一种达氏鲟精子冷冻保存液及制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种达氏鲟精子冷冻保存液及制备方法和应用，本发明的达氏鲟精子冷冻保存液包括蔗糖，海藻糖，三羟基氨基甲烷，氯化钾，还原型谷胱甘肽，甲醇。本发明所述的达氏鲟精子冷冻保存液，成分简单，冷冻保存成本低。其中，还原型谷胱甘肽的加入，起到了很好的抗氧化作用，对精子质膜起到很好的保护作用，同时还降低了DNA分子损伤。海藻糖的加入，则具有防止蛋白质变性，有效保护精子的作用。利用本发明的精子冷冻保存液，解冻后精子活力高于70%，受精率达45%。

说明书

技术领域

本发明属于低温冷冻生物学领域，具体涉及一种达氏鲟精液冷冻保存液，还涉及一种达 氏鲟精液冷冻保存液的制备方法，还涉及一种达氏鲟精液冷冻保存液的应用，该精液冷冻保 存液适合于达氏鲟。

背景技术

鱼类精液超低温冷冻保存技术在鱼类遗传育种研究、鱼类养殖及种质资源保护等方面 具有重要的应用价值。鱼类精液超低温冷冻保存技术的研究是从上世纪50年代开始的，国 内外学者在淡水和海水经济鱼类以及濒危鱼类的精液冷冻保存技术方面做了大量的工作。鲟 鱼类精液冷冻保存技术的研究起步较晚，最初主要是俄罗斯鲟精液冷冻保存。随后，匙吻鲟、 西伯利亚鲟、闪光鲟等其它鲟鱼的精液超低温保存技术也得到了广泛的研究。达氏鲟为我国 国家一级保护动物，被世界自然保护联盟(IUCN)列为极危物种，濒危野生动植物国际贸 易公约(CITES)附录II保护动物。通过精液冷冻保存技术，将其现有种群的精液，长期、 有效地保存起来，即建立达氏鲟冷冻精子库，以后用解冻精子与卵子进行人工授精，就可以 将达氏鲟的基因资源完全保存下来，为该物种种质资源保护开辟了一条新的途径。

保存精子的方法很多，主要有低温、常温和冷冻三种。低温和常温用于短期保存精液， 而冷冻或超低温冷冻则可以长期保存精液。目前，国内外广泛采用冷冻技术保存精液，常用 的抗冻剂有干冰(液态二氧化碳，沸点－79℃)和液氮(沸点－196℃)等，用液氮保存精 液，精子的代谢停滞，精子处于假死状态，但其结构却能保持完整。因此，如何使精子不受 影响地以完整结构达到超低温状态，就成为精液超低温保存技术的一项关键问题。

冷冻保存液的配制是鱼类精液冷冻保存中的关键一环。冷冻保存液是由一定组成成分 和配比浓度的稀释液以及一定浓度的抗冻剂组成的，冷冻保存液的适合与否直接影响保存的 效果。鱼的种类不同，精子的生理特性也有差异，因而对稀释液和抗冻剂的组成成份和浓度 具有不同的要求。鱼类精液冷冻保存稀释液成份很多，主要有盐类(如NaHCO₃、NaCl、 KCl、KHCO₃、柠檬酸钠等)、糖类(如葡萄糖、果糖、蔗糖等)、脂类(主要是磷脂)和蛋白 质(如卵黄、牛奶、小牛血清等)、以及其他添加剂(如甘氨酸、抗生素)等。对于鲟鱼的 精子来说，稀释液的渗透压要等于或高于精子的渗透压，这样精子被稀释后不会被激活。稀 释液的渗透压等同于各组成成分离子浓度之和。这里我们还要注意K离子对鲟鱼精子的抑制 作用，无论稀释液的渗透压有多低，只要K离子的浓度高于2mM，精子的运动会被完全抑 制，所以K离子在鲟鱼精子稀释液中浓度不可太高，否则会造成不可逆抑制。而糖类等大分 子类溶质除了起到调节渗透压的作用外，还具有提供精子能量的作用。脂类和蛋白质以及其 他添加剂主要对精子某个部位或某个方面起到保护的作用。常用的抗冻剂有甘油、二甲亚砜、 乙二醇、乙酰胺、丙二醇、甲醇等。这类抗冻剂多属低分子中性物质，在溶液中易结合水分 子，发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到保护精子的目的。

一般情况下，精子经冷冻保存后其活力和受精能力均会显著下降，其中部分原因取决于 膜结构的完整性遭到破坏。大量研究证明精子在冷冻保存过程中会产生氧的自由基或者改变 抗氧化酶的活性，从而引起膜脂的过氧化反应、导致膜脂结构和精子渗透压的改变，或直接 攻击精子DNA碱基等，最终导致精子生存能力的降低。

因此，在冷冻保存液的配制过程中，针对某物种的精液，我们不仅要考虑离子及其浓 度、糖类组成及浓度以及缓冲液的pH值等，还要思考能否通过添加剂来改善冷冻保存的条 件，如抗氧化剂等，从而提高冷冻保存的效果。本发明旨在达氏鲟精子冷冻保存研究尚存空 白的情况下，发明一种达氏鲟精子冷冻保存液能够有效的长期保存达氏鲟的精子，并可极大 的保护精子免受冰晶及氧化等损伤。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种达氏鲟精子冷冻保存液，该保存液由蔗糖，海藻糖，三羟 甲基氨基甲烷，氯化钾，还原型谷胱甘肽及甲醇按照一定配比混合而成，在达氏鲟精子超低 温冷冻保存过程中，可极大的保护精子免受冰晶及氧化等损伤。

本发明的另一个目的在于提供了一种达氏鲟精子冷冻保存液的制备方法，方法简单，易 行，适于大规模生产，该方法适合配制各种体积的稀释液，可确保所配制稀释液中个组分浓 度的准确性。

本发明的最后一个目的在于提供了一种达氏鲟精子冷冻保存液在达氏鲟精子冷冻保存 中的应用，该应用包括利用本发明的达氏鲟精子冷冻保存液进行达氏鲟的精子冷冻保存，还 包括利用本发明的配方制备达氏鲟精子冷冻保存液。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含：

其余为去离子水

加入甲醇之前的溶液渗透压为69.2-188.8mOsM，冷冻保存液的pH为7.4-8.6。

一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含：

其余为去离子水

加入甲醇之前的溶液渗透压为89-168.5mOsM，冷冻保存液的pH为7.6-8.4。

一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含：

其余为去离子水

加入甲醇之前的溶液渗透压为107.1-150.1mOsM，冷冻保存液的pH为7.8-8.2。

一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含：

其余为去离子水

加入甲醇之前的溶液渗透压为117.8-139.2mOsM，冷冻保存液的pH为7.9-8.1。

一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液(最佳配比)中包含：

其余为去离子水

加入甲醇之前的溶液渗透压为128.4mOsM，冷冻保存液的pH为8.0。

一种达氏鲟精子冷冻保存液的制备方法，其步骤如下：

1)根据总精液量计算需要冷冻保存液的总体积。

2)根据冷冻保存液的总体积和各组分的配方浓度以及各组分贮备液的浓度，计算各组分贮 备液的量取体积，计算公式为：各组分量取体积＝各组分的配方浓度×冷冻保存液总体积÷ 各组分贮备液的浓度，用微量取样器从各组分贮备液中量取相应的体积并混匀，最后加蒸馏 水至冷冻保存液的终体积。

3)从上述溶液中量取出冷冻保存液总体积×甲醇浓度的体积溶液，再加入等量的甲醇混匀 配制成最终的精子冷冻保存液。配制好的冷冻保存液应立刻用于精子的超低温冷冻保存。

一种达氏鲟精子冷冻保存液在达氏鲟精子冷冻保存中的应用，其应用过程如下：

1)、精液采集与检测

待达氏鲟繁殖季节，对雄性亲鱼进行B超检查性腺发育状况，对达到性成熟的亲鱼进 行人工催产，采集精液时，用干毛巾擦净亲鱼生殖孔周围，挤压腹部，收集无粪便和杂物的 干净精液于塑料袋中，充氧后密封并于4℃存放。利用显微镜检测精子活力，成活率在90％ 以上的精液用于冷冻保存。

2)、精液的稀释、分装和冷冻

取100ml精液，加入100ml新鲜配制的冷冻保存液，稀释比为1:1。精液与冷冻液混匀 后，立刻分装至2ml冷冻管中。同时程序降温仪开启，预冷至0℃。

程序降温：从0℃开始，3℃/min降至-5℃，5℃/min降至-15℃；10℃/min降至-25℃； 20℃/min降至-80℃，在-80℃平衡5min后，直接将冷冻管从程序降温仪中取出，立即放入 液氮(-196℃)中保存。

3)、解冻和精子活力检测

将装有精子的冷冻管从液氮中取出，立即浸入40℃水浴中，一边摇动一边解冻，至完 全融化为止。

在载波片上滴加30μl蒸馏水，然后用针尖蘸取少许精液，迅速涂在蒸馏水中，并利用 显微镜观察精子激活后的运动状况，精子活力达70％以上，运动时间持续3-4min。

4)、解冻后精子用于授精

将采集的成熟卵置于洁净、干燥的容器中，再将解冻后的精液加入卵中(精子与卵子的比值 约为3×10⁵)，用手轻轻搅动，使精卵充分混匀，然后加水，激活精子使其与卵子受精，轻 轻搅拌后，倒掉上方的污水，将卵移入孵化器中孵化。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、实现了达氏鲟精子冷冻保存和应用，该方法可以应用于人工繁殖中解决精液量不足的 问题，又可以实现达氏鲟种质资源永久保存的目的。

2、精子冷冻保存液成分简单，冷冻保存成本低。

3、冷冻保存液中加入了还原型谷胱甘肽，起到了很好的抗氧化作用，对精子质膜起到很 好的保护作用，同时还降低了DNA分子损伤。

4、冷冻保存液中海藻糖的加入，具有防止蛋白质变性，有效保护精子的作用。

5、解冻后精子活力高于70％(新鲜采集精子活力高于90％)，受精率达45％(新鲜采集精 子受精率为60-70％)。

具体实施方式

本发明实施例中的技术方案，如未特别说明，均为常规技术，所用试剂如未特别说明， 均购自生化商店。

实施例1-9：

蔗糖、海藻糖、三羟甲基氨基甲烷、氯化钾、还原型谷胱甘肽、无水乙醇、以及去离 子水。以上试剂原料均购置于Sigma公司。

储存液的配制：

1)1M浓度的蔗糖贮备液：蔗糖分子量342，配制体积100ml的溶液需要蔗糖的重量为34.2g， 将称取的蔗糖放入烧杯中，先加入60ml的蒸馏水，用玻璃棒搅拌使其充分溶解，再将溶液定 容至100ml。

2)1M浓度的海藻糖贮备液：海藻糖分子量342，配制体积10ml的溶液需要海藻糖的重量为 3.42g，将称取的海藻糖放入10ml的离心管中，先加入6ml的蒸馏水，旋紧离心管的盖子，上 下摇动离心管使海藻糖充分的溶解，再将溶液定容至10ml。

3)0.1M浓度的三羟甲基氨基甲烷贮备液：三羟甲基氨基甲烷分子量121，配制体积100ml的 溶液需要三羟甲基氨基甲烷的重量为1.21g，将称取的三羟甲基氨基甲烷放入烧杯中，先加 入80ml的蒸馏水，用玻璃棒搅拌使其充分溶解，再用盐酸溶液调节pH，范围为7.4-8.6，最 后将溶液定容至100ml。

4)0.1M浓度的氯化钾贮备液：氯化钾分子量74.55，配制体积50ml的溶液需要氯化钾的重 量为0.373g，将称取的氯化钾放入50ml的离心管中，先加入40ml的蒸馏水，旋紧离心管的盖 子，上下摇动离心管使氯化钾充分的溶解，再将溶液定容至50ml。

5)0.32M浓度还原型谷胱甘肽贮备液:还原型谷胱甘肽分子量307.32，配制体积1ml的溶液 需要还原型谷胱甘肽的重量为0.1g，将称取的还原型谷胱甘肽放入1ml的离心管中，先加入 0.5ml的蒸馏水，盖紧离心管，上下摇动离心管使还原型谷胱甘肽充分的溶解，再将溶液定 容至1ml。

上述贮备液均须配制新鲜的溶液,可暂时放置4℃冰箱保存。

一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含：

一种达氏鲟精子冷冻保存液，其制备方法如下，以实例5所述配方进行说明：

配制100ml的冷冻保存液，首先从各原料贮备液中吸取蔗糖6ml、海藻糖3ml、三羟甲 基氨基甲烷(pH8.0)30ml、氯化钾1ml、还原型谷胱甘肽2ml混合，加入蒸馏水58ml充分 混匀调配成稀释液，再将稀释液吸出10ml弃掉，加入10ml无水甲醇，最终配制成2.5mol 抗冻剂浓度的冷冻保存液。

实施例10：

一种达氏鲟精子冷冻保存液在达氏鲟精子冷冻保存中的应用，其应用过程如下：

所用的达氏鲟精子冷冻保存液配方及制备方法为上述实例5所示，该冷冻保存液即配即用。

以超低温(-196℃)冷冻保存100ml达氏鲟精液为例，说明达氏鲟精子冷冻保存液的 使用方法。

1)、精液采集与检测

待达氏鲟繁殖季节(3月中旬至4月初)，对雄性亲鱼进行B超检查性腺发育状况，对 达到性成熟的亲鱼进行人工催产，采集精液时，用干毛巾擦净亲鱼生殖孔周围，挤压腹部， 收集无粪便和杂物的干净精液于塑料袋中，充氧后密封并于4℃存放。利用显微镜检测精子 活力，成活率在90％以上的精液用于冷冻保存。

2)、精液的稀释、分装和冷冻

取100ml精液，加入100ml新鲜配制的冷冻保存液，稀释比为1:1。精液与冷冻液混匀 后，立刻分装至2ml冷冻管中。同时程序降温仪开启，预冷至0℃。

程序降温：从0℃开始，3℃/min降至-5℃，5℃/min降至-15℃；10℃/min降至-25℃； 20℃/min降至-80℃，在-80℃平衡5min后，直接将冷冻管从程序降温仪中取出，立即放入 液氮(-196℃)中保存。

3)、解冻和精子活力检测

将装有精子的冷冻管从液氮中取出，立即浸入40℃水浴中，一边摇动一边解冻，至完 全融化为止，大概需要105s。

在载波片上滴加30μl蒸馏水，然后用针尖蘸取少许精液，迅速涂在蒸馏水中，并利用 显微镜观察精子激活后的运动状况，精子活力达70％以上，运动时间持续3-4min。

4)、解冻后精子用于授精

将采集的成熟卵置于洁净、干燥的容器中，再将解冻后的精液加入卵中(精子与卵子的 比值约为3×10⁵)，用手轻轻搅动，使精卵充分混匀，然后加水，激活精子使其与卵子受精， 轻轻搅拌后，倒掉上方的污水，将卵移入孵化器中孵化。待受精卵发育至胚孔期(18-20℃ 水温环境条件下约需32h)，统计受精率，发育这一时期的受精卵用肉眼容易辨认，结果显示， 受精率达45％(新鲜采集精子受精率为60-70％)。

实施例11：

利用实例2-4，实例6-8所述配方制备的达氏鲟精子冷冻保存液，按照实施例10所述方法进 行精液的保存与解冻和受精，其结果如下：

实例2 实例3 实例4 实例6 实例7 实例8 受精率％ 17 20 32 29 21 10