩合成酯，但是发现酯键稳定性较差，容易水解断开。为了解决这一难题，我们将6'位羟基换成氨基，然后与戊炔酸缩合形成稳定的酰胺键，接着与LAM四糖经过“click”反应缀合，最后脱去全部保护基得到LAM寡糖-MPLA缀合物。此外，我们还合成了1-O位连接的LAM四糖-MPLA缀合物作为阳性对比。糖脂类化合物的质谱分析一直是令人们头痛的问题，这类化合物难于离子化，需要通过特殊的质谱条件才能完成。我们采用MALDI-TOF质谱仪对所合成的缀合物进行了质谱分析，其中6'位连接的四糖-MPLA缀合物以2,5-二羟基苯甲酸(DHB)为基质，三氟乙酸(TFA)为离子化试剂，在reflection-负离子模式下分析，1-O位连接的四糖-MPLA缀合物以6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)为基质，柠檬酸铵为离子化试剂，在linear-负离子模式下分析，获得了满意的结果。最后，我们还对两个四糖-MPLA缀合物进行了初步的免疫实验评价，结果表明它们都能够引起特异性的免疫反应。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1．1 结核杆菌细胞壁多糖的结构

1．2 PIM寡糖的合成

1．3 LAM阿拉伯寡糖片段的合成

1．4 LAM小分子类似物的合成

1．5 课题的提出

第二章 结核杆菌LAM寡糖蛋白缀合物的合成与免疫活性研究

2．1 引言

2．2 结果与讨论

2．2．1 结核杆菌LAM四糖的合成

2．2．2 结核杆菌LAM七糖的合成

2．2．3 结核杆菌LAM十一糖的合成

2．2．4 LAM寡糖-蛋白缀合物的合成

2．2．5 硫酸-苯酚法测定LAM寡糖缀合物的载糖率

2．2．6 KLH及其缀合物的SDS-PAGE分析

2．2．7 寡糖-KLH缀合物的免疫活性研究

2．3 实验部分

2．3．1 结核杆菌LAM四糖(TB-25)的合成

2．3．2 结核杆菌LAM七糖(TB-46)的合成

2．3．3 结核杆菌LAM十一糖(TB-58)的合成

2．3．4 ELISA实验

2．4 本章小结

第三章 结核杆菌LAM寡糖-单磷酰类脂A(MPLA)缀合物的合成与免疫活性研究

3．1 引言

3．2 结果与讨论

3．2．1 寡糖-MPLA缀合物的合成

3．2．2 寡糖-MPLA缀合物的免疫活性研究

3．3 实验部分

3．3．1 载体MPLA的合成

3．3．2 LAM寡糖-MPLA缀合物的合成

3．3．3 ELISA实验

3．4 本章小结

第四章 总结和展望

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的论文

附录