改进的六胺银马松套染法

摘要

本发明涉及一种改进的六胺银马松套染法，包括以下步骤：配制银染试剂；将组织切片用Bouin液固定；切片依次浸入2.5%碘酒、5%硫代硫酸钠、1.5%高碘酸；取银染A液和银染B液浸染切片，直至基底膜显示清晰的黑色后终止；3%硫代硫酸钠浸泡切片；苏木素浸染；盐酸酒精分化，水洗返蓝；丽春红染液浸染；1%磷钼酸浸泡切片；经梯度酒精脱水后入二甲苯透明，中性树胶封片。本发明提供了一种试剂调配合理、染色效果好且时间短、性能稳定、套染色泽鲜艳的六胺银马松套染法，并在实验中取得了比现有方法更好的效果，改变了银染色中组织容易出现过染，时间、温度较难控制，背景颜色过高及套染别的染色色彩不够鲜艳等问题。

说明书

技术领域

本发明涉及六胺银马松套染法，是肾组织穿刺活检的病理诊断必要的特殊染色方法之一。特别地，本发明涉及一种改进的六胺银马松套染法，可以用于显示肾组织中小球、小管、血管基底膜和组织免疫复合物沉积及纤维化等改变。

背景技术

六胺银马松套染法是从霉菌染色的六胺银法演化形成的针对肾组织切片的染色方法，是六胺银和马松两种染色方法的叠加染色。在肾小球疾病中，常导致肾小球基底膜的改变，基底膜是一层高度含水性凝胶体的衬膜，主要由粘多糖和蛋白质构成，具有渗透性，常与纤细的结缔组织纤维密切结合。六胺银马松套染法是使肾组织经酸氧化后，基底膜内的粘多糖暴露出醛基，醛基把六胺银还原为黑褐色的金属银，从而使基底膜显示出黑色的着色。该法是肾穿刺活检病理诊断中是常规的特殊染色方法之一。它不仅能清晰显示肾组织中小球的数目，勾画出小球基底膜断裂、增生、折叠等形态改变，还能准确地显示免疫复合物在基底膜沉积位置，还能显示出肾小管萎缩状态、血管壁增厚与否及炎细胞浸润的严重程度等。因此，六胺银马松套染法对于肾脏病理临床诊断、分类和治疗提供了重要的依据，是肾脏病理诊断必不可少且难度最大的特殊染色方法。

目前，国内外的专业人士想尽了许多办法改进常用的基底膜银染色方法，包括Gomori法、Jone’s法、矢岛（Jenos）改良法、Gordon-Sweet法、Janes法等，企图取得更好的基底膜染色质量，但是依然存在以下种种问题：银染色中组织容易出现过染；时间、温度较难控制；背景颜色过高；套染别的染色色彩不够鲜艳等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改进的六胺银马松套染法，该方法中的银染试剂调配合理、染色效果好、时间短、性能稳定、套染染色色泽鲜艳，能够更好地为肾脏病理临床诊断、分类和治疗提供重要的依据。

本发明所述的一种改进的六胺银马松套染法，包括以下步骤：

（1）配制银染试剂，包括：

银染A液：蒸馏水230ml，5%硼砂45ml，4%硼酸4ml，15%六次甲基四胺60ml；银染B液：蒸馏水100ml，10g硝酸银；

5%硼砂：蒸馏水100ml，5g硼砂；

15%六次甲基四胺：蒸馏水100ml，15g六次甲基四胺；

4%硼酸：蒸馏水100ml，4g硼酸；

1.5%高碘酸：蒸馏水100ml，1.5g高碘酸；

丽春红染液：丽春红S0.7g，酸性品红0.3g，蒸馏水100ml，冰醋酸1ml；

1%苯胺蓝：苯胺蓝1g，冰醋酸1ml，蒸馏水100ml；

1%磷钼酸：磷钼酸1g，蒸馏水100ml；

（2）将组织切片用Bouin液固定，脱蜡，入水；

（3）切片浸入2.5%碘酒3分钟，蒸馏水洗3次；

（4）切片浸入5%硫代硫酸钠5分钟，蒸馏水洗3次；

（5）切片浸入1.5%高碘酸15分钟，氧化温度在20-25℃之间，蒸馏水洗3次。

（6）取银染A液30ml过滤并于70℃预热25分钟；

（7）将银染B液0.82ml加入预热好的银染A液中，混匀放入切片，70℃浸染15分钟后每5分钟镜下观察基底膜的着色情况，直至基底膜显示清晰的黑色后终止；蒸馏水洗3次；

（8）3%硫代硫酸钠浸泡切片15秒，水洗3分钟×3次；

（9）苏木素浸染15分钟，水洗；

（10）盐酸酒精分化，水洗返蓝；

（11）丽春红染液浸染12分钟，水洗1分钟×3次；

（12）1%磷钼酸浸泡切片1分钟，直接入1%苯胺蓝浸染4分钟；

（13）切片经梯度酒精脱水后入二甲苯透明，中性树胶封片。

根据本发明所述的六胺银马松套染法的进一步特征，所述的蒸馏水为电子级超纯水或双蒸分析实验室一级用水。

本发明所述的改进的六胺银马松套染法，对于染液的试剂浓度比例关系、染色时间、染色温度及套染染液的配比、步骤进行了改良调整，摸索出一种试剂调配合理、染色效果好且时间短、性能稳定、套染色泽鲜艳的方法，并在实验中取得了比现有方法更好的效果，改变了银染色中组织容易出现过染，时间、温度较难控制，背景颜色过高及套染别的染色色彩不够鲜艳等问题。

染色过程中金属银的还原是关键步骤，往往决定着染色的成败。胺银染色试剂中六次甲基四胺、硼酸、硼砂、硝酸银的配比适当，能防止产生过量的胺银黑颗粒污染组织而影响组织病变的观察。本发明是在不断的摸索中调配出来胺银染色试剂中六次甲基四胺、硼酸、硼砂、硝酸银的最佳配比，较Gomori法、Jone’s法、矢岛（Jenos）改良法、Gordon-Sweet法、Janes法等国内外常用的银染法减少了硝酸银的含量。染液中银离子的含量降低，减少了胺银颗粒污染组织的可能。但是染液中银离子减少使基底膜着色需要更长的时间，长时间的胺银反应容易使染液变浑浊并出现黑色的反光膜，氯化金调色时很难清除掉切片上黑色的反光膜，致使切片背景较脏，不利于染色结果的判断。因此，本发明在调整配比的同时，调整了染色的温度和染色的时间，使染液未形成浑浊和反光膜前，基底膜的染色就已经完成，不需常规银染中的氯化金调色去除多余的银染颗粒。这种配比减少了肾组织棕黑色的背景着色，更有助于后面的双重染色。

在染色的过程中肾组织经酸氧化后，使基底膜内的粘多糖暴露出醛基，醛基把六胺银还原为黑褐色的金属银而使肾小球的基底膜着色的。组织氧化是染色成功的前提。氧化一定要充分才能使醛基暴露完全，若氧化不够完全，切片银着色较浅，影响结果判断。本发明在氧化的过程提高了高碘酸的含量，延长了高碘酸的反应时间，充分暴露了基底膜内的醛基，提高了染液的使用次数和有效期。

在银染的过程中除了试剂的配方、反应的温度和时间以外，本发明使用的器皿应预先用浓硫酸浸泡并冲洗干净。染色过程中，染液不能接触金属物质（如镊子）等影响染色外在因素。关于配染液的水，本发明对比了实验室常用的几种配试剂的水，包括：单蒸水、双蒸水、通过水处理系统处理过的分析实验室一级用水和电子级超纯水。实验表明，使用电子级超纯水和分析实验室一级用水双蒸处理后配银染试剂背景最低，染色质量最好。银染液用合适的实验用水配制并按上述步骤、时间和温度操作可以有效的防止银染过染，时间、温度较难控制，背景颜色过高等难以解决的问题。

在肾组织六胺银染色之后常常进行Masson双重染色，其目的是为了在同一张切片中显示肾小球内的免疫复合物的沉积的部位、形态和病变范围以及肾间质纤维化的程度等。由于常规的六胺银染色已将组织中许多嗜银位点染成黑色，这会导致套染马松三色时肾小球内免疫复合物显色颜色浅淡，基底膜、系膜、胶原纤维及胞质、红细胞颜色对比不鲜艳。本发明改变了经典马松染色的配方，将混合红染液换成了丽春红S与酸性品红的配比染液，从而去除了混合红中的亮绿。并且摸索出了合适的染色时间，提升组织中的红细胞、细胞质及免疫复合物的鲜艳程度并且提高了间质中蓝色胶原纤维的对比。

附图说明

图1为本发明所述的改进的六胺银马松套染法的肾组织切片染色图。

图2为美国华盛顿大学医学中心病理科所采用的Jones-HE银染色法的肾组织切片染色图（该图片来自广州金域医学检验中心耿舰教授提供）。

图3为宝鸡市中心医院采用Gomori-masson银染法的肾组织切片染色图（马宁,蔡媛.肾穿刺标本六胺银G马松三色套染法介绍[J].2012,19(10):391）。

图4为广东省人民医院病理科采用矢岛（Jenos）改良银染法的肾组织切片染色图（骆新兰,蔡秀,王朝杰,等.肾小球基膜六胺银染色的比较[J].临床与实验病理学杂志,200520(4):493-494.）。

图5为国内各大医院及医学检验机构肾组织六胺银染色图。图片来源于患者在南方医科大学南方医院（即本申请人）就诊时提供的病史资料，可根据患者的病理号到原医院查找到患者的六胺银染色的病理切片，从患者带来的病理切片中看出各大医院的染色结果。图中，A、B是来自于广州中山医科大学第一附属医院病理科（患者病理号：K10590）；C、D、E是来自于广州金域医学检验中心（患者病理号：KB1312967、KB1401240）；F是来自于江西省儿童医院病理科（患者病理号：43174）。

图6为不同的实验用水在相同条件下的胺银反应对比。据图经单因素方差分析，图中电子级超纯水及双蒸分析实验室一级用水分别与一级用水、单蒸水相比P＜0.05，有统计学意义。

具体实施方式

本发明在这里可通过以下的具体实施例的详细说明来得以更好的理解。需要明确的是，这些具体实施例仅是用作示例，而不是对在所附的权利要求所定义的本发明的任何形式的限制。除非在这里另外特别定义，所有术语都采用它们的最宽的可能的解释，包括从本说明书中暗示的含义，以及本领域熟练技术人员所能知晓的含义和/或在字典、论文等重所定义的含义。

以下是本文所采用的部分术语在本领域的解释。

脱蜡：石蜡切片染色必须用二甲苯脱去切片中的石蜡，作用是二甲苯可以溶解石蜡，以使染料易于进入细胞和组织。

分化：在苏木精染色之后，用水洗去未结合的染液，但在细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料必须用1%盐酸酒精脱去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明，把这个过程称为分化。

返蓝：分化之后苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下则处于蓝色离子状态，呈蓝色。所以分化后用水洗除去酸而终止分化，在用弱碱性水是苏木精染上的细胞核变呈蓝色，这一过程称蓝化或返蓝。

脱水：切片染色结束后将切片由低浓度酒精过度到高浓度的酒精过度的过程，其作用是将组织中的水分置换成酒精，以便于二甲苯进入组织细胞进行透明。

透明：石蜡组织切片染色经过脱水处理后必须经二甲苯处理，使切片透明，才能用树胶封片。

实施例1：本发明所述的六胺银马松套染法

1.试剂配方：

1.1银染配方：

银染A液：蒸馏水230ml，5%硼砂45ml，4%硼酸4ml，15%六次甲基四胺60ml。该液体放于4℃冰箱保存，有效期为2个月。2个月后需重新配制。

银染B液：蒸馏水100ml，10g硝酸银。该液体需避光于4℃冰箱保存，如发现液体有黑色沉淀，需重新配制。

1.2.15%硼砂：蒸馏水100ml，5g硼砂。该液体室温，避光保存。

1.2.215%六次甲基四胺：蒸馏水100ml，15g六次甲基四胺，该液体放于4℃冰箱保存，出现沉淀需重新配制。

1.2.34%硼酸：蒸馏水100ml，4g硼酸。该液体室温保存。

1.2.41.5%高碘酸：蒸馏水100ml，1.5g高碘酸。该液体放于4℃冰箱保存，使用时需防止液体稀释，染100张色切片后该液体需重新配制。

1.2.5丽春红染液：丽春红S0.7g，酸性品红0.3g，蒸馏水100ml，冰醋酸1ml。室温保存。

1.2.61%苯胺蓝：苯胺蓝1g，冰醋酸1ml，蒸馏水100ml。室温保存。

1.2.71%磷钼酸：磷钼酸1g，蒸馏水100ml。室温保存。

2.步骤

2.1Bouin液固定的组织切片，脱蜡，入水。（预热第5步，取银染A液30ml过滤并于70℃预热25分钟）。

2.2切片浸入2.5%碘酒3分钟，蒸馏水洗3次。

2.3切片入5%硫代硫酸钠浸泡5分钟，蒸馏水洗3次。

2.41.5%高碘酸浸泡15分钟（氧化温度在20-25℃之间），蒸馏水洗3次。

2.5取出预热好的银染A液30ml（见2.1）。

2.6将银染B液0.82ml加入预热好的银染A液中，混匀放入切片，70℃浸染，15分钟后每5分钟镜下观察基底膜的着色情况，直至基底膜显示清晰的黑色后终止；蒸馏水洗3次；

2.7切片入3%硫代硫酸钠浸泡15秒，水洗3分钟×3次。

2.8苏木素浸染15分钟，水洗。

2.9盐酸酒精分化，水洗返蓝。

2.10丽春红染液浸染12分钟，水洗1分钟×3次。

2.111%磷钼酸浸泡1分钟直接入1%苯胺蓝浸染4分钟。不水洗直接脱水。

2.12切片经梯度酒精脱水后入二甲苯透明，中性树胶封片。

3.注意事项

3.1染色时请用立式染缸浸染，除银染A、B液外其他液体均可重复使用。染缸、切片均须泡酸、蒸馏水冲洗数次方可备用。

3.2由于银染着色的不可逆性，在染至15分钟左右时要开始镜下进行性观察染色效果，以肾小球基底膜清晰着色为好。银染液不可重复使用，快到有效期的染液请缩短染色时间。

3.3第7步3%硫代硫酸钠时间不可过长，否则容易掉片。

3.4在上述实验步骤中，采用的蒸馏水为电子级超纯水或双蒸分析实验室一级用水。

4.结果

基底膜为黑色，胶原纤维蓝色，胞质、肌纤维、红细胞、免疫复合物红色，胞核蓝褐色。

实施例2：本发明所述的改进的六胺银马松套染法与国内外各大医院及医学检验机构肾组织六胺银染色的比较

图1为本发明所述的改进的六胺银马松套染法的肾组织切片染色图。如图1所示改进的六胺银马松套染法对肾组织中的肾小球基底膜、肾小管基底膜、血管基底膜等部位黑色线条勾勒的清晰明显，基底膜外的免疫复合物及肾小管细胞着色鲜艳、染色的背景干净，色彩鲜明。

从染色效果看，该染色法优于Jones-HE银染色法（图2）、Gomori-masson银染法（图3）、矢岛（Jenos）改良银染法（图4）；并且优于曾经来我院（南方医科大学南方医院）会诊、读片、展示的国内各大医院及医学检验机构所做的肾组织六胺银染色（图5）。

实施例3：不同的实验用水在相同条件下的胺银反应对比

选取单蒸水、双蒸水、通过水处理系统处理过的分析实验室一级用水、分析实验室一级用水后双蒸处理水、电子级超纯水各30份样本，分别加入本发明的银染A液和银染B液，于烤箱70℃进行胺银反应1.5小时。将各样本置于752型紫外分光光度计测定，波长设定为680nm。取30例测量结果的均值，用电子级超纯水银染试剂液调0，对比结果经统计学分析后如图6所示，可见使用电子级超纯水和双蒸分析实验室一级用水配银染试剂吸光值最低，浑浊度最低，更适合肾组织六胺银染色。