达氏鲟dmc1和ly75基因的cDNA克隆及在精子生成中的表达分析

摘要

达氏鲟(Acipenser dabryanus)是我国特有的一种淡水定居性珍稀鱼类。早期达氏鲟曾是长江上游重要的经济鱼类之一，20世纪后期由于过度捕捞、水利工程兴建、航道整治、挖沙活动等原因，达氏鲟生存环境遭到严重破坏，物种处于极度濒危状况，已于1988年被列为国家一级保护动物。因此，其物种保护、资源增殖的研究亟待加强，尤其在繁殖生物学方面的研究更是亟需关注。经过十多年的发展，鱼类生殖细胞移植技术已成功应用到多种鱼类，在种质资源保存、增殖放流和物种恢复方面具有重大的应用潜力。近年来有关达氏鲟精原细胞移植的研究已取得阶段性成果，但高效的移植依赖于精原干细胞的体外增殖培养。前期我们已开展了达氏鲟精原细胞培养方面的工作，但对培养的达氏鲟精原干细胞鉴定还有所欠缺。目前，已鉴定的达氏鲟生殖细胞标记基因有dnd和删，但是它们除了在精原细胞表达外，在精母细胞中也有表达，因此，有必要鉴定在特异类型生殖细胞表达的基因，进而为体外培养精原干细胞的鉴定奠定基础。
　　本研究鉴定了两个生殖细胞特异表达的基因:dmc1和ly75，通过RT-PCR技术分别克隆得到达氏鲟dmc1和ly75基因的编码区序列，运用生物信息学方法分析达氏鲟dmc1和ly75基因编码的蛋白序列和系统进化关系，借助荧光定量PCR分析这两个基因在达氏鲟不同组织中的表达特征，结合组织学结果进一步分析了它们在不同发育时期精巢的表达特征，最后通过原位杂交定位技术对这两个基因在精巢组织细胞中的定位进行了研究。主要研究结果如下:
　　1.1～3龄达氏鲟精巢组织HE染色结果:0期精巢中，未形成精小囊，可见少量原始生殖细胞;Ⅰ期精巢中，精原细胞增殖，可见大量A型精原细胞;Ⅱ期精巢中出现B型精原细胞，但主要还是以A型精原细胞为主;Ⅲ期精巢中，以初级精母细胞为主，存在着少量次级精母细胞;Ⅳ期精巢中，有大量初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞，还有少量的精子;Ⅴ期精巢中，主要是精子。
　　2.dmc1基因特异性表达于减数分裂Ⅰ前期，其产物是减数分裂同源染色体配对所必需。本研究从达氏鲟性腺转录组数据库搜索得到该基因序列并设计引物，克隆得到了达氏鲟dmc1基因编码区序列，开放阅读框(ORF)为1029bp，编码342个氨基酸。通过将达氏鲟Dmc1与其他鱼类以及四足类Dmc1氨基酸序列多重比对，发现Dmc1氨基酸序列具高度保守性，其中任意两者的同源一致性在87％以上，并且都含有两个可以结合核酸motifs(GEFRTGKT和LLIID)。RT-PCR结果显示，dmc1基因仅在精巢和卵巢中表达。荧光定量PCR结果表明，在0期和Ⅰ期的精巢中，dmc1基因没有表达，Ⅱ期精巢中其有微弱表达;在Ⅲ期和Ⅳ期中其表达量急剧增加，并在Ⅳ期达到最高水平;Ⅴ期精巢中其表达量显著性(P＜0.05)降低。通过原位杂交技术，发现Addmc1在初级精母细胞和次级精母细胞中表达。因此，推断其可能是减数分裂特异表达基因。
　　3.虽然ly75基因在鱼类的多个组织都有表达，但性腺中该基因主要在生殖细胞中特异表达。为研究ly75基因在达氏鲟性腺的表达特征，克隆得到了达氏鲟ly75基因的编码区序列，其开放阅读框为5175bp，编码1724个氨基酸。对其序列分析发现，AdLy75存在信号肽、1个RICIN、1个FNII、10个CTLDs和一个TM结构域。同源性比对结果显示，达氏鲟Ly75蛋白与其他物种相应蛋白的同源性都很低，一致性在42.7％～47.5％之间。系统进化分析表明，达氏鲟Ly75属于Ly75蛋白分支，为甘露糖受体家族成员，且与硬骨鱼类聚为一支。采用qRT-PCR技术分析ly75基因在不同组织和不同发育时期精巢的表达特征，结果显示ly75基因在雌雄个体的各组织中均有表达，且在精巢中表达量远高于卵巢。在不同发育时期精巢中，ly75基因在早期精巢中表达量非常低，随着有丝分裂的进行，表达量逐渐升高并在Ⅱ期达到最高，随后减数分裂的进行，Ⅲ、Ⅳ期其表达量逐渐降低。原位杂交的结果显示Adly75mRNA只在精原细胞中表达，表明其可能是精原细胞的标记基因。

目录

声明

摘要

1．1 达氏鲟研究进展

1．1．2 地理分布和资源现状

1．1．3 研究现状

1．2 达氏鲟性腺的发育及繁殖生物学

1．3 生殖细胞

1．3．1 鱼类生殖细胞的基本特征

1．3．2 生殖细胞的鉴定

1．3．3 鱼类生殖细胞的标记基因

1．4 dmc1基因研究进展

1．4．2 dmc1基因的表达和功能

1．5 ly75基因研究进展

1．5．1 Ly75结构和序列特征

1．5．2 ly75基因的表达特征研究

1．5．3 Ly75的功能研究

1．6 本研究的目的及意义

第2章 达氏鲟dmc1基因的cDNA克隆及在精子生成中的表达分析

前言

2．1 材料和方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要仪器

2．1．3 试剂盒与主要试剂

2．1．4 总RNA提取步骤

2．1．5 cDNA模板制备

2．1．6 达氏鲟dmc1基因编码区克隆

2．1．7 PCR产物电泳检测、回收及纯化

2．1．8 连接和转化

2．1．9 菌落PCR及测序

2．1．10 达氏鲟dmc1基因序列特征分析和系统进化树构建

2．1．11 达氏鲟dmc1基因的组织表达特性分析

2．1．12 石蜡切片和HE染色

2．1．14 原位杂交

2．3 结果

2．3．2 达氏鲟dmc1基因的生物信息学分析

2．3．3 达氏鲟dmc1基因的组织表达特征

2．3．4 达氏鲟精巢组织的发育

2．3．5 达氏鲟dmc1基因real-time PCR标准曲线的建立

2．3．6 达氏鲟dmc1 mRNA在不同发育时期精巢中的表达水平

2．3．7 达氏鲟dmc1 mRNA在精巢中的定位

2．4 讨论

第3章 达氏鲟ly75基因cDNA克隆与组织表达特性研究

3．1 材料和方法

3．1．1 实验材料

3．1．4 总对RNA的提取步骤

3．1．5 cDNA模板制备

3．1．6 达氏鲟ly75基因部分cDNA序列获得

3．1．7 PCR产物电泳检测及纯化

3．1．8 连接和转化

3．1．9 菌落PCR及测序

3．1．11 qRT-PCR分析

3．1．12 石蜡切片原位杂交

3．2 结果

3．2．1 达氏鲟ly75基因cDNA序列特征分析

3．2．2 达氏鲟ly75基因同源性分析

3．2．3 达氏鲟ly75基因组织表达分析

3．2．4 达氏鲟ly75基因real-time PCR标准曲线的建立

3．2．5 达氏鲟ly75基因在不同发育时期精巢的表达分析

3．2．6 达氏鲟ly75基因mRNA在精巢中的定位

3．3 讨论

第4章 总结

参考文献

附录

致谢